含有复合多肽的精华液改善皮肤衰老的功效研究

李生慧 于钰 张明月

[摘要]目的：研究含有復合多肽的精华液对于衰老皮肤的改善效果。方法：通过体外人成纤维细胞（Human skin fibroblast， HFS）细胞增殖实验、HFS中Ⅰ型胶原蛋白含量测定实验来观察其抗衰效果。人体评价采用随机双盲、自身左右、阴性对照试验。选取30名受试者，每日早晚分别使用试验样品和对照样品，分别在基线（D0）、第14天（D14）、第28天（D28）进行皮肤弹性值[皮肤粘弹性值（VE值）、皮肤杨氏弹性模量（E值）和皮肤回缩时间（R值）]测量、VISIA面部拍照和皮肤超声检测。第28天（D28）进行受试者主观评价。结果：体外实验结果显示试验样品具有显著促进HSF活力和Ⅰ型胶原蛋白生成的作用。人体评价结果显示，在使用试验样品和对照样品第28天后，试验侧皮肤弹性值与D0相比有明显改善（P＜0.001）；试验侧皮肤的毛孔计数值在D14、D28均低于基线值（P＜0.001），而对照侧不同时间点皮肤弹性值和毛孔计数值比较差异无统计学意义（P＞0.05）。皮肤超声观察结果显示，与D0相比，D28试验侧皮肤真皮层内高回声区域显著增加，真皮层密度提升，有效率为90%，优于对照侧。受试者主观评价显示，使用试验样品和对照样品28 d（D28）后，两侧皮肤水润度、细纹均有改善，差异无统计学意义（P＞0.05），试验侧皮肤紧实度、弹性改善程度明显优于对照侧（P＜0.05）。结论：试验样品能显著提升HFS活力，促进Ⅰ型胶原生成，显著改善面部皮肤弹性值，显著减小面部毛孔，增加真皮层密度，有助于改善皮肤衰老。

[关键词]复合多肽；衰老皮肤；成纤维细胞；皮肤弹性；皮肤超声

[中图分类号]TQ258    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）04-0065-05

Study on the Effect of Serum Containing Complex Peptides on Improving Skin Aging

LI Shenghui， YU Yu， ZHANG Mingyue

（Qingdao Youdo Bioengineering Co.，Ltd.， Qingdao 266100， Shandong， China）

Abstract： Objective  To observe the effect of serum containing complex peptides on aging skin. Methods  In vitro experiments， human skin fibroblast （HSF） cell proliferation experiment and determination of type Ⅰ collagen content in HSF.In humans， a randomized， double-blind， self-controlled trial with negative control was performed. Thirty subjects were selected， and the test product which contains complex peptides and control product without complex peptides were used in the morning and evening. Skin elasticity measurements， VISIA photography and skin ultrasound measurements were performed at baseline （D0）， day 14 （D14） and day 28 （D28）.Subject subjective evaluation was performed on day 28 （D28）. Results  In vitro experiment showed that the test sample could significantly promote the activity of human skin fibroblast （HSF） and the generation of type Ⅰ collagen. The results of human evaluation showed that the skin elasticity of the test side was significantly improved compared with that of D0 （P＜0.001） after 28 days of using the test sample and the matching product. Poreometer values of skin on the test side were lower than baseline values in D14 and D28 （P＜0.001）， but there was no significant difference in the properties and poreometer values at different time points in the control group （P＞0.05）. According to the skin ultrasound observation， after 28 days， compared with the baseline （D0）， the high-echo area in the dermis of the skin on test side was significantly increased， the dermis density was increased， and the effective case rate was 90%， which was significantly better than the control side . Subject subjective evaluation showed that after 28 days ， skin moisture and small wrinkles on both sides were improved compared with baseline value （D0） and without significant difference （P＞0.05）， skin firmness and elasticity on the test side were significantly better than those on the control side （P＜0.05）. Conclusion  The test samples can significantly enhance the HFS activity， promote the generation of type I collagen， significantly improve the elasticity of facial skin， significantly reduce facial pores， increase dermal density， and help to improve skin aging.

