青海草原毛虫IR基因的鉴定及组织表达分析

刘占玲 寇桂香 南彦斌 王克鑫 周渊涛

摘要：本研究利用生物信息學分析及qRT-PCR技术，对GqinIRs基因进行鉴定及表达谱分析。本研究共鉴定出12个GqinIRs基因，生物信息学分析发现青海草原毛虫IRs属于两性蛋白，除GqinIR7、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR75a、GqinIR76b都具有信号肽，具有2～4个跨膜结构域，二三级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成；系统进化表明青海草原毛虫IR与东方黏虫和疆夜蛾亲缘关系较近。基因表达谱分析表明，鉴定的青海草原毛虫12个IR基因在雌雄不同组织体现不同的表达水平（P<0.05）。本研究为进一步研究青海草原毛虫离子型受体蛋白对外界气味分子的识别及反应机制提供重要依据，并且为深入研究青海草原毛虫嗅觉机制奠定基础。

关键词：青海草原毛虫；离子型受体；生物信息学分析；表达谱分析

中图分类号：S968.1    文献标识码：A     文章编号：1007-0435（2024）05-1392-09

Identification and Expression Profiling of Ionotropic receptors Gene in

Gynaephora qinghaiensis （Lepidoptera：Lymantriidae）

LIU Zhan-ling， KOU Gui-xiang， NAN Yan-bin， WANG Ke-xing， ZHOU Yuan-tao*

（College of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：In this study，based on the transcriptome data of Gynaephora qinghaiensis，bioinformatics methods and qRT-PCR technology were used to identify and analyze the expression profiling of GqinIRs genes. In this study，a total of 12 GqinIRs genes were identified，and bioinformatics analysis showed that the IRs of Gynaephora qinghaiensis belonged to amphoteric proteins，except for GqinIR7，GqinIR8a，GqinIR10a，GqinIR75a，and GqinIR76b，all of them had signal peptides and 2～4 transmembrane domains，and the second- and third-order structures were mainly composed of α helix and random coils. Phylogenetic results showed that the IR of Gynaephora qinghaiensis was closely related to Oriental armyworm and Spodoptera exigua. Gene expression profile analysis showed that the relative expression levels of the 12 IR genes in different tissues of Gynaephora qinghaiensis were different，and the GqinIR6 gene was basically not expressed in the antennae of the male，while the remaining 11 GqinIRs genes were expressed in the antennae of the male，while their expression levels were different （P<0.05）. This study provides an important basis for further study of the recognition and response mechanism of ionotype receptor proteins of Gynaephora qinghaiensis to external odor molecules，and lays a foundation for further research on the olfactory mechanism of Gynaephora qinghaiensis.

Key words：Gynaephora qinghaiensis;Ionotropic receptors;Bioinformatics analysis;Expression profile analysis

离子型受体（Ionotropic receptors，IRs）是Benton等［1］首次在果蝇（Drosophila）中鉴定出来的一种新的化学感觉受体，在与配体结合的离子通道过程中发挥重要作用，其含有一个胞外N端、离子型区和2个裂片［2］，2009年，Benton等［3］首次在黑腹果蝇中鉴定出了66个离子型受体［3］。随后，在其他昆虫体内陆续鉴定出离子型受体，例如在苹果蠹蛾中鉴定出15个离子型受体基因［4］，海灰翅夜蛾鉴定出12个离子型受体基因［5］，在棉铃虫中发现了19个离子型受体基因等［6］。根据基因生物信息学和功能分析，IRs基因家族可被分为三个亚家族：分化离子型受体（Divergent IRs）、嗅觉离子型受体（Olfactory IRs）和共表达离子型受体（Co-receptor IRs）。嗅觉离子型受体亚家族中大多数在雌雄不同组织中不表达或微量表达，但通常在触角中特异表达，因此该亚家族也被称为触角IRs（antennal IRs），序列分析结果发现多种昆虫中都有触角IRs的同源基因，基因表达谱分析发现其在触角中特异表达，表明这些基因在进化上比较保守；分化IRs在触角中几乎不表达，一些研究表明，分化IRs可能与味觉有关［7］；共表达IRs（IR25a和IR8a）广泛存在于触角腔锥形感器的神经元中，与嗅觉IRs共表达［8］。早期研究已证实，昆虫IR可作为酸、胺等挥发性物质的受体，并参与包括温度、湿度感受和味觉感受等嗅觉以外的感受［9］。IRs参与嗅觉信号转导途径的功能还需要进一步研究，目前，主要利用qRT-PCR技术研究基因的表达与定位［10］，

