脂肪干细胞及其衍生物促慢性创面愈合的研究进展

王一 龚思宇 姜笃银

[摘要]慢性创面一直是临床治疗中十分棘手的难题。脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells， ADSCs）因来源丰富，分离简单且容易扩增，多次传代后仍能保持其生物学特性等优点，已成为近年组织修复与再生研究的热点，利用ADSCs促进创面愈合也已被证明是一项十分具有前景的治疗策略。本文对ADSCs及其无脂肪细胞衍生物促慢性创面愈合的研究现状进行综述，以期为今后深入研究和临床应用提供参考。

[关键词]脂肪干细胞；慢性创面；无脂肪细胞衍生物；糖尿病；组织修复与再生

[中图分类号]R641    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）04-0179-04

Research Progress of Adipose-derived Stem Cells and Their Derivatives Promoting Chronic Wound Healing

WANG Yi1，2， GONG Siyu3， JIANG Duyin1，2

（1.Emergency Medical Center， the Second Hospital of Shandong University， Jinan 250033， Shandong， China; 2.Department of Burn and Plastic Surgery， the Second Hospital of Shandong University， Jinan 250033， Shandong， China; 3.Basic Medical College of Jining Medical University， Jining 272067， Shandong， China）

Abstract： Chronic wounds have always been a difficult problem in clinical treatment. Adipose-derived stem cells （ADSCs） have become a hot topic in tissue repair and regeneration research in recent years due to their rich sources， simple isolation and easy expansion， and their properties after multiple passages. The use of ADSCs to improve wound healing has proven to be a promising treatment strategy. In this paper， the research status of ADSCs and their fat cell derivatives for chronic wound healing is reviewed， with a view to providing insights for future in-depth research and clinical applications. In this paper， we reviewed the research status of ADSCs and its adipocyte free derivatives in promoting chronic wound healing， in order to provide insights for further research and clinical application.

Key words： adipose-derived stem cells; chronic wound; adipose cell-free derivatives; diabetes; tissue repair and regeneration

慢性創面会导致患者生活质量降低、残疾甚至死亡，因此，慢性创面的修复是烧伤及整形医师常面临的棘手的临床问题和重大挑战，需要开发新的治疗方法以改进现有治疗手段。在各种干预策略中，干细胞是一种颇有前景的治疗手段，其中ADSCs和骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells， BM-MSCs）已在临床前和临床条件下进行了研究[1]。虽然研究人员很早便认识到ADSCs对创面修复的重要意义，但至今仍然无法对ADSCs在慢性创面愈合过程中的作用进行精确干预和调控。尽管如此，ADSCs在相关领域的研究基础，为慢性创面治疗提供了新的发展前景和可能性。

1  ADSCs的提取方法和生物学特性

1.1 ADSCs的提取方法：自上个世纪60年代，Rodbell等尝试从脂肪组织中分离细胞以来，人类对脂肪组织及其提取物的研究不断深入，直到2002年Zuk等从脂肪组织中分离提取并证实了干细胞的存在，将其正式命名为ADSCs。典型的ADSCs分离程序包括用胶原酶消化脂肪抽吸组织、离心，继而产生高密度基质血管组分（Stromal vascular fraction， SVF），然后进行传代培养，最终将ADSCs分离提取出来[2]。采用直接消化法和干细胞基质胶消化法分离提取ADSCs，分别进行细胞表型鉴定、增殖活性检测和成脂/成骨分化检测，对比后证实了基质胶消化法比直接消化法分离得到的ADSCs有更好的成脂分化能力，其成脂诱导分化的标志基因-PPAR-γ mRNA和蛋白表达水平更高[3]。

现有的研究方法需在获取脂肪前处死小鼠，但该操作会影响提取细胞的数量及活性，针对此问题，有研究人员[4]从小鼠腹膜外及腹股沟处分离脂肪组织，采用胶原酶消化获得ADSCs，鉴定后证实从活体小鼠组织中获取ADSCs可行且细胞质量较好。该提取过程耗时较少、成本较低，且提取的ADSCs纯度高、状态好，是一种较为理想的小鼠ADSCs提取方法，可广泛应用于干细胞的相关研究。

