鱼蛋白多肽水溶肥对韭菜品质和土壤微生物的影响

黄娜 柳建良 马路凯 庄姗姗 刘袆帆

摘要：鱼蛋白多肽水溶肥广泛应用于广东省河源地区鹰嘴蜜桃的种植，其具有提高鹰嘴蜜桃的脆性、提蜜、抑菌和生根等的作用，是一种功能型肥料。本研究想进一步了解鱼蛋白多肽水溶肥在园艺作物上对土壤微生物的影响。以鱼蛋白多肽水溶肥作为研究对象施用在韭菜中，试验分为2组，期间进行叶片测定基础指标，施肥后取土壤进行土壤酶活性与土壤微生物测定。结果表明，鱼蛋白多肽水溶肥的基础指标符合行业水溶肥的标准。在种植韭菜期间能保持较好的土壤氮磷钾量水平，不仅表现出持续稳定的供应能力，还促进了各种生长相关土壤酶的分泌及活性的提高，还提升了韭菜的可溶性糖含量并促进了叶片的生长。对施肥后的土壤微生物进行16S rDNA分析结果表明，鱼蛋白多肽水溶肥中的拟杆菌属与硬壁门菌都具有促进土壤养分分解的能力。变形菌包括很多好氧或兼性细菌，通常具有对土壤污染物的降解能力。鱼蛋白多肽水溶肥可以抑制有害菌的活性，如己科河菌门、迷踪菌门、匿杆菌门、红杆菌科与根瘤菌科活性；还可以提高有益菌的活性，如梭杆菌门、普雷沃氏菌属与伯克霍尔德氏菌属。鱼蛋白多肽水溶肥还能够有效地促进蛋白质和碳水化合物的分解，从而提高土壤中有机物的利用率。

关键词：鱼蛋白多肽水溶肥；土壤微生物；16S rDNA测序；韭菜

中图分类号：S633.306  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）08-0209-10

收稿日期：2023-04-28

基金项目：国家重点领域研发计划（编号：2019B020238003）。

作者简介：黄 娜（1996—），女，广东丰顺人，硕士，主要从事果树生理生态研究工作。E-mail：1174609706@qq.com。

通信作者：柳建良，教授，主要从事果树生理生态研究工作。E-mail：Liujl1963@126.com。

鱼蛋白多肽水溶肥广泛应用于鹰嘴蜜桃的种植，其具有提高鹰嘴蜜桃的脆性、提蜜、抑菌和生根等作用，是一种功能性肥料。功能性肥料又被叫作多功能肥料［1］，是将作物营养与其他限制作物高产的因素相结合的肥料，可以提高肥料利用率［2］，提高单位肥料对农作物增产的效率［3-4］。鱼蛋白多肽水溶肥主要成分是EM菌［5-6］，其主要是以光合细菌、乳酸菌、酵母菌和放线菌为主的10个属、80多个微生物复合而成的一种微生物菌制剂。其作用机制是EM菌和病原微生物争夺营养形成竞争，因为EM菌可以在土壤中生存与繁殖，能较快而稳定地占据土壤中微生物的生态地位，形成有益的微生物菌群，从而控制病原微生物的繁殖和对作物的侵袭。其主要作用是改善土壤理化性状、促进植物吸收、分泌植物生物激素、调节作物生长、增强植物抗逆性等。

多功能肥料的研究和生产符合生态肥料工艺学的要求，其应用技术属于将农学、土壤学、信息学、化学等多种学科交叉提炼的先进性技术。功能性肥料主要包括高利用率肥料［7-9］、改善水分利用率肥料、改善土壤结构的肥料［10］、适应于优良品种特性的肥料［11］、改善作物抗倒伏特性的肥料［12］、具有防治杂草功效的肥料以及具有抗病虫害功能的肥料等。

