湖羊SPLUNC1基因序列的生物信息学分析

陈凯丽 孙延鸣++沈文++陈冬梅 +郭海英

摘要：以湖羊SPLUNC1基因为研究对象，利用生物信息学方法对其编码的蛋白进行理化性质、信号肽、跨膜区域、亚细胞定位、二级结构、三级结构、保守区域分析，并构建系统发育树。结果表明，湖羊SPLUNC1蛋白的分子量为26.53 ku，理论等电点为5.07。SPLUNC1蛋白N端存在信号肽，亚细胞定位在细胞外。SPLUNC1蛋白质的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲。该蛋白由4 股反平行的肽段形成的β折叠片和2个α螺旋组成的桶形结构域组成。系统发育树分析表明，湖羊的SPLUNC1蛋白在山羊、牛、猪、人、小鼠中，与山羊首先聚为一类，后与牛聚为一类，这与动物学分类结果一致。

关键词：湖羊；短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）；生物信息学分析

中图分类号： Q781文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）02-0048-03

收稿日期：2015-01-27

基金项目：国家自然科学基金（编号：31460686）

作者简介：陈凯丽（1988—），女，河南南阳人，硕士，主要从事动物学研究。E-mail：kellyhenan@163.com。

通信作者：孙延鸣，博士，教授，主要从事临床兽医学研究。E-mail：sym@shzu.edu.cn。

短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（short palate，lung and nasal epithelium clone 1，[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]）因其特异表达于上腭、肺及鼻咽上皮而被命名。Weston等首次克隆了小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因[1]。SPLUNC1具有分泌物的生化特性[2]，分布于细胞胞浆中[3]。人、小鼠、牛、猪[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]分别定位于20号染色体、2号染色体、13号染色体、17号染色体。研究表明哺乳类动物物种拥有共同的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]表达模式，即在口咽部、上呼吸道、唾液腺和气管表达，且在革兰阴性细菌引起的呼吸道感染中能起到抗菌及抗炎双重作用[4]。Liu等证明了SPLUNC1是吸道病原菌感染肺部黏膜固有免疫防御相关决定性成分[5]。Chu等证实SPLUNC1是一种新的宿主防御肺炎支原体蛋白，体内过表达的SPLUNC1能显著地抑制肺部肺炎支原体的载荷量[6]。此外，SPLUNC1在维持上呼吸道稳态方面也起了重要的作用[7]。目前，有关人和小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因功能已有相关报道，但未见有关羊的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]相关功能及其生物信息学分析的报道。在此前的研究中，笔者采用RACE技术，从湖羊的肺组织中克隆得到[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA序列，并在GenBank上登录（登录号：KJ749828.1）。本研究利用生物信息学方法对湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因序列进行分析，为进一步研究湖羊SPLUNC1蛋白的生物学功能奠定基础。

1材料与方法

1.1生物信息学数据库和软件

NCBI（美国生物技术研究中心）：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastEXPASY：http：//www.us.expasy.ch（蛋白质数据库）；MEGA 5.05软件；RasMol软件。

1.2湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因cDNA全长的获得

从湖羊肺组织中提取RNA，利用RACE技术分别扩增出[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]的3′末端和5′末端序列并送基因公司测序，用DNAMAN软件将测序结果进行拼接，获得湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA 的全长序列。湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA的全长序列的具体克隆步骤参照文献[8]。

1.3生物信息分析方法

利用在线分析工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因编码的蛋白质进行氨基酸理化分析。利用在线分析工具NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）对湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因编码的蛋白质进行糖基化位点分析。利用在线分析工具WoLF PSORT（http：//wolfpsort.org）、TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和SignalP-3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）对湖羊SPLUNC1蛋白在真核细胞的亚细胞位置和信号肽进行分析。利用在线分析工具TMPred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）对湖羊SPLUNC1蛋白进行跨膜区分析。利用在线分析工具SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测湖羊SPLUNC1蛋白二级结构进行分析。利用NCBI的在线分析工具Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome）对湖羊SPLUNC1蛋白的保守结构域进行预测。利用在线分析工具3D-PSSM（http//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）和RasMol软件对湖羊SPLUNC1蛋白的三级结构进行分析。利用NCBI 的在线分析工具Blast对湖羊的SPLUNC1进行氨基酸序列比对。利用MEGA 5.05构建湖羊SPLUNC1蛋白的分子进化树。

