滇龙胆乙酰CoA转移酶基因的克隆与表达分析

张晓东+李彩霞+王连春+王元忠

摘要：根据滇龙胆转录组乙酰CoA酰基转移酶基因GrAACT序列设计引物，使用逆转录PCR（RT-PCR）技术从滇龙胆幼叶扩增该基因，并进行序列分析、原核表达和组织特异性分析。结果表明：GrAACT基因（登录号KJ917163）开放阅读框长 1 215 bp，编码404个氨基酸；GrAACT蛋白相对分子质量41.41 ku，pI值为6.25，属于AACT蛋白家族成员，无信号肽，为疏水稳定蛋白，主要由α-螺旋、无规则卷曲构成；GrAACT蛋白具有AACT蛋白保守结构域：硫解酶N端结构域（第12～272位氨基酸）、硫解酶C端结构域（第282～402位氨基酸）、类硫解酶结构域（第13～403位氨基酸）；在硫解酶C端结构域中，包含硫解酶保守位点（第350～366位氨基酸）、硫解酶活性位点（第385～398位氨基酸）；滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白亲缘关系最近；GrAACT基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为6741 ku；组织特异性表达分析结果表明，GrAACT基因主要在茎、根中表达。

关键词：滇龙胆；乙酰CoA酰基转移酶；基因克隆；生物信息学分析；表达分析

中图分类号： S184；R282.71；Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0094-05

收稿日期：2015-05-27

基金项目：国家自然科学基金（编号：81260608）；国家科技支撑计划（编号：2011BAI13B02-04）；云南省教育厅科学研究基金重点项目（编号：2015Z171）。

作者简介：张晓东（1980—），男，河南新郑人，博士，副教授，从事植物代谢基因工程研究。E-mail：zxd95@126.com。

通信作者：王元忠，硕士，助理研究员，从事药用植物资源评价与利用的研究。E-mail：boletus@126.com。滇龙胆是传统中药龙胆的来源植物之一，也是云南省重要道地药材，主要分布于中国西南部，尤其是云南省山区地带；其根入药，用于治疗各种炎症、肝炎、风湿病和胆囊炎等[1]。目前，医用龙胆需求量每年递增约10%，而现有滇龙胆产量低、品质不高，且野生滇龙胆资源遭到人为大肆采挖[2]。为选育优质、高产、高抗新品种，2013年6月云南省已启动龙胆草航天育种工程[3]。从中医药现代化角度来看，滇龙胆主要药效成分为龙胆苦苷，要从根本上解决龙胆草药源问题并保护野生滇龙胆，除筛选新品种之外，还必须弄清龙胆苦苷的生物合成途径及其调控机理，为通过基因工程手段生产龙胆苦苷奠定基础。

龙胆苦苷为裂环烯醚萜类化合物，在植物中主要通过质体2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）、胞质甲羟戊酸（MVA）途径合成[4]。乙酰CoA酰基转移酶（又称乙酰乙酰CoA硫解酶，AACT，EC 2.3.1.9）是MVA途径中的第1个限速酶，能够催化2分子乙酰CoA形成1分子乙酰乙酰CoA[5]。目前，乙酰CoA酰基转移酶基因AACT已从拟南芥[5]、丹参[6]、胡萝卜[7]、白木香[8]、油茶[9]等许多植物中分离。AACT基因表达具有组织特异性，并被生物、非生物因素诱导。拟南芥中存在2个平行进化的同源基因，其中AtAACT1主要在维管系统中表达，AtAACT2则在根尖、幼叶、茎上部和花药中大量表达，二者存在功能冗余；AtAACT2的作用是为胞质定位、MVA起源的异戊烯萜类生物合成途径合成大量乙酰乙酰CoA前体[5]。在生物诱导剂（100 mg/mL酵母提取物）、非生物诱导剂（30 mmol/L Ag+）共同诱导下，丹参SmAACT基因在诱导后12 h的表达量达到最高值[10]。

目前，由于龙胆基因组资源极度匮乏[11]，导致龙胆苦苷生物合成途径并不清楚[3]。本研究根据笔者实验室滇龙胆转录组数据库中的GrAACT基因序列，设计特异性引物，通过逆转录PCR（RT-PCR）技术成功从滇龙胆幼叶中扩增到GrAACT基因，并进行序列分析、原核表达和组织表达特异性分析，以期为阐明滇龙胆龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