有关韭菜功能肥料的研究和开发较少，国内外专家都做了许多工作，但目前大多处于起步阶段。为了完善肥料在园艺作物上的研究和开发，本试验研究使用鱼蛋白多肽水溶肥在种植期间是否具有保持较好的土壤氮磷钾量水平，表现出持续稳定的供应能力，是否具有提升园艺作物品质、抑菌和生根等特性，是否可以促進土壤中微生物群落。研究结果将为以后研究功能肥料提供一定的理论基础和参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究供试的鱼蛋白多肽肥4.0版本购自河源中科生物科技有限公司，供试的韭菜种子购于淘宝网种子旗舰店。

1.2 试验方法

将购买的鱼蛋白多肽水溶肥进行基础指标、重金属元素指标的测定，重复测定6次；进行鱼蛋白多肽水溶肥的多肽测序，提取多肽分子进行抑菌试验，重复3次；随后使用16S rDNA技术进行肥中微生物测定，重复6次。

将鱼蛋白多肽水溶肥施用于韭菜中，试验分为2组：自来水浇灌组（CK）和鱼蛋白多肽水溶肥组（A），每组重复6次，在韭菜生长周期中施肥3次。其间测定叶片基础指标与叶绿素含量（SPAD值）；结束施肥后取土壤进行土壤酶活性测定，并用16S rDNA测定土壤微生物变化情况，每组重复6次。

1.3 试验测定方法

1.3.1 抑菌试验

采用牛津杯法测定鱼蛋白多肽水溶肥和提取后的鱼蛋白多肽水溶肥小分子肽冻干粉的抑菌圈直径。将对数生长期的炭疽杆菌、绿色木霉菌以及从青橘上提取分析的霉菌丝，稀释成浓度大约为106 CFU/mL，取200 μL稀释后的菌液均匀地涂抹在固体培养基上，放置好已灭菌的牛津杯，制成含菌平板，3次重复。

取鱼蛋白多肽水溶肥原液，用无菌水稀释30、50倍的溶液。将提取后的鱼蛋白液体肥小分子肽冻干粉配制成8.00 mg/mL后，等比例稀释成4.00、2.00、1.00 mg/mL。分别取上述样品溶液200 μL加入到牛津杯中，28 ℃培养24 h后测定抑菌圈直径（mm）。出现抑菌圈的最低样品浓度即为最小抑菌浓度。

1.3.2 可溶性蛋白含量的测定

可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法［13］测定。

1.3.3 可溶性糖含量的测定

可溶性糖含量采用3，5-二硝基水杨酸法［14］测定。

1.3.4 还原性谷胱甘肽（GSH）含量的测定

还原性谷胱甘肽（GSH）含量采用试剂盒测量。

1.3.5 土壤微生物宏基因组测序

根据16S rDNA/ITS2序列中的保守区域设计相应引物，以提取好的微生物总DNA为模板，使用Phusion酶进行一步法PCR，通过PCR在目标区域扩增产物上添加测序通用接头和样本特异性Barcode序列。PCR扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行回收。纯化后的PCR产物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量。最后，使用Illumina测序平台（250PE）按照标准操作进行双端测序。测序得到原始的数据则利用overlap技术获得高质量的数据。采用DADA2进行聚类，进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析等。

1.4 统计分析

统计分析数据以3次重复的平均值表示。采用SPSS 17.0软件进行单因素邓肯多重范围检验，计算不同参数均值之间的显著性差异（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 鱼蛋白多肽水溶肥的营养物质组成

2.1.1 鱼蛋白多肽水溶肥的基础指标

由表1可知，鱼蛋白多肽水溶肥，pH值（1 ∶300倍稀释）为4.95～5.20，游离氨基酸含量为18.84 g/L，小分子肽含量为1.73 g/L，水不溶物含量为16.297 g/L，总氮含量为151.969 g/L。

2.1.2 鱼蛋白多肽水溶肥的元素含量分析

通过ICP（电感耦合等离子体）检测手段对鱼蛋白多肽水溶肥的元素含量进行检测［15］。检测鱼蛋白水溶肥中14种元素（N、As、B、Ca、Cr、Cd、Hg、K、Mg、Mn、P、Pb、S、Zn）的含量。由表2可知，鱼蛋白多肽液体肥中氮含量为15 196 mg/kg，钾和钙的含量分别为 3 407.5、1 583.6 mg/kg。