2结果与分析

2.1湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因基本信息与理化性质分析

研究利用ExPaSy蛋白数据库中的ProtParam在线工具对湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因编码的蛋白质（GenBank登录号：AIG92771.1）进行氨基酸理化性质分析，结果表明，蛋白质分子式为C1206H2031N305O348S5，原子总数为3 895，蛋白质分子质量为26.53 ku，理论等电点为5.07；不稳定系数为 29.88，说明该蛋白为稳定蛋白；脂肪系数为152.08，总平均亲水性为0.704，说明该蛋白是疏水蛋白。湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因编码的255个氨基酸中含量最高的是Leu、Gly 和Val，各有62个、24个和24个，分别占24.3%、9.4%和9.4%，且不含有Pyl、 Trp和Sec。利用NetNGlyc 1.0 Server预测N-糖基化序列，发现湖羊的SPLUNC1序列中含有2个糖基化序列，分别是：NITA和NLTG。由图1可知，使用亮氨酸拉链公式：Leu-X6-Leu-X6-Leu-X6-Leu （X 指代任意氨基酸残基），在N末端发现了亮氨酸拉链序列。

[FK（W6][TPCKL1.tif][FK）]

2.2湖羊SPLUNC1蛋白的信号肽、亚细胞定位及跨膜区域分析

结合Emanuelsson1等和Paul等的亚细胞定位方法对湖羊的SPLUNC1进行信号肽、亚细胞定位分析[9-10]。使用这2篇文献中提到的在线分析工具进行分析。

WoLF PSORT预测运用最邻近结点算法（k-nearest neighbor algorithm，KNN），K值为32，queryProtein details extr：28，E.R.：3 （extr即extracellular细胞外的，E.R.即内质网）。点击网页结果中的”details“查看与湖羊SPLUNC1匹配的32个蛋白中，有28个与细胞外蛋白相似，且评论大部分为分泌蛋白；有3个与内质网有关，1个与溶酶体蛋白相似。

TargetP 1.1 Server结果表明湖羊SPLUNC1具有分泌途径，且含有19个氨基酸的信号肽。

按照Emanuelsson1等的建议[9]，对TargerP 1.1 Server预测的信号肽使用SignalP-3.0进行再次分析，得出的结果采用neural networks （NN）算法，湖羊SPLUNC1蛋白的信号肽切割位点为第19个氨基酸和第20个氨基酸之间（图2）。

[FK（W10][TPCKL2.tif][FK）]

利用在线TMPred工具对目标蛋白质进行跨膜区预测，结果为：有2个可能的模型值得考虑，其中一个模型是N末端在内部，有2个大的跨膜螺旋，分别位于1～21位氨基酸（由内到外），47～68位氨基酸（由外到内），总分：2 611；另一种模型是有1个大的跨膜螺旋，位于1～19位氨基酸（由外到内），总分：1 260（图3）。

[FK（W10][TPCKL3.tif][FK）]

综上所述，湖羊SPLUNC1蛋白含有1个19位氨基酸的信号肽，亚细胞定位于细胞外，有2个大的跨膜螺旋。

2.3湖羊SPLUNC1蛋白二级结构预测分析

本研究利用SOPMA工具预测该基因编码蛋白质的二级结构，结果显示参与形成螺旋（alpha helix）的氨基酸有135个、占52.94%，参与形成延伸直链（extended strand）的氨基酸有38个，占14.90%，参与形成无规则卷曲（random coil）的氨基酸有69个，占27.06%。二级结构分布见图4。

[FK（W9][TPCKL4.tif][FK）]

2.4湖羊SPLUNC1蛋白三级结构预测分析

本研究利用SWISS-MODEL蛋白质三维结构建模工具预测湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因编码蛋白质的三维结构，获得该蛋白的三维结构模型。使用SWISS-MODEL模板库匹配靶序列的进化相关结构进行Blast和HHBlits搜索，在匹配的23个模板里，模板4 kgo.1.A与湖羊SPLUNC1序列的相似最高。使用RasMol软件查看预测结果，发现该蛋白由4 股反平行的肽段形成的β折叠片和2个α螺旋组成的桶形结构域组成（图5）。

