雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析

屠李婵+张逸风+苏平+胡添源+童宇茹+关红雨+赵瑜君+张夏楠+袁媛+高伟+黄璐琦

[摘要]根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物，采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1，TwGPPS2 全长cDNA，并进行生物信息学分析和蛋白表达研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp，编码425个氨基酸蛋白，预测蛋白等电点为668，相对分子质量为47189 kDa；TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp，编码422个氨基酸蛋白，预测蛋白等电点为671，相对分子质量为46774 kDa；进一步构建了原核重组表达载体pET32aTwGPPS1，pET32aTwGPPS2，并成功诱导出TwGPPS1，TwGPPS2重组蛋白，为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。

[关键词]雷公藤； 牻牛儿基焦磷酸合酶； 克隆； 生物信息学分析； 蛋白表达

Cloning and protein expression analysis of geranyl diphosphate synthase

genes in Tripterygium wilfordii

TU Lichan1 ， ZHANG Yifeng1，2， SU Ping1，2， HU Tianyuan1， TONG Yuru1，2， GUAN Hongyu 1，2，

ZHAO Yujun2， ZHANG Xianan1， YUAN Yuan2*， GAO Wei1*， HUANG Luqi2

（ 1School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；

2State Key Laboratory of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

Chinese Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract]Based on the transcriptome data， the study cloned fulllength cDNA of TwGPPS1 and TwGPPS2 genes from Tripterygium wilfordii suspension cells and then analyzed the bioinformation of the sequence and protein expression The cloned TwGPPS1 has a 1 278 bp open reading frame （ORF） encoding a polypeptide of 425 amino acids The deduced isoelectric point （pI） was 668， a calculated molecular weight was about 47189 kDa. The fulllength cDNA of the TwGPPS2 contains a 1 269 bp open reading frame （ORF） encoding a polypeptide of 422 amino acids The deduced isoelectric point （pI） was 671， a calculated molecular weight was about 46774 kDaThe entire reading frame of TwGPPS1，2 was cloned into the pET32a（+） vector and expressed in E. coli BL21 （DE3） cells to obtain the TwGPPS protein， which laid a basis for further study on the regulation of terpenoid secondary metabolism and biological synthesis.

[Key words]Tripterygium wilfordii； geranyl diphosphate synthase； cloning； bioinformatics analysis； protein expression

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f為卫矛科雷公藤属木质藤本植物。作为一种传统中药，其味辛、苦，性寒，化学成分复杂，具有祛风除湿、消肿活血、通络止痛、解毒杀虫的功效，被广泛用于治疗肾小球肾炎、红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病及多种皮肤病，同时雷公藤也可作为农药用以杀虫、毒鼠、灭螺等，是目前国内外研究的热点天然药物之一[12]。现雷公藤已分离出200多种单体化合物，其中，具有生物活性的主要是倍半萜类（包括倍半萜生物碱类）、二萜类、及三萜类等化合物[3]。萜类作为其主要的活性成分，在植物中的含量较低，且由于雷公藤的过度开发利用，导致资源面临枯竭[45]。

萜类共同前体异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）来源于胞质内的MVA（mevalonate）途径与质体内的MEP（2CmethylDerythritol4phosphate）途径。雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶（geranyl diphosphate synthase， GPPS）属于短链异戊烯基合酶家族成员，可以催化1分子的IPP和1分子DMAPP缩合形成牻牛儿基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP），为单萜提供碳骨架。目前已从滇龙胆[6]、薄荷[78]、长春花[9]、金鱼草[10]等植物中成功克隆得到。本研究克隆得到雷公藤萜类生物合成的关键酶基因TwGPPS1，TwGPPS2基因全长序列，为研究该基因功能以及探讨雷公藤萜类次生代谢调控提供靶基因。

1材料

11植物雷公藤悬浮细胞，05 mg·L-1 2，4D+01 mg·L-1 KT+05 mg·L-1 IBA+MS液体培养基，25 ℃，120 r·min-1黑暗条件振荡培养。