滇龙胆组培苗、盆栽苗均采自玉溪师范学院分子生物学实验室，经云南省农业科学院药用植物研究所金航研究员鉴定为滇龙胆（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl）。基因克隆所用材料为滇龙胆无菌苗幼叶，基因组织特异性表达分析所用材料为盆栽3年生滇龙胆的根、茎、叶，采样日期为2014年5月17日。

1.2方法

按照多糖植物组织提取试剂RNAiso（TaKaRa，大连）说明书提取滇龙胆幼叶总RNA；按照逆转录试剂盒（TaKaRa，大连）说明书合成cDNA。根据原核表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点和笔者所在实验室前期测序的滇龙胆转录组GrAACT基因序列，设计1对特异引物GrAACT BamHⅠ-F、GrAACT XhoⅠ-R（表1）。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：0.5 μL TransTaq Taq DNA Polymerase High Fidelity（2.5 U/μL，北京全式金生物技术有限公司），5 μL 10×TransTaq HiFi Buffer Ⅱ，4 μL dNTP（2.5 mmol/L，TaKaRa，大连），2 μL模板，各1 μL正反向引物（10 μmol/L），加dd H2O补足至50 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55.5 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，然后割胶，使用胶回收试剂盒（Qiagen，德国）对目的片段进行回收，将其连接到pMD19-T载体（TaKaRa，大连）。转化大肠杆菌DH5α（TaKaRa，大连）后进行蓝白斑筛选，挑取12个白斑摇菌；使用试剂盒提取质粒（北京百泰克生物技术有限公司），经酶切检测正确后进行测序[生工生物工程（上海）股份有限公司]，获得重组质粒pMD19-GrAACT。

1.2.1GrAACT基因的生物信息学分析用NCBI网站的BLAST程序进行序列比对，用Genetyx 6.1.8进行翻译，用DNAMAN 7进行多序列比对，用Clustal X2.1进行比对，然后用MEGA 6.0软件内置的NJ法构建系统进化树，设置Bootstrap=1 000；利用在线数据库（http：//molbiol. edu.ru/eng/scripts/01_11.html）进行稀有密码子分析。用ChloroP服务器v1.1进行叶绿体转运肽预测；用Interpro软件进行保守结构域预测；用ProtScalee软件进行疏水性分析；用PredictProtein对二级结构进行预测；用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）对三级结构进行预测；用Expasy中的TMHMM工具预测蛋白的跨膜螺旋区；用在线工具WOLF PSORT预测蛋白的亚细胞定位情况。

1.2.2GrAACT基因的荧光实时定量分析分别取3年生滇龙胆的根、茎、叶，提取总RNA，用DNase I处理除去基因组DNA。用反转录试剂盒（TaKaRa）合成第1链cDNA。以转录组中GrGAPDH基因（GenBank登录号KM061807）作为内参设计特异性引物（表1），PCR条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s。根据GrAACT基因开放阅读柜（ORF）序列设计特异性引物（表1），使用SuperReal PreMix Plus试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]进行qPCR，扩增条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s；每个反应重复3次。反应在ABI7000荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）上进行扩增，扩增曲线、溶解曲线、标准曲线由定量PCR仪软件自动生成。使用内参基因GrGAPDH表达校准后，计算根、茎、叶中GrAACT基因的相对表达量。采用比较CT值的“2-ΔΔCT”的方法进行定量数据的分析处理。

2结果与分析

2.1滇龙胆GrAACT基因的克隆

以滇龙胆幼叶cDNA为模板，使用表1中的基因特异性引物GrAACTBamHI-F、GrAACTBamHI-R扩增出约 1 200 bp 的片段，详见图1。通过TA克隆获得重组质粒 pMD19-GrAACT。

2.2GrAACT基因的生物信息学分析

2.2.1GrAACT基因的ORF分析和多序列比对分析利用Genetyx软件对GrAACT基因的ORF序列进行分析，结果显示：该基因（GenBank登录号KJ91716）长1 215 bp，编码404个氨基酸。利用GenBank数据库的BLASTp程序对GrAACT蛋白进行比对分析，结果表明：滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白的序列相似性最高（88.61%），与单子叶植物玉米ZmAACT蛋白的相似性（78.55%）稍低。利用DNAMAN 7将GrAACT蛋白序列与NCBI中相似性较高的部分序列进行多序列比对分析，结果表明：GrAACT蛋白与已知蛋白序列相比保守性较高（图2）。利用Mega 6.0将GrAACT氨基酸序列与NCBI中相似性较高的部分序列进行系统发育分析，结果显示：滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白处于同一进化支（图3），表明二者亲缘关系较近。