2.5湖羊SPLUNC1蛋白保守区域预测

利用NCBI的Blast比对预测湖羊SPLUNC1的结构域，由图6可见，湖羊SPLUNC1蛋白有2个结构域，其中第58个氨基酸到第233个氨基酸构成的保守结构域与LBP_BPI_CEPT结[CM（25]构域相似，第104个氨基酸到第231个氨基酸构成的保守[CM）]

[FK（W6][TPCKL5.tif][FK）]

结构域与BPI1结构域相似。

2.6湖羊SPLUNC1蛋白的系统发育树分析

使用NCBI 的Blast在线工具对湖羊SPLUNC1的氨基酸进行序列比对，结果表明，湖羊与山羊、家牛、猪、人、小鼠物种相似性为98%、92%、78%、79%、67%。利用Clustal X 1.81软件对6个物种[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因氨基酸序列进行比对，然后使

[FK（W6][TPCKL6.tif][FK）]

用MEGA 5.05的邻近法（Neighbor-Joining，NJ）基于该基因氨基酸序列的比对结果构建6个物种的系统发育树，进而反映不同物种的系统进化及亲缘关系（由图7可见，分支节点处数字为1 000次Bootstrop检验的支持百分比）。结果表明，湖羊和山羊的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因同属一个分支，亲缘关系比较密切，聚为一类，随后这2者与牛聚为一类，而后与猪聚为一类，而人和小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因单独为1支。

[FK（W9][TPCKL7.tif][FK）]

3结论与讨论

本研究通过DNAMAN、NCBI等在线工具和软件，对湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因的蛋白结构和功能进行了分析。由分析结果可知，克隆的湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因cDNA全长（GenBank登录号：KJ749828.1）为1 091 bp，含1个完整的开放阅读框（ORF）768 bp，共编码255个氨基酸。将湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因翻译的氨基酸序列与已发表文章小鼠和猪[1，11]SPLUNC1的信息进行比较，发现湖羊的SPLUNC1与小鼠在N端都有亮氨酸拉链，且排列的位置相同。小鼠的为MFLVGSLVVLCGLLAHSTAQLAGLPLPL，湖羊的为MFQIGSLIVLCGLLAQTTALLEALPVPL，猪的N端未发现，表明亮氨酸拉链在物种进化上存在差异。另外小鼠的糖基化序列是NPTD、NITA和NLTG，湖羊是NITA和NLTG，猪只有1个糖基化序列NITV。同时，在小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]序列上发现的PLPL结构域以及保守结构域蛋白激酶C（SLK）和酪蛋白激酶Ⅱ（SFVD和SGLD）在湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]上没有被发现，而猪的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]序列上却发现有蛋白激酶C（SLK）序列。

最早先采用的是信号肽预测软件SignalP 4.0分析湖羊SPLUNC1蛋白，发现信号肽切割位点在23～24，而报道的小鼠和猪的信号肽切割位点在19～20之间，人的SPLUNC1 蛋白的N 端的信号肽长度为19个氨基酸[12]，但是结合了亚细胞定位后，支持了信号肽切割位点为19～20。在亚细胞定位时参考了孙伟等和杜慕云等的亚细胞定位方法[13-14]，对序列进行分析发现，用Signal 3.0分析有2个结果，neural networks （NN）的分析结果为信号肽切割位点为 19～20，hidden Markov models （HMM）的分析结果为信号肽切割位点为23～24。综合比较后，判断湖羊SPLUNC1的信号肽切割位点应为 19～20之间，但是仍需试验数据支持。

从近些年的研究报道中，可以看出大部分的SPLUNC1生物学研究功能主要在人和鼠上，鲜见羊SPLUNC1生物学功能的相关报道。此次研究运用生物信息学的方法对湖羊SPLUNC1蛋白的基本理化性质、信号肽、跨膜区域、二级结构等进行分析，初步预测了湖羊SPLUNC1蛋白所拥有的部分特性，以期为深入探讨其生物学功能提供理论依据。

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