1.2 生物学特性：ADSCs在一定条件下可分化为脂肪细胞、肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞及血管内皮细胞等，是一种类似于BM-MSCs的多能干细胞，具有很强的自我更新能力、多向分化潜能和旁分泌功能，主要参与机体组织细胞修复，促进细胞再生。与其他间充质干细胞相比，ADSCs生物活性更稳定，且具有更强的增殖能力；此外，脂肪组织中高含量ADSCs可避免长期体外培养，可能比BM-MSCs更适合同种异体移植。ADSCs可以增殖和分化为皮肤细胞以修复受损或死亡的细胞，也可以通过自分泌和旁分泌多种细胞因子，如转化生长因子-β（Transfer growth factor-β， TGF-β）、肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor， HGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor， bFGF）、基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1， SDF-1）等[5]，激活细胞再生和愈合过程。在创面愈合过程中，ADSCs在向真皮成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞分化的基础上，能够快速迁移到创面。此外，ADSCs是维持皮肤结构和功能的细胞外基质（Extracellular matrix， ECM）蛋白的主要来源[6]。由于ADSCs容易从皮下脂肪组织获得，具有易于大量获取、操作简便、损伤较小、无免疫原性等优点[7]，使得ADSCs成为创面修复和组织再生中最具吸引力的MSCs来源。

2  ADSCs促慢性创面愈合机制

创面修复大体可分为炎症反应期、肉芽组织形成期和组织塑形期的三个阶段，需要多种细胞及ECM组分和多种生长因子、细胞因子的协同参与。ADSCs促进慢性创面愈合的机制可能有以下三个方面：①ADSCs在创面局部直接分化为皮肤的修复细胞，如成纤维细胞、角质形成细胞等；②通过旁分泌作用，分泌多种生长因子，如：TGF-β、VEGF、角质形成细胞生长因子（Keratinocyte growth factor， KGF）和成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor， FGF）等，这些生长因子已被证明参与创面愈合过程并发挥重要作用[8]；③通过抗氧化作用，捕获缺血缺氧组织局部的自由基，保护成纤维细胞免受氧化应激损伤[9]。

有研究人员[10]评估了ADSCs对烧伤创面愈合的影响，ADSCs不仅可释放多种促进创面血管形成的细胞因子改善创面血供，还可以增强成纤维细胞迁移和增殖并抑制增生性瘢痕成纤维细胞对胶原蛋白的分泌。同时，ADSCs还可以直接分化成皮肤干细胞以加速创面愈合，尽可能地缩短烧伤的愈合时间。由于ADSCs在体内移植后的低活性和低效率等缺点，人们做出了很多尝试，试图克服这些问题，新型材料的应用逐渐增多。壳聚糖、胶原、海藻酸盐、多肽和聚氨酯较为常见，但都有其局限性。由此可见，设计和合成新的具有较高生物相容性和生物活性的促创面愈合生物材料是我们目前迫切需要解决的问题。据报道，一氧化氮（NO）有助于促进干细胞的生物活性，Wu Y等[11]利用生物打印技术合成了一种高效的生物支架以负载ADSCs和NO（3D ADSCs/NO），其实验表明，3D-ADSCs/NO通过促进上皮化和胶原沉积加速了创面愈合。3D-ADSC/NO结构可能是严重烧伤创面愈合的一种新的治疗方法，但由于生物支架成本高且制备速度慢，并不适合治疗大面积创面。圆叶茅膏菜叶片分泌的黏附性水凝胶因为可以促进成纤维细胞的分化和附着，引起了研究人员的广泛兴趣，为了避免产量低等局限性，Sun L等[12]受圆叶茅膏菜启发合成了一种粘合剂水凝胶，其特征骨架含有重复的葡萄糖醛酸和甘露糖二聚体。这种水凝胶与ADSCs联合使用可以促进伤口愈合过程，在伤口修复的早期阶段优势明显。