Key words： complex polypeptide; aging skin; fibroblast; skin elasticity; skin ultrasound

与年轻态皮肤相比，衰老皮肤更加干燥、黯淡，且多表现出一定程度的松弛皱纹及局部组织下垂[1]。研究数据显示，中国北方40～50岁女性面部皮肤弹性值随年龄增加呈下降趋势，50岁后面部皮肤弹性则呈现迅速下降趋势[2]。当皮肤老化时，真皮层成纤维细胞表现为数目减少、增殖能力减弱、代谢功能下降，弹性蛋白及胶原蛋白分泌量减少。因此，提升成纤维细胞活力，促进胶原蛋白合成可以提高皮肤的弹性和紧致度。多肽具有生物相容性好、水溶性好、分子量低等优点，同时还具有保护、修复受损细胞和促进细胞生长的功能[3]。本研究拟观察一种含有棕榈酰三肽-5、乙酰基六肽-8、三肽-1、乙酰基四肽-9等复合多肽精华液的面部抗衰作用，并用不含有复合多肽的安慰剂作为阴性对照，现报道如下。

1  资料和方法

1.1 样品：试验样品为多肽精华液[青岛优度生物工程有限公司自制，产品批号：D2211116，含有水（99.38%），透明质酸钠（0.1%），乙酰基六肽-8（0.0015%），棕榈酰三肽-5（0.015%），三肽-1（0.0012%），六肽-9（＜0.0012%），乙酰基四肽-9（＜0.0012%），防腐剂（0.5%）]。对照样品为不含多肽的安慰剂[青岛优度生物工程有限公司自制，产品批号：YFD221102，含有水（99.4%），透明质酸钠（0.1%），防腐剂（0.5%）]。

1.2 试剂与仪器：16000型胎牛血清，Gibco公司；C11995500BT型高糖DMEM培养基，Gibco公司；15140122型青霉素-链霉素溶液，Gibco公司；25200-056型胰蛋白酶-EDTA溶液，Gibco公司；ml057630型人Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）试剂盒试剂盒（96T），上海酶联公司；CM088-5HP型Recombinant TGF beta 1，Chamot公司。VISIA CR面部图像分析系统，美国Canfield公司；皮肤弹性、超声测试仪Dermalab Series Skin Lab Combo，丹麦Cortex公司。

1.3 体外实验方法

1.3.1 CKK-8法体外人皮肤成纤维细胞增殖实验：采用实验用人成纤维细胞，用CCK-8检测细胞毒性方法测试受试物的细胞毒性。用完全培养基将样品稀释为5%、3%、1%、0.1%、0.01%的浓度（%为体积分数），加入至融合度为20%的细胞中，培养24～48 h后，使用CCK-8试剂检测细胞存活率。

细胞活力（%）=[A（样品）-A（空白）]/[A（0）-A（空白）]×100%

式中：A（样品）为具有细胞、CCK-8溶液和样品溶液的孔的OD值；A（0）为具有细胞、CCK-8溶液而没有样品溶液的孔的OD值；A（空白）为没有细胞的孔的OD值。

1.3.2 ELISA法检测Ⅰ型胶原蛋白含量：将来自冷冻保存的细胞稳定传代两次后接种于96孔板，于37℃ 5% CO2的培养箱中培养过夜，弃掉96孔板中的培养基，根据细胞增殖实验结果选择1%、0.1%、0.01%浓度的测试样品与100μg/ml TGF-β1作为阳性对照进行Ⅰ型胶原蛋白含量测定，空白对照组为完全培养基组。每组设置3个平行组，开展给药操作。给药完毕后将96孔板放置在CO2培养箱中培养培养（24±2）h孵育结束后，按照人Ⅰ型胶原酶联免疫试剂盒的使用方法进行检测，用酶标仪在450 nm处测定各样本孔的吸光值[4]。以吸光度OD值为横坐标（X），相应的待测物质标准品浓度为纵坐标（Y），做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。最终取各组3个复孔的平均值作为最终的Ⅰ型胶原蛋白结果。Ⅰ型胶原蛋白上调率计算公式：上调率（%）=（T/C-1）×100%。式中：T为受试物Ⅰ型胶原蛋白含量平均值；C为空白对照Ⅰ型胶原蛋白含量平均值。

1.4 人体评价方法

1.4.1 纳入标准：①根据《人体皮肤衰老评价标准》（TB/ZGKSL 001-2022）皮肤衰老量表，入选者皮肤机械力学状态符合中度至重度标准[5]：皮肤的饱满充盈消失，皮肤轻度到中度松弛，弹性明显降低，皮肤轻度下垂、变薄；②受试者年龄在35～60周岁之间，男女不限；③受试者愿意在整个研究测试期间按照测试要求配合完成测试，并且不同时使用其他相同类型产品；④受试者在测试期间不得進行长时间日晒、户外等活动；⑤依据《赫尔辛基宣言》本次无创测试经受试者本人自愿，在测试前告知受试者本次测试的目的、详情、潜在的风险，签署《知情同意书》。