由表3可知，鱼蛋白多肽水溶肥重金属含量均小于0.5 mg/kg，远远小于重金属限量指标，说明鱼蛋白多肽水溶肥中的重金属元素的指标均符合NY 884—2012《生物有机肥》中重金属限量，不存在重金属元素污染问题，能更好地保护环境。

2.1.3 鱼蛋白多肽水溶肥的多肽测序

采用LC-MS/MS对鱼蛋白多肽水溶肥的多肽组分进行表征，具有高分辨率的LC-MS/MS能够有效降低误差。由表4可知，通过LC-MS/MS分析，一共得到了10个蛋白质以及66个多肽序列，其中以coL1A2Ⅰ型胶原蛋白α2链（序列1）、coL1A3Ⅰ型胶原蛋白α3链（序列2）、coL1A16Ⅰ型胶原蛋白α3链（序列3）中的多肽序列较多，分别为25、13、13个肽段。

2.1.4 抑菌活性

采用牛津杯法测定鱼蛋白液体肥和提取后的鱼蛋白液体肥小分子肽冻干粉的抑菌圈直径。由表5可知，鱼蛋白液体肥和提取后的鱼蛋白液体肥小分子肽均有显著抑菌效果，其液体肥原液抑菌圈直径与小分子肽提取液的抑菌圈直徑范围相似，进一步说明鱼蛋白水溶肥是通过小分子肽进行抑菌的［16］。以上结果表明，鱼蛋白多肽水溶肥可以在植物生长过程中具有抑菌作用，可以减少有害菌的活性，从而保护植物的正常生长。

2.1.5 鱼蛋白多肽水溶肥的微生物群体结构

采用16S rDNA对鱼蛋白水溶肥中所有的细菌进行高通量测序，研究鱼蛋白水溶肥中微生物群体的组成、微生物群体的多样性、丰富度和群体结构，以及探究微生物与环境之间的关系。由图1-a可知，鱼蛋白水溶肥中含有361个特征值丰度，在2次的测量中，可以看出有143个特征值峰度保持不变。由图1-b可知，鱼蛋白水溶肥中在门水平的3个主要的微生物群落，其中拟杆菌门占50%左右，厚壁菌门占30%左右，变形菌门占30%左右。由图1-c可知，在属水平上微生物群体种类较多，生物群体的多样性、丰富度及群体结构都较为丰富，其中主要为苍白杆菌属、乳杆菌属、戴阿利斯特杆菌属、无色杆菌属、梭状芽孢杆菌属。

2.2 鱼蛋白多肽水溶肥对韭菜的影响

2.2.1 蛋白多肽水溶肥对土壤氮磷钾的影响

由表6可知，施肥组的速效氮、有效磷、速效钾的含量分别是43.58、200.39、122.00 mg/kg。CK组与施肥组对比，具有显著差异，土壤的肥力下降。施鱼蛋白多肽水溶肥组，土壤的氮磷钾含量均高于土壤初始值，说明鱼蛋白多肽液体肥在种植期间能保持较高的土壤氮磷钾量水平，表现出持续稳定的供应能力，具有显著差异，不仅仅只是功能性肥料的作用。

2.2.2 鱼蛋白多肽水溶肥对土壤酶活的影响

土壤的酶活性在作物生长、养分吸收等方面具有非常重要的作用。由表7可知，土壤脲酶、纤维素酶、酸性磷酸酶的活性初始值分别是0.58、40.17、135.41 U/g；对照组的脲酶、纤维素酶、酸性磷酸酶活性分别是0.70、45.94、142.58 U/g；施肥组的脲酶、纤维素酶、酸性磷酸酶的活性分别是0.95、57.52、142.62 U/g。