除了生物材料的研发，近年来也出现了ADSCs与其他细胞的联用和诱导分化的相关研究。有研究表明，ADSCs、角質形成细胞与成纤维细胞三者的联用不仅可以显著促进多种参与创面愈合的细胞的增殖和迁移，ADSCs的干细胞特性在良好的微环境下也可分化为角质形成细胞与成纤维细胞，而角质形成细胞和成纤维细胞也表现出比单独使用时更优秀的再上皮化和ECM沉积。Zhou ZQ等[13]研究表明，通过体外调节结缔组织生长因子，可以诱导ADSCs分化为成纤维细胞，从而具有促进皮肤创面愈合的潜在应用价值。

3  ADSCs在糖尿病慢性创面治疗中的作用

高血糖状态可通过不同的机制导致创面难愈，神经源性感觉缺失可能会加剧创伤性组织丢失，而由于高血糖引起的细胞增殖受损和对生长因子的抵抗造成了创面上皮化不足，也可能会推迟创面愈合[14]。此外，糖尿病中巨噬细胞迁移受损和信号分子释放不足同样会抑制新血管的形成。因此，血管生成是创面愈合的关键部分，促进血管生成是糖尿病创面治疗的主要目标之一。角质形成细胞的增殖和迁移，即再上皮化，也是创面愈合的关键。ADSCs能通过旁分泌作用分泌多种生长因子，这些因子可以起到促进血管化和细胞存活的作用。但由于糖尿病患者创面闭合困难限制了ADSCs移植的疗效，目前迫切需要一种有效的方法来提高ADSCs的旁分泌功能以及其在糖尿病微环境中的存活率。

Marino G等[15]使用ADSCs治疗20例严重肢体缺血患者，其中18例为糖尿病合并下肢难愈性溃疡。将自体ADSCs注入患者下肢慢性溃疡边缘，监测第4、10、20、60、90天创面愈合情况，其中18例患者溃疡创面有临床改善。因此，对其他治疗方式不敏感的严重肢体缺血患者，多次注射自体ADSCs也许是有效选择。除移植自体ADSCs外，同种异体ADSCs也是治疗糖尿病足溃疡安全有效的措施，并且较自体ADSCs来源更广泛，有效避免了ADSCs分离过程中耗材多和分离效率低等问题，但临床治疗的长期安全性尚需证实[16]。目前，多数临床试验处于早期阶段，样本量小、随访时间短，需进一步观察和改进治疗方案[17]，相关问题也缺乏临床试验证实，如自体与同种异体移植ADSCs、不同部位或不同分离方法获取ADSCs的疗效差异等。

为了克服目前糖尿病创面治疗措施的局限性，研究人员在不断探索与ADSCs结合的组织工程学最佳组合。Exendin-4（Ex-4）是一种胰高血糖素样肽-1受体激动剂，对糖尿病皮肤创面的治疗有效。Seo E等[18]在糖尿病动物模型中证明了Ex-4联合ADSCs有着较好的治疗效果。除此之外，他们还发现ADSCs对内皮细胞和角质形成细胞都有促增殖作用，有助于促进糖尿病创面再上皮化和伤口愈合。Wang Q等[19]探讨了整合素β1在ADSCs促进伤口愈合中的作用及其机制，其在大鼠慢性难愈性创面模型上的实验结果证明，整合素β1的过表达明显缩短了愈合时间，提高了愈合率，验证了整合素β1可通过激活PI3K/AKT通路促进ADSCs迁移和内皮样分化从而促进创面愈合。由于缺氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor， HIF1α）在创伤愈合过程中起重要作用，Xu J等[20]研究探讨了高糖低氧条件下缺氧诱导因子1α过表达对ADSCs的影响。HIF1α过表达可显著增加高糖抑制的血管内皮生长因子A、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）和C-X-C基序趋化因子配体12的表达。在ADSCs中过表达HIF1α可减轻高糖诱导的小鼠主动脉内皮细胞增殖和迁移缺陷，并显著抑制ADSCs中活性氧（Reactive oxygen species， ROS）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）水平，从而减少细胞凋亡。在体内，移植前ADSCs中HIF1α的过表达显著增强了血管内皮生长因子的表达，促进了糖尿病小鼠创面的愈合。

