地黄纤维素合酶基因的克隆与生物信息学分析

周延清　张喻　李静云　等

摘要：根据以前克隆的地黄RghBNG基因碱基序列，利用Primer Premier 5.0设计特异引物，采用hiTAIL-PCR技术从怀地黄基因组DNA中扩增出578 bp DNA片段。经生物信息学分析发现，它与根癌土壤杆菌、土壤杆菌的纤维素合酶基因的同源性达81%～91%；它所含的453 bp的开放阅读框（ORF）编码蛋白质的氨基酸序列与根癌土壤杆菌、土壤杆菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌纤维素合酶基因编码蛋白质氨基酸序列的同源性高达83%～99%，说明蛋白质可能具有纤维素合酶的结构域。用hiTAIL-PCR技术克隆怀地黄纤维素合酶基因，为进一步研究其分子作用机制和在地黄分子育种中的应用奠定了基础。

关键词：怀地黄；纤维素合酶；hiTAIL-PCR技术；生物信息学分析

中图分类号：S567.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0021-03

收稿日期：2014-03-27

基金项目：河南省基础与前沿技术研究计划（编号：092300410009）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（编号：14B180028）；国家大学生创新创业训练计划（编号：201310476102）；河南省高校科技创新团队支持计划（编号：13IRTSTHN009）。

作者简介：周延清（1963—），男，河南邓州人，博士，教授，主要从事遗传学教学与研究。E-mail：yqzhou@htu.cn。地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄参科（Scrophulariaceae）地黄属（Rehmannia）多年生草本植物，共有6个种，广泛分布于中国、韩国和日本等地[1]。地黄在河南、山东、山西、陕西等省广泛分布，为我国大宗常用中药材之一，传统认为怀庆地黄[称为怀地黄（R. glutinosa f.hueichingensis）]质量优良[2]。地黄块根入药，富含梓醇、糖类和苷类物质、维生素、多种氨基酸、多种微量元素，具有防癌、抗癌、增强免疫力、延缓衰老、增强造血能力、降低血糖、防治糖尿病并发症等功能[3]和重要的经济价值[4]。在方剂中，地黄的使用量占了很大的比重，例如六味地黄丸、知柏地黄丸和杞菊地黄丸等。 在保健使用方面，已经开发出一些含有地黄成分的产品，如地黄精、地黄茶和地黄醋等[5]。国内外关于地黄基因克隆、功能分析和表达模式研究已有报道。例如，用RT-PCR方法扩增的地黄肌动蛋白基因片段，可用作内参基因[6]；通过RT-qPCR分析地黄中11个内参基因的mRNA表达差异情况[7]；用SSH方法克隆地黄块根中RgPR-10 基因，研究其在地黄根和茎以及原核表达情况[3，8]；利用Solexa测序技术、生物信息学和荧光定量 PCR 分析从正茬地黄和重茬地黄中鉴定出89个miRNAs，预测其中 7个新型 miRNAs的15个靶基因，在正茬地黄和重茬地黄之间构建miRNAs 差异表达谱[4，9]；进行地黄赤霉素、脱落酸和部分寡糖合成代谢关键酶基因以及扩展蛋白基因RgExpA1的克隆与表达分析[10-11]；用 PCR 技术克隆怀地黄转座酶基因[12]；此外，还进行了怀地黄RgVP和RgKAT基因的克隆和时空表达分析[13]及怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析[14]。但尚未见克隆地黄纤维素合酶基因的报道，纤维素合成酶是将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一组复杂酶系的总称[15-16]。迄今为止，已有从毛竹[17]和苎麻[18]等植物中克隆纤维素合酶基因的报道。本研究根据以前克隆的地黄RghBNG基因碱基序列[19]，利用Primer Premier 5.0设计特异引物，采用hiTAIL-PCR技术[20]克隆怀地黄纤维素合酶基因序列，用生物信息学方法对其进行分析，为进一步研究其分子作用机制和在地黄分子育种中的应用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

怀地黄85-5种植于河南师范大学生命科学学院试验田，取其新鲜块根用于提取DNA。

大肠杆菌DH5α菌株由笔者所在实验室保存，DNA凝胶回收试剂盒（上海生工服务有限公司）、Taq DNA聚合酶和DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司）及克隆载体pMD19-T （TaKaRa 公司），引物合成和基因测序分别由北京华大基因有限公司和上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2方法