12菌株Escherichia coli Trans 5α感受态细胞、BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

13载体表达载体pET32a（+） 由本实验室保存提供，pEASYT3 vector购自北京全式金生物技术有限公司。

14试剂和仪器BamHⅠHF，SacⅠHF，T4 DNA Ligase， PhusionHighFidelity PCR Master Mix with HF Buffer购自美国NEB公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、FastQuant RT Kit （with gDNase）、快速质粒小提试剂盒、RNA 纯化试剂盒购自天根生化科技（北京） 有限公司，IPTG（isopropylβDthiogalactoside），PMSF（phenylmethanesulfonyl fluoride）购自美国Sigma公司，其他试剂为国产分析纯，DYY6D型电脑三恒多用电泳仪为北京市六一仪器厂，凝胶成像分析系统，VeritiTM 96孔梯度PCR仪为美国Applied Biosystems公司、微量移液器为德国Eppendorf公司，引物合成及测序服务由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。

2方法

21雷公藤悬浮细胞总RNA的提取取新鲜雷公藤悬浮细胞用CTAB法提取总RNA，依据RNA纯化试剂盒操作，进行RNA的精制，采用琼脂糖凝胶电泳检验RNA的质量。

22TwGPPS cDNA全長克隆根据雷公藤悬浮细胞转录组数据，分析并设计全长特异性引物，引物序列见表1。以提取的总RNA为模板，依据FastQuant RT Kit （With gDNase）说明书，将RNA反转录成第一链cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物在PCR仪上进行全长PCR扩增。PCR反应体系：25 μL Phusion HF PCR（2×），25 μL Primer F（10 μmol·L-1），25 μL Primer R（10 μmol·L-1），1 μL cDNA模板，19 μL ddH2O。PCR反应程序：98 ℃ 30 s，35个循环（98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s），72 ℃ 8 min。将获得的PCR产物依据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，进行切胶回收，与pEASYT3 vector进行TA连接，转化至E coli Trans 5α感受态细胞及阳性克隆PCR鉴定，根据测序结果，确定TwGPPS1，TwGPPS2的cDNA全长序列。

23TwGPPS基因的生物信息学分析采用InterPro在线软件（http：// wwwebiacuk /Tools/InterProScan）进行结构域比对，ExPAS ProtParam tool（http：//webexpasyorg/protparam/）预测蛋白性质，TargetP11 server （http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）进行信号肽分析，Psort（http：//psorthgcjp/）及Wolfpsort（http：//wolfpsortorg/）分析亚细胞定位，TRMHMM server v20 （http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM20/）进行跨膜域分析，PRABIGERLAND（https：//npsaprabiibcpfr/）进行二级结构预测，SWISSMODEL（http：//swissmodelexpasyorg/） 进行二级结构分析和结构域的三维同源建模。使用DNAMAN软件对序列进行多重比对，根据同源比对结果用MEGA 50软件构建系统进化树。

24原核表达载体构建以含有雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因全长cDNA的载体pEASYT3TwGPPS1，pEASYT3TwGPPS2质粒为模板，用含SacⅠ和BamHⅠ酶切位点引物，进行PCR扩增基因编码区，扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行胶回收。经纯化后的PCR产物用限制性内切酶进行双酶切，采用NEB公司T4 DNA 连接酶定向连入经相同双酶切的表达载体pET32a（+） 中，连接产物转化至E coli Trans 5α、菌落筛选及阳性克隆的初步筛选后送样测序鉴定。