青海草原毛虫（Gynaephora qinghaiensis）属鳞翅目（Lepidoptera）毒蛾科（Lymantriidae）草原毛虫属（Gynaephora），俗称红头黑毛虫［11］，目前，研究发现在亚洲分布种类较多，有13种，其中8种分布在中国且都是青藏高原特有种［12］。青海主要分布在海晏、天俊、泽库、玛多、治多、杂多、祁连和门源等地方［13］。草原毛虫幼虫以头壳宽度为依据可分为7个龄期［14］，雌雄成虫形态具有较大差异，雌成虫的胸足、翅以及触角退化［15］。青海草原毛虫是高寒草甸常见草食性害虫［16］，幼虫对人畜安全、草地生态结构造成影响［17］，为害时虫口密度大，发生面积广，危害程度严重［18］。此外，有研究报道青海草原毛虫对强紫外辐射、缺氧以及严寒等极端恶劣环境有较强的适应能力、繁殖能力强，且幼虫背部具有毒腺，可导致家畜和人过敏，因而防治困难［19］。目前，已有一些有关鳞翅目昆虫离子型受体基因的研究报道［20］，未见对青海草原毛虫离子型受体基因的研究。嗅觉系统在介导昆虫行为过程中起主导作用，昆虫的IRs参与嗅觉信号转导途径，可为害虫的绿色防治提供新思路［21］。本研究利用青海草原毛虫转录组数据，筛选并基于同源序列命名青海草原毛虫IRs基因，通过生物信息学方法分析GqinIRs基因的理化性质、二三级结构以及系统发育情况；并基于实时荧光定量PCR技术分析GqinIRs基因在雌雄成虫不同组织中的表达情况，为进一步研究青海草原毛虫离子型受体基因功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

2023年6月在青海省海北州海晏县采集青海草原毛虫幼虫，于实验室内饲养幼虫至羽化出雌雄成虫，解剖雌雄各30只成虫并收集雌雄成虫的头、胸、腹以及雄虫触角（雌成虫触角退化），共7个样品，每个样品取3个生物学重复，每个生物学重复包含10只成虫组织，标记样品并立即用液氮速冻保存至-80℃冰箱中备用。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

提取各样品（7个组织）总RNA（Trizol法）并利用分光光度计分别检测各组织RNA纯度，利用反转录试剂盒（M-MLV）（Beijing Solarbio Science）将RNA纯度在合格范围（OD260 nm/OD280 nm为1.8～2.2）内的样品合成cDNA并保存于-20℃冰箱备用。

1.3 设计并合成引物

从青海草原毛虫雌雄成虫转录组数据库筛选获得GqinIRs基因序列，采用Oligo7软件设计引物并委托北京睿博兴科生物技术有限公司合成，内参基因（RPS15）引物来自于兰州大学昆虫实验室。

1.4 GqinIRs序列获取

在青海草原毛虫转录组数据库中，进行查找（以“IR”和“Ionotropic”为关键词）并筛选出候选离子型受体基因序列，在NCBI网站进行BLASTn比对（设定相似性大于60%）得到相似物种，采用在线网站ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）对筛选出的GqinIRs序列进行预测得到ORF完整的氨基酸和核苷酸序列。

1.5 GqinIRs的生物信息学分析

采用在线网站ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析GqinIRs生物信息学，如相对分子量、等电点、正负残基数、脂肪系数、不稳定系数，总平均疏水性等；运用Signalp4.1Server（http：//cbs.dtu.dk/services/Signalp/）预测GqinIRs信号肽；采用在线网站TMHMM2.0对GqinIRs进行跨膜结构区域预测；采用在线网站SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/secpred＿sopma.pl）对GqinIRs二级结构进行预测；利用SWISS MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）对GqinIRs三级结构进行预测0。使用MEGA7.0构建系统发育树，包括来自青海草原毛虫12条IRs，疆夜蛾（Peridroma saucia）10条IRs，棉铃虫（Melitaea cinxia）9条IRs，烟青虫（Lobesia botrana）6条IRs，草地贪夜蛾（Trichoplusia ni）、斜纹夜蛾（Bicyclus anynana）、东方黏虫（Vanessa cardui）各2条IRs，网蛱蝶（Helicoverpa armigera）、欧洲葡萄蛾（Helicoverpa assulta）、粉蚊夜蛾（Spodoptera frugiperda）、偏瞳蔽眼蝶（Manduca sexta）、小红蛱蝶（Achelura yunnanensis）、烟草天蛾（Spodoptera litura）、云南锦斑蛾（Mythimna separata）、黃野螟（Heortia vitessoides）各1条IR。采用NJ法，用JTT模型，方法采用NNI（nearest-neighbor-interchang），自展支持率（bootstrap）1 000次重复。