2.2.2GrAACT蛋白的理化特性分析使用ExPASy ProtParam tool对GrAACT蛋白进行分析，结果表明：GrAACT蛋白单体相对分子质量为41 410 u，pI值为6.25，这与丹参SmAACT蛋白[6]、油茶CoAACT蛋白[9]、拟南芥ATAACT2蛋白[5]类似；带正电氨基酸残基（Arg+Lys）数为36个，带负电氨基酸残基（Asp+Glu）数为38个，化学式为：C1812H2959N509O562S17；不稳定指数为27.92，属稳定蛋白；脂肪指数为9856，总平均疏水性（GRAVY）为0.178，为疏水蛋白（图4）。GrAACT蛋白含20种基本氨基酸，其中丙氨酸含量最高，为13.9%；其次是甘氨酸、缬氨酸，含量分别为11.9%、9.9%；色氨酸含量最低，为0.5%。

2.2.3GrAACT蛋白的二级结构、三级结构分析利用SSpro方法对GrAACT蛋白进行二级结构分析，结果表明：该蛋白二级结构中α-螺旋（H）占39.11%，无规则卷曲（C）占40.10%，延伸带（E）占20.79%。利用Swiss-Model Workspace的自动模式预测GrAACT蛋白的三级结构，结果见图5，该模型以人线粒体乙酰CoA酰基转移酶[2f2s.1.C]为模板，在第13—404位氨基酸处建模，序列相似度为52.73%。

2.2.4GrAACT蛋白保守结构域分析使用InterPro在线工具对GrAACT蛋白的保守结构域进行分析，结果表明：GrAACT

蛋白包含3个保守结构域，它们分别为硫解酶N端结构域（IPR020616，第12—272位氨基酸）、硫解酶C端结构域（IPR020617，第282—402位氨基酸）、类硫解酶结构域（IPR016039，第13—403位氨基酸）（图6）。在硫解酶C端结构域中，包含硫解酶保守位点（THIOLASE_2，第350—366位氨基酸）、硫解酶活性位点（THIOLASE_3，第385—398位氨基酸）。

2.2.5GrAACT蛋白信号肽分析利用ExPASy SignalP 4.1服务器分析GrAACT蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。利用TMHMM工具预测GrAACT蛋白的跨膜螺旋区，结果表明：GrAACT蛋白不含有跨膜区域（图7）。

2.2.6GrAACT蛋白亚细胞定位分析使用WoLF PSORT软件进行亚细胞定位分析，结果表明，GrAACT蛋白在细胞质、叶绿体、过氧化物酶体的定位系数分别为6.0、4.0、3.0。

2.2.7GrAACT基因稀有密码子分析使用在线软件对GrAACT基因进行稀有密码子分析，结果表明：GrAACT基因中稀有密码子占1.48%，且无二联或三联稀有密码子连续出现的情况，因此可选用大肠杆菌表达菌BL21或Rosetta（DE3）进行原核表达。

2.3GrAACT基因原核表达载体的构建

使用酶切检测重组质粒pGEX-4T-1-GrAACT，结果表明：BamHⅠ、XhoⅠ双酶切可切出目的基因和载体，且二者长度之和等于XhoⅠ单酶切产物长度（图8），表明GrAACT基因已成功插入载体pGEX-4T-1。

2.4GrAACT基因的原核表达

将重组质粒pGEX-4T-1-GrAACT转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后，在37 ℃、1 mmol/L IPTG（终浓度）下，分别

诱导表达0、2、4、6 h后，提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析。结果表明：与对照（第1～3泳道）相比，pGEX-4T-1-GrAACT转化菌经IPTG诱导后，在相对分子质量67 410 u（含GST蛋白26 000 u）左右有1条蛋白条带，并且随诱导时间增加，其蛋白含量逐渐升高（图9），表明重组质粒pGEX-4T-1-GrAACT在大肠杆菌Rosetta（DE3）中成功诱导表达了GrAACT蛋白。当温度为37 ℃、诱导时间为6 h时，蛋白表达量最大（图9），细胞破碎后可直接用于蛋白纯化。