1.2.1怀地黄基因组DNA的提取用CTAB法提取怀地黄基因组DNA，用紫外分析法和琼脂糖凝胶电泳方法检测基因组DNA的浓度、大小和纯度。

1.2.2引物设计与合成根据笔者所在实验室前期研究克隆的地黄RghBNG基因碱基序列（登录号为JX290370），利用Primer Premier 5.0设计3条下游特异引物，上游非特异性引物序列参见文献[20]（表1）。

1.2.3hiTAIL-PCR反应及检测根据Liu等的hiTAIL-PCR程序[20]略作改进。以怀地黄基因组DNA为模板，RH1分别与LAD1～LAD4配对，进行第1轮PCR反应，其反应液组分见表2，程序如下：93 ℃热启动2 min；95 ℃预变性 1 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，10个

表1所用引物名称及其序列

引物名称引物序列（5′→

反应成分用量（μL）第1轮第2轮第3轮 模板1.01.01.0dNTP预混物（各2.5 mmol/L）4.0 4.02.010×LA PCR缓冲液（加入Mg2+） 2.02.5 2.5TaKaRa公司的5 U/μL LA Taq 0.50.6 0.5100 pmol/μL上游引物1.0 0.30.610 pmol/μL下游引物 0.3 0.3 0.6水 11.2 16.3 17.8

1.2.4基因片段的克隆、测序按照TaKaRa公司的载体pMD19-T说明书，将回收的目的片段进行连接反应，连接液为5 μL，载体为0.5 μL，回收DNA的量为4.5 μL，共10 μL，16 ℃连接过夜。取10 μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，取细胞悬浮液涂布于含氨苄青霉素Amp的LB平板上，37 ℃倒置培养过夜，挑取菌落，进行PCR检测。将检测为阳性的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.5基因片段的生物信息学分析在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上运用BLAST软件进行目的基因的同源性搜索，并进行同源性比较。用MEGA 5的Neighbor-Joining 法构建系统进化树[15]。通过 NCBI 网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测氨基酸的保守域[14]。

2结果与分析

2.1地黄基因组DNA片段的扩增与电泳

用CTAB法提取怀地黄基因组DNA，经紫外分光度法和琼脂糖凝胶电泳方法分析符合后续试验要求后，用作模板，进行hiTAIL-PCR，共扩增出3个条带（图1）。

2.2地黄基因组DNA片段的回收、克隆与测序

用试剂盒回收图1中B片段，克隆至载体pMD19-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆测序，测序结果显示B片段长578 bp（图1）。

2.3地黄类纤维素合酶基因的ORF及其编码蛋白质氨基酸序列分析

利用 ORF Finder 分析B片段测序结果，发现其含有453 bp 开放阅读框，编码151个氨基酸（图2）。预测其编码蛋白质分子量约为18 ku，等电点为9.00，摩尔消光系数为34 045，不稳定系数为49.51，为略碱性的不稳定蛋白质。

2.4多序列比对与系统进化树分析

将测序所得的氨基酸序列在NCBI上进行BLAST比对分析，发现与已知10个物种的纤维素合酶基因及其编码的氨基酸序列高度同源（表3）。用软件MEGA 5构建的系统进化树（图3）表明，其与根癌土壤杆菌和土壤杆菌的亲缘关系最近。

2.5氨基酸保守域的预测

在NCBI 网站预测该氨基酸的保守域，发现其含有纤维表3地黄与其他物种纤维素合酶的同源性比较

物种GenBank登录号氨基酸同源性

（%）核苷酸同源性

（%）根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）WP_003506371.19991土壤杆菌（Agrobacterium sp.）WP_020011862.19991菜豆根瘤菌（Rhizobium phaseoli）WP_016734164.188—豌豆根瘤菌（R. leguminosarum）WP_003578482.188—三叶草根瘤菌（R. leguminosarum bv.trifolii） YP_002975124.187—费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）YP_005192181.186 —苜蓿中华根瘤菌（S. meliloti）YP_007193525.185 —中华根瘤菌（S. medicae）WP_018010495.184 —