在联合生物材料来增强ADSCs的生物活性方面，研究人员也做出了很多新的尝试。Tyeb S等[21]提出了将ADSCs移植到改良的抗氧化剂支架上的组合方法，即将ADSCs输送到包被层黏连蛋白（GSL）的抗氧化明胶-丝胶（GS）支架上。层黏连蛋白是一种促进血管生成的内皮基底蛋白，丝胶的加入提高了支架对氧化应激下细胞的保护作用。实验结果发现GSL-ADSC结合后促血管形成功能明显增强。Pak CS等[22]研究了儿茶酚功能化透明质酸 （Catechin-functionalized hyaluronic acid， CF-HA）贴片联合ADSCs对糖尿病小鼠模型的影响。在此研究中，他们发现HA-CA贴片联合ADSCs后表现出极佳的协同作用，促创面愈合作用更强。这种协同效应反映HA-CA贴片提高了ADSCs的再生能力，提供了出色的生物相容性、组织黏附性和更高的存活率，并使ADSCs最大限度地发挥了其旁分泌作用。

4  ADSCs衍生物在创面修复中的应用

ADSCs旁分泌细胞因子、外泌体和其他活性物质是发挥生物学效应的主要因素[23]。近年来，研究人员对ADSCs旁分泌活性的潜在影响进行了大量的研究，旨在研发新的慢性创面无细胞治疗方法。研究表明，脂肪无细胞衍生物的使用克服了ADSCs临床应用的局限性，并显示出许多优点，比如这些脂肪衍生物不含细胞，便于攜带、运输和储存，免疫原性低，无潜在致瘤性，可用于同种异体移植，这使得脂肪无细胞衍生物更适合于商业推广。脂肪无细胞衍生物包括ADSCs条件培养基（ADSCs-CM）、ADSCs来源的外泌体（ADSC-Exos）和无细胞脂肪组织提取物（adipose tissue extract，ATE），这些ADSCs衍生物被广泛应用于抗衰老、创面愈合、瘢痕修复、神经再生等方面的研究，为新出现的无细胞疗法开辟了道路。

有证据表明，ADSCs-CM能够发挥以下作用：①改变炎症阶段巨噬细胞炎症表型；②通过促内皮细胞分化和细胞迁移促进新血管生成；③在增殖和重塑阶段促进肉芽组织、皮肤细胞和ECM的形成。有研究表明ADSCs-CM和/或细胞外囊泡（Extracellular vesicles， EVs）促进愈合的体内外实验研究结果显示完全支持使用无细胞疗法治疗慢性难愈合创面。但其也表示需要在动物模型中进行更多同质性研究，以更好地确定ADSCs的诸多衍生物在皮肤创伤修复不同阶段的作用。另外，有研究发现ADSCs的衍生物能促进成纤维细胞的增殖和迁移，并加速成年大鼠缺血创面的愈合[24]。

ADSCs能够分泌丰富的外泌体，从而促使细胞增殖、分化和迁移以及改善创面微环境，在促进创面愈合方面有很好的疗效，这是通过多种细胞的增殖和迁移介导的。有研究表明ADSCs-Exos作为治疗药物的载体或复合支架可以促进脂肪移植存活，促进糖尿病患者的创面愈合[25]。He L等[26]研究表明含MALAT1的ADSC-Exos可能通过激活Wnt/β-catenin通路靶向miR124，从而促进皮肤创面愈合，这可能为皮肤创面愈合的治疗靶点提供新的思路。近几年创面材料的发展突飞猛进，各类高分子生物材料负载干细胞、细胞因子及外泌体后，其促进创面愈合的作用大大增强。负载ADSCs-Exos的各类创面材料在研究中证实了其修复伤口的作用。Jiang T等[27]将ADSCs-Exos负载到基质金属蛋白酶可降解聚乙二醇（MMPPEGo）智能水凝胶中，ADSC-exo@MMP-PEG智能水凝胶显著缓解了过氧化氢诱导的氧化应激损伤，因而这种智能水凝胶为糖尿病创面修复提供了一种新的治疗策略。综上所述，ADSCs-Exos在临床实践中有着广泛的应用前景。