1.4.2 排除标准：①处于妊娠、分娩后半年内，哺乳期或备孕期女性；②室外工作无法避免日晒者；③对化妆品有过敏或高度敏感风险者；④近3个月内接受过或正在接受皮肤疾病或全身性疾病的药物或物理治疗；⑤近6个月内接受过面部美容治疗者；⑥研究者认为不适合参加试验者[6-7]。

1.4.3 双盲操作法：30名受试者，每名受试者面部左右两侧随机分为对照侧和试验侧，对照侧使用空白样品，试验侧使用测试样品。两种测试样品外观规格一致，无法分辨，根据随机分组结果为每名受试者分配好样品，并在包装上标注左侧和右侧。受试者根据样品标注信息，每天早晚分别于面部两侧使用相应样品。测试期间受试者其他护肤习惯保持不变，测试期间不得同时使用其他具有抗衰、紧致等功效的化妆品或药品，持续使用4周[6]。

1.4.4 客观评价：分别于基线（D0）、第14天（D14）、第28天（D28）进行面部固定区域弹性数据测量、皮肤超声和面部皮肤图像采集。测试当天受试者清洁面部后在温度（21℃～23℃）、相对湿度（40%～60%）的房间内安静休息15 min后进行数据采集。本研究中使用多功能皮肤测试仪Dermalab Series SkinLab Combo来获取弹性数据，皮肤弹性值通过皮肤粘弹性值（VE值）、皮肤杨氏弹性模量（E值）和皮肤回缩时间（R值）三个参数进行测量，E值的计算基础是测量弹性探头室内的皮肤在施加了特定和预设的负压时所拉伸的距离，其数值越高，代表皮肤弹性越好；R值是指以毫秒为单位的时间，皮肤从完全提升到皮肤回缩到峰值高度的33%时所需的时间，R值越低，说明皮肤弹性越好；VE是通过回弹时间除以弹性模量所得参数，其值越高，说明皮肤弹性越好。弹性数据每个测试区域测量3次，取平均值，测试部位为受试者两侧脸颊；使用Dermalab Series SkinLab Combo来获取受试者面部皮肤超声图像，测试部位为受试者脸颊两侧；VISIA CR面部图像分析系统拍摄受试者正面、右侧、左侧面部图像并分析毛孔数量[9]

1.4.5 主观评价：测试4周结束后，受试者进行主观评价，分别就两侧皮肤的水润度、细纹、紧实度、弹性的改善情况进行打分。满分5分，5=非常明显，4=比较明显，3=一般，2=不太明显，1=不明显。

1.5 统计学分析：应用Excel软件，对各个测量值进行描述性统计，包括数量、均值、标准差等。应用SPSS分析软件，将不同时间点的测量值与基线值进行比较，进行配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 体外评价

2.1.1 CKK-8法体外人皮肤成纤维细胞增殖实验：不同浓度测试样品对HFS活力的影响测定结果显示，1%、0.1%的测试样品均具有较好的促进HSF细胞增殖作用。见图1。

2.1.2 ELISA法检测Ⅰ型胶原蛋白含量：结果显示，与空白对照组相比，1%样品组和0.1%样品组的Ⅰ型胶原蛋白含量有显著性增长，上调率分别为22.03%和14.12%，说明受试物在该受试浓度下具有促进Ⅰ型胶原蛋白合成的作用。见表1、图2。

2.2 人体评价

2.2.1 皮肤弹性变化：在D0、D14、D28对受试者进行皮肤弹性检测，皮肤粘弹性值（VE值）、皮肤杨氏弹性模量（E值）和皮肤回缩时间（R值）的测定结果见表2。28 d后，试验侧的VE值、E值、R值均比基线时显著改善（P＜0.001）；对照侧VE值、E值、R值与基线比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3～4。

2.2.2 皮肤毛孔变化：根据VISIA图像分析数据观察面部毛孔数据的改善情况。结果显示，试验侧D14、D28时毛孔数量显著低于D0时（P＜0.001），而对照侧三个时间点的毛孔数量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3、图5。