25重组蛋白诱导表达将酶切鉴定正确且经测序验证的含目的基因的重组质粒，转化至BL21（DE3）感受态细胞中，涂布LB+Amp固体平板，37 ℃黑暗倒置培养12～16 h，挑取单克隆菌落经阳性鉴定后转到含100 mg·L-1 Amp的LB液体培养基中，加入一定量IPTG诱导剂（终浓度为1 mmol·L-1），低温下（16 ℃）诱导培养12 h，4 ℃ 9 000×g离心30 min 收获菌体，-80 ℃冷冻保存。用预冷的6 mL 1×PBS缓冲液（含2 mmol·L-1 DTT） 重悬；置冰浴中超声破菌；大肠杆菌破碎液在4 ℃，9 000×g离心2次，分离上清和沉淀；进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝胶电泳检测，以空质粒表达载体pET32a转化BL21（DE3）表达菌进行表达为对照。

3结果

31雷公藤TwGPPS1，2全长克隆以雷公藤的cDNA为模板，经过PCR扩增、凝胶电泳检测的产物条带片段长度在1 200 bp左右，与预期的目的条带长度相符合。经测序后，表明TwGPPS1长度为1 278 bp，TwGPPS2长度为1 269 bp，见图1。

32TwGPPS1，2序列同源性比对及结构域分析TwGPPS1的核苷酸的完整开放阅读框为1 278 bp，编码425个氨基酸蛋白，TwGPPS2的核苷酸的完整

MDNA Marker （2 kb）；1，2TwGPPS1，TwGPPS2全长PCR产物。

开放阅读框为1 269 bp，编码422个氨基酸蛋白。TwGPPS1，2 Blast结果见表2。InterproScan进行结构域分析，预测 TwGPPS1，2蛋白的保守结构域，TwGPPS1，2具有聚丙烯合成酶（polyprenyl synthetase）、类异戊二烯合成酶（isoprenoid synthase domain）、聚丙烯相关合成酶 （polyprenyl synthetaserelated）。将TwGPPS1，2与9种其他植物GPPS氨基酸序列进行多重序列比对，结果表明TwGPPS1，2蛋白与已知蛋白序列同源性高达7858%，见图2。

33TwGPPS1，2氨基酸序列的分子系统进化分析将TwGPPS1，TwGPPS2与GenBank 中的8种蛋白进行比对分析，在软件 MEGA 50平台上采用相邻连接法构建GPPS家族的系统进化树，见图3。氨基酸进化树分析表明，TwGPPS1与TwGPPS2处在同一分支上，与雷蒙德氏棉Gossypium raimondii、大豆Glycine max、毛果杨Populus trichocarpa、芒果Mangifera indica、克莱门柚Citrus clementina聚为一类，亲缘较近。与裸子植物北美冷杉Abies grandis亲缘关系较远。

34TwGPPS1，2理化性质、亚细胞定位及3D结构预测①TwGPPS1：利用 ProtParam工具，TwGPPS1编码氨基酸的理化性质，结果TwGPPS1 相对分子质量为47 1890、理论等电点为668，分子式為C2079H3345N587O630S17，总原子数为6 658，TwGPPS1氨基酸组成中 Leu 所占比例最高为120%，trp 所占比例最低为 05%，TwGPPS1不稳定指数为 3690，脂肪指数为 9593，TwGPPS1蛋白稳定。TwGPPS1

基因品名相似度/%序列号TwGPPS1雷蒙德氏棉Gossypium raimondii85KJB698781大豆Glycine max 82XP_0066009301毛果杨Populus trichocarpa82XP_0023083602印楝Azadirachta indica80AIG154481克莱门柚Citrus clementina 80XP_0064489891TwGPPS2雷蒙德氏棉G. raimondii81XP_0124537881大豆G. max81XP_0066009301毛果杨P. trichocarpa 79XP_0023083602克莱门柚C. clementina78XP_0064489891印楝A. indica78AIG154481