1.6 GqinIRs的qPCR检测

以合成的cDNA样品（雄雄成虫的头、胸、腹以及雄成虫触角）为模板，7个样品各含3次生物学重复，每次生物学重复取3次技术重复。扩增体系（20 μL）：正反引物各0.8 μL，Master Mix 10 μL，ddH2O 7.4 μL和cDNA模板1 μL。在实时荧光定量PCR仪（ABI7500型）中进行反应，PCR扩增条件：95℃预变性1 min、95℃变性15 s、退火（退火温度60℃）15 s、72℃ 45 s，40次循环。每个基因在雌雄成虫的各组织中以雄成虫触角中的表达量为对照。

1.7 数据分析

GqinIRs基因在不同组织中的相对表达量以在雄虫触角中的表达量作为对照用2-ΔΔCt值法计算，数据利用SPSS软件进行单因素方差分析（ANOVA）和显著性差异检验（LDS），同时使用软件Graphpad prism进行T检验（P<0.05）并绘制组织表达谱。雌雄间表达量差异利用Duncan氏新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 青海草原毛虫IRs的生物信息学分析

在转录组数据库中共筛选出青海草原毛虫12个IRs（表2）。基于来自疆夜蛾（P. saucia）、东方黏虫（M. separata）、棉铃虫（H. armigera）同源序列，命名为GqinIR1、GqinIR2、GqinIR3、GqinIR4、GqinIR5、GqinIRIR6、GqinIR7、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR25a、GqinIR75a、GqinIR76b。经过ORFfinder与NCBI Blastp验证，GqinIRs核苷酸长度为564～3 159 bp。采用在线网站SignaIP4.1预测其信号肽，结果表明青海草原毛虫12个GqinIRs中7个GqinIRs具有16-19个氨基酸的信号肽；采用在线网站TMHMM2.0对GqinIRs进行跨膜结构区域预测，结果表明GqinIR10a、GqinIR75a具有2個跨膜结构域，GqinIRIR4、GqinIR7具有4个跨膜结构域，其余GqinIR均具有3个跨膜结构域，这与该基因的典型结构特征相吻合。将GqinIRs与其他昆虫序列进行相似性比较，GqinIR1基因与亚洲玉米螟（O. furnacalis）基因序列（GenBank登录号为BAR64795.1）、GqinIR7基因与疆夜蛾（P. saucia）基因序列（GenBank登录号为QHB15340.1）、GqinIR6基因与疆夜蛾（P. saucia）基因序列（GenBank登录号为QHB15336.1）、GqinIR25a基因与疆夜蛾（P. saucia）基因序列（GenBank登录号为QHB15318.1）相似度分别为97.02%，96.03%，95.57%，90.79%，相似度均为90%以上，其余GqinIRs基因与其他鳞翅目昆虫物种相似性均高于60%，表明GqinIRs与这些鳞翅目昆虫序列可能同源。

2.2 青海草原毛虫IRs理化性质分析

青海草原毛虫离子型受体蛋白理化性质预测结果表明：氨基酸长度在319～1 052 aa之间，相对分子量在35～116kD之间。脂肪系数较高，12个IRs均为热稳定性蛋白。GqinIR2、GqinIR3、GqinIR4、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR25a等电点位于4～6之间（偏酸性蛋白）；GqinIR6、GqinIR7、GqinIR75a、GqinIR76b等电点位于8～10之间（偏碱性蛋白）；GqinIR1、GqinIR5等电点在6～7之间（弱酸性蛋白）。GqinIR正电荷残基数目在22～117之间，负电荷残基数目在34～151之间。GqinIR1-7，GqinIR76b不稳定系数大于40（蛋白性质不稳定）。GqinIRs的总平均疏水性都介于-0.5～0.5之间（两性蛋白）［22］。

2.3 青海草原毛虫IRs的二级、三级结构预测分析

GqinIRs二级结构预测发现青海草原毛虫IRs主要由α螺旋和无规则卷曲构成。除GqinIR7和GqinIR76b二级结构主要由无规则卷曲构成，分别占主要组成部分的42.02%和42.39%，其余GqinIRs二级结构α螺旋是主要组成部分，且所占比例均在40%以上，其中GqinIR75a α螺旋含量最高，为47.29%，12个GqinIRs的二级结构中β折叠和延伸链所占比例较少。三级结构预测发现α螺旋是GqinIRs的三级结构主要组成部分，并维持三级结构稳定。