5  小结和展望

慢性创面一直是临床工作中十分棘手的问题，以干细胞为基础的组织工程的出现为慢性创面的治疗带来了新的可能。ADSCs的多种优点已使其成为组织工程的理想种子细胞，各种研究证明ADCSs在创面修复领域潜力巨大。不含脂肪细胞的无细胞衍生物因避免了ADSCs的诸多局限性，为一种新出现的无细胞疗法开辟了道路，具有广阔的临床应用前景。最新研究也证明了皮片移植和皮瓣移植过程中应用ADSCs对移植效果的增益，由此可见，未来若联合更先进的人工真皮有望为创面修复提供更大的可能性和可操作性，以解决自体供皮不足等局限性难题。除此之外，未来的研究将集中于在适当的载体中使用ADSCs，以促进它们在伤口愈合应用中以及在组织工程器官和组织中直接或间接促进血管生成的潜力。

尽管ADSCs具有非常广阔的科研前景，基础实验与临床实践之间仍然有一定的差距。目前利用ADSCs对创面进行治疗的方法还有待改进和进一步探索，许多研究领域仍然需要进一步完善。如何改进ADSCs移植方式来避免注射疗法对干细胞疗法临床应用的限制，以及脂肪干细胞与其他相关细胞联用能否产生更好的效果期待下一步研究。除此之外，需要进一步探索更好的ADSCs分离方法、治疗指征以及ADSCs移植的远期并发症，最大限度地发挥新兴疗法的效益。ADSCs参与皮肤再生的分子机制也需要进一步的研究，以加深对创面微环境中炎症、氧化应激和细胞衰老等病理生理问题的理解，为未来创面修复和再生医学开辟道路。

[参考文献]

[1]Zhou Z Q， Chen Y， Chai M， et al. Adipose extracellular matrix promotes skin wound healing by inducing the differentiation of adiposederived stem cells into fibroblasts[J]. Int J Mol Med， 2019，43（2）：890-900.

[2]Zuk P A， Zhu M， Ashjian P， et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J]. Mol Biol Cell， 2002，13（12）：4279-4295.

[3]董乃隽，尹侃，李霄霞，等.不同提取方法对人脂肪间充质干细胞生物学活性影响[J/OL].青岛大学学报（医学版），2021，57（6）：791-795.

[4]董雨晴，吕梦竹，曹流，等.活体小鼠脂肪来源干细胞的获取与鉴定[J].中国美容整形外科杂志，2021，32（2）：119-121，133.

[5]Li P， Guo X. A review： therapeutic potential of adipose-derived stem cells in cutaneous wound healing and regeneration[J]. Stem Cell Res Ther， 2018，9（1）：302.

[6]Mazini L， Rochette L， Admou B， et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells （ADSCs） and mesenchymal stem cells （MSCs） in wound healing[J]. Int J Mol Sci， 2020，21（4）：1306.

[7]Holm J S， Toyserkani N M， Sorensen J A. Adipose-derived stem cells for treatment of chronic ulcers： current status[J]. Stem Cell Res Ther， 2018，9（1）：142.

[8]Aboulhoda B E， Abd EI Fattah S. Bone marrow-derived versus adipose-derived stem cells in wound healing： value and route of administration[J]. Cell Tissue Res， 2018，374（2）：285-302.

[9]Xia X， Chiu P W Y， Lam P K， et al. Secretome from hypoxia-conditioned adipose-derived mesenchymal stem cells promotes the healing of gastric mucosal injury in a rodent model[J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis， 2018，1864（1）：178-188.

[10]Zhang J， Liu Y， Chen Y， et al. Adipose-derived stem cells： current applications and future directions in the regeneration of multiple tissues[J]. Stem Cells Int， 2020，2020：8810813.

[11]Wu Y， Liang T， Hu Y， et al. 3D bioprinting of integral ADSCs-NO hydrogel scaffolds to promote severe burn wound healing[J]. Regen Biomater， 2021，8（3）：rbab014.