2.2.3 皮肤超声：在超声图像中，颜色表示反射的超声信号的强度，深色表示强度低，而白色（黄色）表示强度高，真皮是多种颜色的混合。皮肤中非均匀结构，例如完整胶原蛋白、弹性蛋白等，由于声学特性的变化会引起较高强度的回声和反射。因此，测试样品对于皮肤的抗衰效果可以通过观察真皮层内高回声区域的增加，即超声图像中白色（黄色）颜色区域的增加和真皮层密度的改变来评价[10]。根据超声图像，试验侧超过90%受试者的真皮层内高回声区域增加，真皮层密度增加。说明测试样品具有提升真皮层密度，促进真皮层内胶原蛋白等物质增加的作用，具有一定的抗衰效果。部分受试者超声图像见图6～9。

2.2.4 受试者自我评分：受试者自我评分结果显示，使用试验样品和对照样品28 d后，两侧皮肤水润度、细纹均有改善，差异无统计学意义（P＞0.05），试验侧皮肤紧实度、弹性改善明显优于对照侧（P＜0.05）。评分结果见表4。

3  讨论

肽是由氨基酸通过肽键链接形成的一类化合物，是具有生物学功能的蛋白质片段。由于氨基酸种类的多样性和肽链空间构象的高自由度，使得肽具备生物学作用的多样性，可分为信号肽、載体肽、酶抑制肽、神经递质抑制等[11]。

信号肽主要通过对细胞外基质合成酶的促进和对金属蛋白酶的抑制，从而调节皮肤组织蛋白质周转，增加细胞外基质如胶原、弹性蛋白和蛋白多糖的合成，使皮肤紧致，对抗衰老。载体肽是指可以加速和促进生物活性分子进入皮肤的肽，也被称为细胞穿透肽或膜转导肽，主要用于抵抗皮肤光老化现象的出现。神经递质抑制肽，如乙酰基六肽-8，主要通过干扰SNARE复合体的形成和干扰乙酰胆碱的释放，从而起到类似肉毒素阻断神经的效果，但又不会带来肉毒素的副作用，还具有促进胶原蛋白合成以及脂肪组织再生的功能，主要用于延缓皮肤衰老和抗皱[12-13]。

本研究试验样品成分中，棕榈酰三肽-5可以提升成纤维细胞活力，促进细胞再生，促进胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖的合成；寡肽-1可以促进表皮细胞再生，改善皮肤质地；乙酰基六肽-8作为神经递质抑制肽，可以舒缓放松肌肉，改善面部皱纹；乙酰基四肽-9可增强真皮致密度和紧实度，提升皮肤弹性[13]。

体外实验中，Ⅰ型胶原蛋白是真皮细胞外基质的主要成分之一，通过比较空白与测试样品组Ⅰ型胶原蛋白含量的上调率，评价受试物在促进胶原蛋白合成方面是否具有功效[14]。结果显示，1%、0.1%浓度的测试样品对人成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的产生具有显著促进作用，对人成纤维细胞的增殖有显著促进作用。浓度为1%的样品组人成纤维细胞的细胞活力为139.452%；100μg/ml TGF-β1和1%样品的Ⅰ型胶原蛋白上调率分别为21.659%和22.026%。说明测试样品具有较好的促进细胞再生和促进细胞外基质合成的效果。

本研究人体测试显示，使用测试样品28 d后试验侧的皮肤弹性值（E值、R值和VE值）均较D0时显著改善，说明测试样品能显著提升皮肤弹性。随着皮肤衰老，面部皮肤弹性降低，真皮层胶原纤维减少，导致皮肤毛孔周围的支撑结构受损，导致面部毛孔增加[15]，使用测试样品28 d后，试验侧毛孔特征计数显著减少，结合超声图像，试验侧超过90%受试者的真皮层内高回声区域增加，真皮层密度密度增加。说明测试样品可提升真皮层致密度，细化毛孔。受试者自我评估显示，测试4周后皮肤细纹、水润度，弹性和紧实度都得到了较好的改善。

综上所述，试验样品能显著提升HFS活力，促进Ⅰ型胶原生成，显著改善面部皮肤弹性，减小面部毛孔，增加真皮层密度，有助于改善皮肤衰老，在抗衰方面具有良好的应用前景。

声明：本研究仅为学术研究，只供学术交流使用。

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[收稿日期]2023-02-07

本文引用格式：李生慧，于鈺，张明月.含有复合多肽的精华液改善皮肤衰老的功效研究[J].中国美容医学，2024，33（4）：65-69.