2.4 青海草原毛虫IRs的系统进化分析

利用12个GqinIRs和筛选出的其他14种鳞翅目昆虫的39个IR氨基酸序列用NJ法构建系统发育树。结果显示所有的GqinIRs都与鳞翅目昆虫IRs聚到一起，但在整个进化系统中分布比较分散（图3），其中GqinIR8a与PsauIR8a、HarmIR8a、SlitIR8a聚在同一进化枝；GqinIR10a与MsepIR10a在同一小组，置信值为95；GqinIR25a与其他昆虫（Psau、Hass、Slit）的IR25a聚在一起；GqinIR75a与HarmIR75a、SfruIR75a聚在同一进化枝；GqinIR76b与HvitIR76b、PsauIR76b、HassIR76b聚在同一进化枝；GqinIR10a与MsepIR10a、GqinIR6与PsauIR3聚在同一小组，置信值为89、GqinIR1与PsauIR4在同一小组，因此推测青海草原毛虫IRs与疆夜蛾（P. saucia）以及东方黏虫（M.separata）亲缘关系最近。

2.5 青海草原毛虫IR基因的组织表达谱分析

本研究通过RT-qPCR技术研究GqinIRs基因在青海草原毛虫不同组织中的表达水平（以雄虫触角作为阳性对照），结果发现，GqinIRs基因在雌雄不同组织中的表达量呈现不同水平，除GqinIR6基因之外，其余11个GqinIRs基因在雄虫触角中均有表达，其中：GqinIR3、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR75a基因在雄成虫触角显著表达，其表达量显著高于其他组织（P<0.05），推测这些基因为触角IRs；GqinIR1、GqinIR2、GqinIR7、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR25a等基因在雄虫头部显著表达，其表达量显著高于雌虫头部，GqinIR4、GqinIR5基因在雌虫头部显著表达，其相对表达量显著高于雄虫头部，而GqinIR3、GqinIR75a、GqinIR76b基因在雌雄成虫头部的表达无显著差异（P<0.05）。此外，GqinIR1、GqinIR2、GqinIR4、GqinIR8a、GqinIR75a基因在雌雄成虫胸部几乎不表达或微量表达，而GqinIR3、GqinIR5、GqinIR7、GqinIR10a、GqinIR25a、GqinIR76b基因在雌雄成虫的胸部表达存在显著差异，其中GqinIR3、GqinIR5呈现雌性偏好表达模式，GqinIR7、GqinIR10a、GqinIR25a、GqinIR76b则呈现雄性偏好模式（P<0.05）；GqinIR1、GqinIR3、GqinIR5、GqinIR10a基因在雌雄成虫腹部几乎不表达或微量表达，而GqinIR2、GqinIR4、GqinIR7、GqinIR8a、GqinIR25a、GqinIR75a、GqinIR76b基因在雌雄成虫腹部的表达存在显著差异，其中GqinIR8a、GqinIR25a基因呈现雌性偏好表达模式，而GqinIR2、GqinIR4、GqinIR7、GqinIR75a、GqinIR76b基因呈现雄性偏好表达模式（P<0.05）（图4）。

3 讨论

本研究共筛选并鉴定出12个GqinIRs基因，其数目多于棉铃虫（6个IRs）［23］，少于小菜蛾（16个IRs）［20］、斜纹夜蛾（45个IRs）［24］、茶古蛾（25个IRs）［25］。青海草原毛虫GqinIR1-6都具有信号肽。跨膜结构区域预测发现，GqinIRs均具有2-4个跨膜结构域，这与小菜蛾［20］、稻飞虱［26］IRs预测结果一致。二三级结构预测显示，GqinIRs二、三级结构主要由α螺旋以及无规则卷曲构成，并维持GqinIRs结构稳定，因为无规则卷曲空间结构易于发生改变，而α螺旋和β折叠空间结构不易发生改变［27］。GqinIRs与其他昆虫序列相似性比较及系统发育分析表明GqinIR1～GqinIR7与疆夜蛾（P. saucia）、草地贪夜蛾（S. frugiperda）等蛾类相似度在67.26～97.02%之间，同时系统进化分析发现7个GqinIRs也与这几个物种聚在同一进化枝；GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR25a、GqinIR75a、GqinIR76b与疆夜蛾（P. saucia）、草地贪夜蛾（S. frugiperda）、斜紋夜蛾（S. litura）、东方黏虫（M. separata）等物种的IR8a、IR10a、IR25a、IR75a、IR76b分别聚集在同一进化小枝，这些结果说明符合青海草原毛虫IRs命名规则。GqinIRs与其他鳞翅目昆虫物种相似性均高于60%，推测GqinIRs与这些鳞翅目昆虫序列可能同源。GqinIR8a与GqinIR25a聚在同一进化枝上，推测GqinIR8a与GqinIR25a为GqinIRs共受体［28］；GqinIR10a与MsepIR10a、GqinIR6与PsauIR3、GqinIR1与PsauIR4在同一小组，因此推测青海草原毛虫IRs与疆夜蛾（P. saucia）以及东方黏虫（M. separata）亲缘关系最近；大部分GqinIRs与疆夜蛾（P. saucia）、棉铃虫（H.armigera）、烟青虫（H. assulta）聚在同一进化枝，表明这些物种的IRs基因可能拥有共同祖先。