鱼蛋白多肽水溶肥对土壤脲酶、纤维素酶、酸性磷酸酶的活性有明显的提高作用，可能与微生物群落活化导致了其分泌的酶含量增加有关［17］。

2.2.3 鱼蛋白多肽水溶肥对韭菜品质的影响

由图2可知，从肉眼观察发现，鱼蛋白多肽水溶肥在一定程度上能促进韭菜的叶片生长。由表8可知，鱼蛋白多肽水溶肥明显改善了韭菜的营养品质。与CK组相比，施肥组维生素C含量、蛋白质含量以及还原型谷胱甘肽含量、叶片长度及根长均具有显著差异；其中施肥组的可溶性糖含量显著高于对照组，有较大的差异。

由图3可知，鱼蛋白多肽水溶肥对韭菜叶片叶绿素含量具有不同程度影响。在10 d之前叶绿素含量都在上升，而到了10 d之后叶绿素含量开始下降，这可能和韭菜的生长期有关。但总的来说，施肥后叶绿素含量显著升高。韭菜氮含量在施肥后开始缓慢上升，这可能与EM菌分解土壤成分、促进脲酶吸收代谢有关，有利于促进氮素从根部向叶片的输送，增加氮素在叶片中的积累和分配。

2.3 土壤微生物的影响

2.3.1 样品扩增子序列变异（ASV）及其丰富度分析

Venn图可以显示多个样品ASV共有数量，直观展示样品间ASV的重叠情况。由图4-a可知，图中F、CK、A 3个组共产生了11 961个ASV，3组中共有ASV数量14个，其特有的ASV数量分别为571、4 971、4 239个。这说明施肥后会在一定程度上抑制某些菌的活性。由图4-b可知，A组与CK组距离较近，与F组样品距离较远。A组与CK组距离越近，则说明这2组之间的微生物组成结构越相似，差异性越小；反之，A组与F组样品距离较远，则说明这2组之间的微生物组成结构差异较大。

如图5-a所示，图中曲线趋于平缓，则证明测序数据量已饱和。如图5-b所示，A组与CK组的丰富度较高，F组的丰富度较低。每个组的物种等级曲线都比较平坦，均匀度较好。

2.3.2 土壤微生物组成分析

对各组物种组成进行聚类分析，由图6可知，A组与CK组的组成成分较为相似，F组与CK组、A组的组成成分差距较大。

通过与数据库进行对比，对操作分类单元（OTU）进行物种分类并在门、属水平上对各个样品做物种组内相对含量柱状图。如图7-a所示，在门的分类水平上，鉴定到的几种主要菌分别是变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actincbacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）等。其中，施用鱼蛋白多肽水溶肥能够增加疣微菌门、拟杆菌门、放线菌门的含量，变形菌门的含量保持不变。如图7-b所示，在属的分类水平上， 鉴定到的几种主要的菌分别是普雷沃氏菌属（Prevotella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、产黄杆菌属（Rhodanobacter）、戴阿利斯特杆菌属（Dialister）等。其中，施用鱼蛋白多肽水溶肥能够减少产黄杆菌属与假单胞菌属（Pseudomonas）的含量。

如图8-a所示，在门水平下，己科河菌门（Rokubacteria）、迷踪菌门（Elusimicrobia）、匿杆菌门（Latescibacteria）在CK组中丰度较高，而在F、A组中丰度较低，说明使用鱼蛋白多肽水溶肥能够在一定程度上抑制土壤中这3种微生物的活性。梭杆菌门（Fusobacteria）在A组中丰度较高， 在CK组中大部分丰度较低。

如图8-b所示，在属水平下，假单胞菌属（Pseudomonas）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、副球菌属（Paracoccus）、无色杆菌属（Achromobacter）在A组的丰度较高，而在CK组则丰度较低。由于假单胞菌、苍白杆菌属于益生菌，说明施肥后可增加土壤中益生菌的丰度。

3 讨论

3.1 魚蛋白多肽水溶肥

自然界中各种植物的养分供给库是土壤，土壤为植物生长发育提供所需的基础养分，例如大量元素与微量元素。大量元素为钾、磷，可以防止叶片边缘黄化枯焦和植株矮小等；中量元素为钙、镁、硫，可以防止生长异常；微量元素为硼、锰、锌，主要与植株新叶色泽或者果实结实有关。在土壤的复杂体系中，使用鱼蛋白多肽液水溶肥能稳定地提供多种元素。这与路书山等研究的水溶肥基本指标［18］相似，说明鱼蛋白多肽水溶肥能保持较好的土壤氮磷钾水平，表现出持续稳定的供应能力，且重金属元素的指标符合标准，不存在污染情况。