全长cDNA序列编码的氨基酸为非分泌蛋白，信号肽分析表明无信号肽，跨膜域分析表明为非膜蛋白。对TwGPPS1蛋白进行亲/疏水性预测表明该蛋白为亲水性蛋白。采用PSORT Ⅱ Prediction进行亚细胞定位，TwGPPS1蛋白序列定位在胞质中。TwGPPS1蛋白的二级结构预测结果显示，无规则卷曲和α螺旋结构是其主要结构原件，α螺旋结构为主占5388%，其次为无规则卷曲占3953%，β转角占659%。三维同源模型见图4（A），其三维同源模型以3apz1A蛋白为模板， 用于建立该模型的氨基酸残基范围为85～425位，序列同源性为7925%。②TwGPPS2：利用 ProtParam工具，TwGPPS2编码氨基酸的理化性质，结果TwGPPS2 相对分子质量为46 7736、理论等电点为671，分子式为C2064H3316N586O618S17，总原子数为6 601，TwGPPS2氨基酸组成中 Leu 所占比例最高为126%，trp 所占比例最低为06%。TwGPPS2不稳定指数为3701，脂肪指数为9941，TwGPPS2蛋白稳定。TwGPPS2全长cDNA序列编码的氨基酸为非分泌蛋白，信号肽分析表明无信号肽，跨膜域分析表明为非膜蛋白。对TwGPPS2蛋白进行亲/疏水性预测表明该蛋白为亲水性蛋白。采用PSORT Ⅱ Prediction进行亚细胞定位，TwGPPS2蛋白序列定位在线粒体中。TwGPPS2蛋白的二级结构预测结果显示，无规则卷曲和α螺旋结构是其主要结构原件，α螺旋结构为主占5664%，其次为无规则卷曲占3602%，β转角占735%。三维同源模型见图4（B），其三维同源模型以3aq02A蛋白为模板， 用于建立该模型的氨基酸残基范围为82～422位，序列同源性为7781%。

35TwGPPS1，2原核表达载体构建对重组质粒见图5，pET32aTwGPPS1，pET32aTwGPPS2进行测序分析，结果表明，插入表达载体中的片段与目的序列一致，证明成功构建原核表达重组质粒pET32aTwGPPS1，pET32aTwGPPS2。

36TwGPPS1，2重组蛋白表达将成功构建的pET32aTwGPPS1和pET32aTwGPPS2重组质粒转化表达宿主菌Ecoli BL21（DE3），挑取单克隆菌落于LB（100 mg·L-1 Amp）液体培养基中培养，待菌液A600为06～08 时，在16 ℃，1 mmol·L-1 IPTG，170 r·min-1条件下培养12 h后，对诱导前后的大肠杆菌总蛋白进行SDSPAGE分析。含pET32aTwGPPS1，2质粒的表达菌株经IPTG诱导后，在约58 kDa处出现诱导蛋白条带，而pET32a载体菌株在相应位置无蛋白表达见图6。经验证，58 kDa大小符合TwGPPS1，2与pET32a载体融合蛋白，该处为TwGPPS1，2重组蛋白目的条带。结果表明，TwGPPS1，2蛋白成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。

4讨论

目前，对牻牛儿基焦磷酸合酶研究较少，仅有少数对牻牛儿基焦磷酸合酶的功能进行研究[1113]。本研究在雷公藤悬浮细胞转录组数据的基础上，通过设计全长特异引物，从雷公藤中克隆得到长度为1 278 bp的TwGPPS1完整ORF cDNA序列和长度为1 269 bp的TwGPPS2完整ORF cDNA序列。TwGPPS1，2与雷蒙德氏棉具有较高相似性，经预测，均具有聚丙烯合成酶、类异戊二烯合成酶、聚丙

进行多重比对的氨基酸序列为：TwGPPS1，TwGPPS2，Gossypium raimondii（KJB698781），Glycine max（gKRH580111），Populus trichocarpa（XP_0023083602），Citrus sinensis（KDO753891），C unshiu（AAN860611），Theobroma cacao（XP_0070249791），Quercus robur（CAC208521），Medicago truncatula（XP_0134574801），G. soja（KHN214171）。