利用qRT-PCR技术分析GqinIRs在青海草原毛虫各个组织中的表达情况，进而推测GqinIRs功能，结果表明：GqinIRs基因在雌雄不同组织中呈现不同表达水平（P<0.05），除GqinIR6基因之外，其余11个在雄虫触角中均有表达，推测这些IRs基因在雄虫定位雌虫，求偶和交配过程中发挥不同的作用［23］。GqinIR3、GqinIR75a、GqinIR76b基因在雌雄成虫头部的表达无显著差异，这与孔畅仪对小菜蛾的研究结果一致［20］，推测这些基因在功能上较为保守。青海草原毛虫中GqinIR3、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR75a基因在雄成虫触角的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05），从黑腹果蝇检测出66个IRs基因中16个特异性表达于触角［4］；从斜纹夜蛾（S. litura）触角检测出了12个IRs、苹果蠹蛾（C. pomonella）触角检测出15个IRs、棉铃虫（H.armigera）触角中也检测出了12个IRs基因［4］，推测这些IR为触角IR。在触角特异表达的IRs可能对酸类和胺类等物质的感受中发挥重要作用［9］，并且具有影响交配行为、适应性进化、味觉识别及生物钟调节等功能［29］，推测在青海草原毛虫触角特异表达的IRs同样能够感受环境中丁酸和丙酸等酸类气味物质，并且具有影响交配行为、适应性进化、味觉识别及生物钟调节的功能［30-31］。GqinIR1、GqinIR5在雌雄头部的表达量较高，可能这些基因与昆虫味觉、嗅觉以及温湿度的感受有关［23］。昆虫利用背侧器官中高度敏感的温度感觉细胞感受环境中的温度变化，在果蝇幼虫的温度感觉细胞中检测到的离子型受体能够感受寒冷的环境从而避免极端温度的伤害［32］。本研究发现GqinIR7、GqinIR76b在雄虫胸部中显著表达，推测这两个基因可能借助背部的温度感觉细胞在青海草原毛虫感知外界温度变化中发挥重要作用［32］。IRs通过一个激活的途径参与促进强烈的嗅觉行为［33］。苯乙酸和苯乙醛等挥发性气味物质可以激活IR受体神经元，进而影响求偶和交配的行为［34-35］，GqinIR2、GqinIR4、GqinIR25a在腹部的表达量较高，推测这些IR的受体神经元能通过作为环境催情剂的苯乙醛激活进而在雄虫求偶中发挥重要作用［33］。基于青海草原毛虫IRs基因在不同组织中表述情况所推测的IRs功能，表明离子型受体在青海草原毛虫的生殖发育和嗅觉机制中具有重要作用。

4 结论

本研究利用生物信息学方法及qRT-PCR技术，对GqinIRs基因进行鉴定及表达谱分析，鉴定的青海草原毛虫IRs与疆夜蛾（P. saucia）以及东方黏虫（M. separata）亲缘关系最近，与草地贪夜蛾（S. frugiperda）、斜纹夜蛾（S. litura）、棉铃虫（H.armigera）烟青虫（H. assulta）等参与建树的鳞翅目昆虫的IRs基因可能拥有共同祖先。青海草原毛虫12个IRs基因在雌雄不同组织体现不同的表达水平（P<0.05）。本研究通过对GqinIRs表达谱进行分析，推测IRs功能，为进一步研究青海草原毛虫离子型受体蛋白对外界气味分子的识别及反应机制提供重要依据，同时为深入研究青海草原毛虫嗅觉机制奠定基础。

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（責任编辑 彭露茜）

收稿日期：2023-12-20；修回日期：2024-01-22

基金项目：青海省科技厅青年基金项目；草原毛虫嗅觉感受分子机理的研究（2022-ZJ-949Q）资助

作者简介：

刘占玲（2000-），女，汉族，青海西宁人，硕士研究生，主要从事昆虫化学生态学研究，E-mail： liu20000607ling@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail： ZhouYT@qhu.edu.cn