鱼蛋白多肽水溶肥中主要含有coL1A2Ⅰ型胶原蛋白α2链、coL1A3Ⅰ型胶原蛋白α3链、coL1A16Ⅰ型胶原蛋白α3链3类Ⅰ型胶原蛋白，其主要参与细胞的增殖、分化、迁移和信号传递等生理生化行为，对组织细胞等起着支撑、修复、保护的作用［19］，且容易被水解，水解后在土壤中的吸收利用率可以提高，从而促进植物对其他蛋白质的吸收。对小分子肽进行抑菌试验，结果表明，鱼蛋白多肽水溶肥中的小分子肽可以形成抑菌圈，这与李娜等的研究结果［20］一致。小分子肽具有一定的抑菌作用，可以运用于因烧烫伤造成的组织损伤和感染性伤口。鱼蛋白多肽水溶肥可以在植物生长过程中具有抑菌作用，可以减少有害菌的活性，从而保护植物的正常生长。

3.2 鱼蛋白多肽水溶肥中微生物

鱼蛋白水溶肥中在门水平上3个主要的微生物群落为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门，这与赵娜娜等在液体水溶肥中检测的微生物菌体结构［21-22］相似，但鱼蛋白多肽水溶肥中的拟杆菌门与厚壁菌门含量较多。鱼蛋白多肽水溶肥可以促进土壤养分分解的能力，还具有土壤污染物的降解能力。因为其主要由普雷沃氏菌等组成，普雷沃氏菌属主要帮助分解食物中的蛋白质和碳水化合物，苍白杆菌是具有鞭毛的革兰阴性需养菌为条件致病菌，乳酸菌属是使用最广泛的益生菌之一，而戴阿利斯特杆菌属是人体肠道菌群中的一种常见菌种，说明鱼蛋白多肽水溶肥能够有效分解蛋白质和碳水化合物。

3.3 鱼蛋白多肽水溶肥对韭菜品质与土壤酶活性的影响

韭菜的食用部位主要是叶片和花薹，其中含有多种人体必需的营养成分。韭菜的辛辣香味是其体内所含有的硫化物导致的，具有消炎杀菌功效，使其促进肠胃的消化［23］，对人体健康起着重要作用。本研究中，鱼蛋白多肽水溶肥是将鱼下脚料、花生麸、豆粕等在EM菌酵解后，将大分子蛋白质分解成小分子的多肽和氨基酸，从而提高施肥后的养分供应，微生物菌群通过调节肥料发酵液的pH值，保持一定的稳定生长环境。

本研究中，在种植期间，蛋白多肽水溶肥能保持较好的土壤氮磷钾水平，表现出持续稳定的供应能力。本研究结果与包梓依研究氮磷钾含量对植物生长影响的结果［15］相似，不仅促进各种生长相关土壤酶的分泌及活性的提高，还改善了韭菜的营养品质，与顾亮等研究液态肥对韭菜的营养品质的结果［24］相似，说明鱼蛋白液体肥具有提高韭菜品质的效果。其在一定程度上抑菌的作用，与李振华等对土壤酶活性的研究结果［25-27］相似，说明鱼蛋白多肽水溶肥能促进各种生长相关土壤酶的分泌以及提高土壤酶活性。

3.4 鱼蛋白多肽水溶肥对土壤微生物的影响

研究结果表明，A组与CK组土壤微生物处在比较适宜的环境中，有利于微生物的生长和繁殖，物种的丰富度程度就升高。F组作为水溶性肥料具有较高的pH值，大量微生物不太适宜在水溶性肥中生存。施肥后的土壤比不施肥组的土壤微生物丰富度低，可能是因为鱼蛋白多肽水溶肥中的小分子肽具有抑菌效果，推断鱼蛋白多肽水溶肥抑制了土壤细菌的活性，从而减小了物种丰富度。说明在使用鱼蛋白多肽水溶肥后，改变了土壤中微生物的组成，从侧面说明鱼蛋白多肽水溶肥可以抑制某些菌的活性。