2.5GrAACT基因的组织表达分析

取3年生滇龙胆的根、茎、叶，提取总RNA，反转录成cDNA后，通过实时荧光定量RT-PCR分析GrAACT基因在根、茎、叶中的表达情况。图10结果表明：GrAACT基因在茎中表达量最高，分别约为叶、根的13.17、1.36倍，表达量最低的是叶。

3讨论

滇龙胆药效成分龙胆苦苷是通过MVA、MEP途径合成的，在前期笔者已经克隆了MEP途径关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR[12]。为阐明龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理，本研究克隆了MVA途径中的GrAACT基因。AACT是MVA途径的第1个催化酶，因此滇龙胆中GrAACT基因的表达情况可以直接或间接影响龙胆苦苷的生物合成。研究表明，植物中如丹参[6]、白木香[8]、油茶[9]AACT蛋白均包含硫解酶N端结构域、C端结构域和保守位点。本研究从滇龙胆幼叶中克隆获得GrAACT基因，其编码蛋白序列比对分析结果表明，GrAACT蛋白属于AACT家族蛋白，具有硫解酶N端、C端结构域，并且在其C端具有保守位点：NVHGGAVALGHPLGCSG（第350—366位氨基酸）。这些结果表明，所克隆基因的确为滇龙胆乙酰CoA酰基转移酶基因。

根据底物链长特异性，硫解酶被分为2类：第I类是降解型硫解酶（EC 2.3.1.16），定位于线粒体、过氧化物酶体，在脂肪酸氧化中催化3-酮脂酰CoA断裂产生乙酰乙酰CoA、缩短的酰基CoA；第Ⅱ类是合成型硫解酶（EC 2.3.1.9），定位于细胞质，能够催化2分子乙酰CoA形成1分子乙酰乙酰CoA[13]。生物信息学分析结果表明，GrAACT蛋白定位于细胞质，属于Ⅱ型硫解酶，参与胞质中的MVA途径。在植物中，AACT蛋白的定位还存在争议。在拟南芥中，参与MVA生物合成途径的AtAACT2蛋白定位于细胞质[14]；而对拟南芥过氧化物酶体蛋白质组研究结果表明，该蛋白也存在于过氧化物酶体[15]。在向日葵（Helianthus annuus）乙醛酸循环体中，HaAACT能够催化朝向乙酰乙酰CoA方向的反应[16]，说明过氧化物酶体中也存在AACT。GrAACT蛋白三维模型预测结果表明，该蛋白的活性形式为四聚体。在本研究中，GrAACT单体相对分子质量为41 410 u，其活性形式可能是单体，也可能是四聚体，这需要通过非变性SDS-PAGE进行进一步检测。

在拟南芥中，参与MVA途径的AtAACT2基因在根尖、幼叶、茎上部和花药中大量表达[5]。组织表达特异性检测结果表明，GrAACT基因在根中的表达量较高，因此推测：滇龙胆根部为龙胆苦苷生物合成的主要器官。滇龙胆用药部分为根，因为与叶、茎相比，根中龙胆苦苷含量最高[17-18]，这也为上述假说提供了证据。在拟南芥中，参与MVA途径的AtAACT2基因是多效基因。首先，AtAACT2对于胚胎形成和正常的雄性配子传递是必需的，AtAACT2突变体不能存活；其次，AtAACT2基因的RNAi株系表现出多效的表型，包括减弱的顶端优势、延长的生活周期和开花时间、雄性不育、矮化、种子产量降低、根长变短和植物甾醇类质和量的改变等；再次，当外源添加甲羟戊酸后，AtAACT2基因的RNAi株系以上的表型和生化改变都可逆转[5]。本研究中的GrAACT蛋白与AtAACT2蛋白相似性高达83.87%，GrAACT基因是否也为多效基因，需要进一步试验验证。

本研究为滇龙胆的分子生物学研究提供基因资源，并为GrAACT基因功能的解析奠定基础。下一步将对GrAACT蛋白进行纯化和酶活分析，通过互补试验或过表达研究GrAACT基因的功能，从而为龙胆苦苷生物合成途径的阐明奠定基础。

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