烯相关合成酶结构域，系统进化树显示2条基因聚为一支，具有较大同源性。本研究成功构建了原核重组表达载体pET32aTwGPPS1，pET32aTwGPPS2，并成功诱导出TwGPPS1，TwGPPS2重组蛋白。

MMarker；1诱导后pET32a菌体；2诱导后pET32a上清；3未诱导pET32aTwGPPS1菌体；4诱导后pET32aTwGPPS1菌体；5诱导后pET32aTwGPPS1菌体上清；6诱导后pET32aTwGPPS1菌体沉淀；7未诱导的pET32aTwGPPS2菌体；8诱导后pET32aTwGPPS2菌体；9诱导后pET32aTwGPPS2菌体上清；10诱导后pET32aTwGPPS2菌体沉淀。

成功获得了可溶性蛋白，但其表达量较少，为进一步提高可溶性蛋白含量，实验中还成功构建了pMALc2XTwGPPS1， pMALc2XTwGPPS2原核重组表达载体，经SDSPAGE检测可溶性蛋白表达量并未显著提升，其原因仍需进一步研究。本实验为深入研究雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础，为雷公藤基因资源的保护和合理利用提供参考。

[参考文献]

[1]刘为萍，刘素香，唐慧珠，等雷公藤研究新进展[J]中草药，2010，41（7）：1215

[2]林光美，张敏， 侯长红 雷公藤研究进展[J]中国农学通报，2009，25（23）：90

[3]张秋萍，宋洪涛 雷公藤制剂研究进展[J]中国药师，2009，12（7）： 881

[4]黄明来，马卓雷公藤的研究进展[J]化学与生物工程，2012，29（7）：1

[5]斯金平，阮秀春，郭宝林，等 雷公藤资源现状及可持续利用的研究[J]中药材，2005， 28（1）： 10

[6]王彩云，李富生，李濤，等滇龙胆GrGPPS基因的克隆及其序列分析与原核表达[J]中草药，2014，45（15）：2060

[7]于盱，王海棠，冯美英，等薄荷GPPS基因的克隆与表达分析[N]江西农业学报，2013，25（7）：25

[8]于盱，梁呈元，刘艳，等薄荷GPPS基因原核表达及RNA干扰载体构建[J]生物技术通报，2014（9）：84

[9]Rai A， Smita S S， Singh A K， et al Heteromeric and homomeric geranyl diphsophate synthases from Catharanthus roseus and their role in monoterpene indole alkaloid biosynthesis [J]Mol Plant， 2013，6（5）：1531

[10]Dorothea Tholl， Christine M Kish， Irina Orlova，et al Formation of monoterpenes in Antirrhinum majus and Clarkia breweri flowers involves heterodimeric geranyl diphosphate synthases [J].Plant Cell， 2004， 16（4）： 977

[11]Burke C， Croteau R Interaction with the small subunit of geranyl diphosphate synthase modifies the chain length specificity of geranylgeranyl diphosphate synthase to produce geranyl diphosphate [J] J Biol Chem， 2002，277（5）： 3141

[12]Chang T H， Hsieh F L， Ko T P， et al Structure of a heterotetrameric geranyl pyrophosphate synthase from mint （Mentha piperita） reveals intersubunit regulation [J]Plant Cell， 2010， 22（2）： 454

[13]Wang Guodong， Richard A DixonHeterodimeric geranyl（geranyl）diphosphate synthase from hop （Humulus lupulus） and the evolution of monoterpene biosynthesis[J] Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（24）：9914

[责任编辑吕冬梅]

[收稿日期]20160626

[基金项目]北京高等学校高水平人才交叉培养“实培计划”项目；国家自然科学基金优秀青年科学基金项目（81422053）

[通信作者]*高伟，教授，Tel：（010）83911633，Email： weigao@ccmueducn； *袁媛，研究员， Email：y_yuan0732@163com

[作者简介]屠李婵，Tel： （010）83911633，Email：tulichan@163com