本研究结果表明，施用鱼蛋白多肽水溶肥能够增加疣微菌门、拟杆菌门、放线菌门的含量，变形菌门保持不变。在肥料中含有大量的厚壁菌门，但其在土壤中较难存活，说明厚壁菌门不会影响土壤微生物环境。普雷沃氏菌主要是帮助分解蛋白质和碳水化合物［28］。伯克霍尔德氏菌是一种存在于水、土壤、植物中的革兰氏阴性细菌，具有生物防治、促进植物生长和生态修复等功能［29］。红杆菌科是光合细菌下的紫色非硫细菌［30］，具有降低水体中化学需氧量（COD）的作用。根瘤菌从根瘤细胞中摄取它们生活所需要的水分和养料［31］，它能固定游离氮，合成含氮化合物，被豆科植物利用。其中普雷沃氏菌属与伯克霍尔德氏菌属相对丰度在施肥组的土壤中增加，使得韭菜土壤中的微生物菌落改变，说明使用鱼蛋白多肽水溶肥可以提高土壤中有益菌的活性，从而促进植物生长。己科河菌门参与亚硝酸盐氧化，是新型土壤细菌，具有多样的生物次级代谢物基因［32］，是土壤中的有益菌；有研究表明，迷踪菌门等微生物的丰度与土壤硝态氮含量显著相关［33］。梭杆菌代谢的副产物可以促进其他细菌种类的生长，说明施肥后能增加其益生菌活性。本研究发现，在属水平上，鱼蛋白多肽水溶肥处理的土壤中乳杆菌属［34］、韦荣氏球菌属、假单胞菌属、普雷沃氏菌属的相对丰度增加，其为酸性微生物，猜测由于鱼蛋白多肽水溶肥使得土壤pH值处在5左右［35］，属于酸性土壤范围，使得碱性微生物减少。

总体而言，本研究表明，鱼蛋白多肽水溶肥具有抑制有害菌活性的作用，如己科河菌门、迷踪菌门、匿杆菌门；可以提高有益菌活性，如梭杆菌门、普雷沃氏菌属与鞘胺醇单胞菌属。鱼蛋白多肽水溶肥还能够有效地促进蛋白质和碳水化合物的分解，从而提高土壤中有机物的利用率。

4 结论

鱼蛋白多肽水溶肥的基础指标符合行业水溶肥的标准，其重金属元素的指标均符合NY 884—2012中重金属限量。鱼蛋白多肽水溶肥和提取后的小分子肽均有显著抑菌效果，说明鱼蛋白水溶肥是通过coL1A2Ⅰ型胶原蛋白α2链、coL1A3Ⅰ型胶原蛋白α3链、coL1A16Ⅰ型胶原蛋白α3链等3种小分子肽产生抑菌作用的。

鱼蛋白多肽水溶肥中的拟杆菌属与硬壁门菌都具有促进土壤养分分解的能力。变形菌包括很多好氧或兼性细菌，通常对土壤污染物具有降解能力。

在种植期间，蛋白多肽水溶肥能保持较高的土壤氮磷钾水平，表现出持续稳定的供应能力。不仅促进了各种生长相关土壤酶的分泌及活性的提高，还改善了韭菜作物的营养品质，在一定程度上起到抑菌的作用。

鱼蛋白多肽水溶肥具有抑制有害菌活性的作用，如己科河菌门、迷踪菌门、匿杆菌门、红杆菌科与根瘤菌科；可以提高有益菌活性，如梭杆菌门、普雷沃氏菌属与伯克霍尔德氏菌属。鱼蛋白多肽水溶肥还能够有效地促进蛋白质和碳水化合物的分解，从而提高土壤中有机物的利用率。

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