素合酶催化亚单位（UDP-forming）的保守域（图4）。

3结论与讨论

本研究根据以前克隆的地黄RghBNG基因碱基序列[19]，利用Primer Premier 5.0设计特异引物，采用hiTAIL-PCR技术从怀地黄基因组DNA中扩增出A、B、C 等3条带，分别对其进行回收、克隆、测序和生物信息学分析。结果发现，B带大小为578 bp，含有453 bp的开放阅读框，编码151个氨基酸残基组成的蛋白质（另外2条带A和C的分析结果在此未呈现）。它与根癌土壤杆菌、土壤杆菌的纤维素合酶基因的同源性达81%～91%，其编码的氨基酸序列与根癌土壤杆菌、土壤杆菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌等纤维素合酶基因编

码蛋白质的氨基酸序列同源性达83%～99%，而且其编码的蛋白质具有纤维素合成酶的结构域。本研究首次从怀地黄中分离克隆了纤维素合酶基因，为研究其在地黄生长发育过程中的作用和地黄基因工程育种奠定了基础。该怀地黄DNA片段与其他植物纤维素合酶基因不同源，但与根瘤菌纤维素合成酶基因同源，可能是因为地黄生长发育过程中地黄块根与其根际根瘤菌共生而发生后者基因组DNA片段转移并整合到地黄基因组DNA中。但是，其具体形成原因有待进一步深入研究。

参考文献：

[1]Kim Y S，Ryuk J A，Ko B S. Discrimination of korean rehmannia glutinosa from Chinese Rehmannia glutinosa using sequence-characterized amplified region marker[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry，2012，55（1）： 1-6.

[2]Zhou Y Q，Gu F P，Zhou C N，et al.Genetic diversity of Rehmannia glutinosa cultivars based on sequence-relatedamplified polymorphism markers[J]. Scientia Horticulturae，2010，125：789-794.

[3]Peng S，Guo Y H，Qi J J，et al. Isolation and expression analysis of tuberous root development related genes in Rehmannia glutinosa[J]. Molecular Biology Reports，2010，37（2）： 1069-1079.

[4]Yang Y H，Chen X J，Chen J Y，et al. Differential miRNA expression in Rehmannia glutinosa plants subjected tocontinuous cropping[J]. BMC Plant Biology，2011，11：53-56.

[5]张中朋.地黄国际市场前景看好——中国地黄及其制品国内外市场简介[J]. 中药研究与信息，2005，7（4）：43-44.

[6]孙 鹏，郭玉海，祁建军，等. 地黄肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析[J]. 农业科学与技术，2008，9（2）：42-44，66.

[7]侯维海，孙鹏，陈全家，等. 地黄实时定量PCR内参基因的筛选[J]. 中国农学通报，2011，27（17）：76-82.

[8]孙鹏，郭玉海，祁建军，等. 地黄RgPR-10基因的克隆与表达[J]. 西北农业学报，2009，18（1）：300-304.

[9]Yang Y H，Chen X J，Chen J Y，et al. Identification of novel and conserved microRNAs in Rehmannia glutinosa L. by solexa sequencing[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2011，29（4）： 986-996.

[10]侯维海. 地黄ABA、GA和部分寡糖合成代谢关键酶基因克隆与表达分析[D]. 乌鲁木齐：新疆农业大学，2011.

[11]臧亚超，孙鹏，杨太新，等. 地黄扩展蛋白基因RgExpA1的克隆与表达分析[J]. 生物技术通报，2012（4）：69-73.

[12]周延清，姚换灵，段红英，等. 怀地黄基因片段及其中转座酶基因的克隆与序列分析[J]. 河南农业科学，2012，41（1）：106-109.

[13]周延清，张永华，陈艳梅，等. 怀地黄液泡质子泵焦磷酸水解酶基因的克隆与生物信息学分析[J]. 河南农业科学，2013，42（3）：107-111，114.

[14]周延清，张永华，张 喻，等. 怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析[J]. 中草药，2013，44（1）：76-84.

[15]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5： molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）： 2731-2739.

[16]Manning K，Wood D A. Production and regulation of extracellular endocellulase by Agaricus bisporus[J]. Microbiol，1983，129（6）：1839-1847.

[17]张智俊，杨洋，何沙娥，等. 毛竹纤维素合成酶基因PeCesA的克隆及组织表达谱分析[J]. 园艺学报，2010，37（9）：1485-1492.

[18]田志坚，易蓉，陈建荣，等. 苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析[J]. 作物学报，2008，34（1）：76-83.

[19]张永华. 地黄基因RgVP、RglKAT与RghBNG的克隆和表达[D]. 新乡：河南师范大学，2013.

[20]Liu Y G，Chen Y L. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J]. BioTechniques，2007，43（5）： 649-650，652，654 .