[12]Sun L， Huang Y， Bian Z， et al. Sundew-inspired adhesive hydrogels combined with adipose-derived stem cells for wound healing[J]. ACS Appl Mater Interfaces， 2016， 8（3）： 2423-2434.

[13]Zhou Z Q， Chen Y， Chai M， et al. Adipose extracellular matrix promotes skin wound healing by inducing the differentiation of adipose?derived stem cells into fibroblasts[J]. Int J Mol Med， 2019， 43（2）： 890-900.

[14]Tuhin R H， Begum M M， Rahman M S， et al. Wound healing effect of Euphorbia hirta linn. （Euphorbiaceae） in alloxan induced diabetic rats[J]. BMC Complement Altern Med， 2017，17（1）：423.

[15]Marino G， Moraci M， Armenia E， et al. Therapy with autologous adipose-derived regenerative cells for the care of chronic ulcer of lower limbs in patients with peripheral arterial disease[J]. J Surg Res， 2013，185（1）：36-44.

[16]Moon K C， Suh H S， Kim K B， et al. Potential of allogeneic adipose-derived stem cell-hydrogel complex for treating diabetic foot ulcers[J]. Diabetes， 2019，68（4）：837-846.

[17]Gadelkarim M， Abushouk A I， Ghanem E， et al. Adipose-derived stem cells： Effectiveness and advances in delivery in diabetic wound healing[J]. Biomed Pharmacother， 2018，107：625-633.

[18]Seo E， Lim J S， Jun J B， et al. Exendin-4 in combination with adipose-derived stem cells promotes angiogenesis and improves diabetic wound healing[J]. J Transl Med， 2017，15（1）：35.

[19]Wang Q， Zhang N， Hu L， et al. Integrin beta1 in adipose-derived stem cells accelerates wound healing via activating PI3K/AKT pathway[J]. Tissue Eng Regen Med， 2020，17（2）：183-192.

[20]Xu J， Liu X， Zhao F， et al. HIF1α overexpression enhances diabetic wound closure in high glucose and low oxygen conditions by promoting adipose-derived stem cell paracrine function and survival[J]. Stem Cell Res Ther， 2020，11（1）：148.

[21]Tyeb S， Shiekh P A， Verma V， et al. Adipose-derived stem cells （ADSCs） loaded gelatin-sericin-laminin cryogels for tissue regeneration in diabetic wounds[J]. Biomacromolecules， 2020，21（2）：294-304.

[22]Pak C S， Heo C Y， Shin J， et al. Effects of a catechol-functionalized hyaluronic acid patch combined with human adipose-derived stem cells in diabetic wound healing[J]. Int J Mol Sci， 2021，22（5）：2632.

[23]Vizoso F J， Eiro N， Cid S， et al. Mesenchymal stem cell secretome： toward cell-free therapeutic strategies in regenerative medicine[J]. Int J Mol Sci，2017，18（9）：1852.

[24]Zeppieri M， Salvetat M L， Beltrami A， et al. Adipose derived stem cells for corneal wound healing after laser induced corneal lesions in mice[J]. J Clin Med， 2017，6（12）：115.

[25]An Y， Lin S， Tan X， et al. Exosomes from adipose-derived stem cells and application to skin wound healing[J]. Cell Prolif， 2021，54（3）：e12993.

[26]He L， Zhu C， Jia J， et al. ADSC-Exos containing MALAT1 promotes wound healing by targeting miR-124 through activating Wnt/beta-catenin pathway[J]. Biosci Rep， 2020， 40（5）：BSR20192549.

[27]Jiang T， Liu S， Wu Z， et al. ADSC-exo@MMP-PEG smart hydrogel promotes diabetic wound healing by optimizing cellular functions and relieving oxidative stress[J]. Mater Today Bio，2022，16：100365.

[收稿日期]2023-05-29

本文引用格式：王一，龔思宇，姜笃银.脂肪干细胞及其衍生物促慢性创面愈合的研究进展[J].中国美容医学，2024，33（4）：179-182.