干扰hsa_circ_0013958/miR-637对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响

林颜 阮树斌 陈晓东 杨荣华 王婧薷 林泽鹏 信琪

[摘要]目的：探讨环状RNA（circular RNA， circRNA）hsa_circ_0013958对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（Human keloid fibroblast， HKF）增殖、迁移、侵袭的影响及分子机制。方法：将人瘢痕疙瘩成纤维细胞分为si-NC组、si-hsa_circ_0013958组、miR-NC组、miR-637组、si-hsa_circ_0013958+anti-miR-NC组和si-hsa_circ_0013958+anti-miR-637组。实时荧光定量PCR（Real time quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR）试剂盒检测hsa_circ_0013958、miR-637表达；四甲基偶氮唑盐（Methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）比色法检测细胞存活率；平板克隆实验检测细胞集落形成数；Transwell检测细胞迁移和侵袭能力；双荧光素酶报告实验检测hsa_circ_0013958和miR-637的靶向关系。结果：瘢痕疙瘩组织中hsa_circ_0013958表达水平较正常皮肤组织升高，miR-637表达水平降低（P＜0.05）。干扰hsa_circ_0013958表达或过表达miR-637后，HKF细胞存活率、集落形成数以及遷移、侵袭细胞数均降低（P＜0.05）。hsa_circ_0013958和miR-637有靶向调控关系；抑制miR-637表达逆转了干扰hsa_circ_0013958对HKF增殖、迁移侵袭的影响。结论：干扰hsa_circ_0013958通过调控miR-637抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭。

[关键词]hsa_circ_0013958；miR-637；瘢痕疙瘩；成纤维细胞；增殖；迁移；侵袭

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）04-0054-05

Effect of Interference hsa_circ_0013958/miR-637 on the Proliferation， Migration and Invasion of Human Keloid Fibroblasts

LIN Yan， RUAN Shubin， CHEN Xiaodong， YANG Ronghua， WANG Jingru， LIN Zepeng， XIN Qi

（Department  of Burn Plastic Wound Repair Surgery， the First People's Hospital of Foshan， Foshan 528000， Guangdong， China）

Abstract： Objective  To explore the effect of circular RNA （circRNA） hsa_circ_0013958 on the proliferation， migration and invasion of human keloid fibroblasts and its molecular mechanism. Methods  Human keloid fibroblasts HKF were divided into si-NC group， si-hsa_circ_0013958 group， miR-NC group， miR-637 group， si-hsa_circ_0013958+anti-miR-NC group， si-hsa_circ_0013958+anti-miR-637 group. Expression levels of hsa_circ_0013958 and miR-637 were detected by Real time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. Cell viability was assayed by Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method， cell colony formation was detected by plate cloning test， cell migration and invasion ability was detected by transwell method， the targeting relationship between hsa_circ_0013958 and miR-637 was detected by dual luciferase reporter experiment. Results  Compared with normal skin tissues， the expression level of hsa_circ_0013958 were elevated in keloid tissue， and the expression of miR-637 was decreased （P＜0.05）. After interference with hsa_circ_0013958 expression or overexpression of miR-637， the survival rate， colony forming number， migration and invasion of HKF cells were decreased （P＜0.05）. Hsa_circ_0013958 has a targeted regulatory relationship with miR-637， inhibition of miR-637 expression reversed the effect of interference with hsa_circ_0013958 on the proliferation， migration and invasion of HKF. Conclusion  Interference with hsa_circ_0013958 may inhibit the proliferation， migration and invasion of human keloid fibroblasts by regulating miR-637.

Key words： hsa_circ_0013958; miR-637; keloids; fibroblasts; proliferation; migration; invasion

瘢痕疙瘩是指皮肤创伤后结缔组织过度增生和透明性变而形成的瘢痕过度增生性皮肤良性肿瘤，其主要由成纤维细胞所致的胶原过量合成和沉积所产生；其向周围组织侵袭和移行的特性类似于恶性肿瘤的生长模式，因此抑制成纤维细胞的增殖及侵袭是预防瘢痕的有效方法[1-2]。研究发现circRNA在瘢痕疙瘩发病机理中扮演关键角色，可作为瘢痕疙瘩的生物标记，研究circRNA可为增生性瘢痕的治疗提供新的思路和方向[3]。研究报道肺腺癌、卵巢癌细胞、组织中hsa_circ_0013958高表达；且其促进了肺腺癌、卵巢癌细胞增殖和侵袭[4-5]。有研究发现，circ_0013958在卵巢癌患者体内高表达，与患者临床分期、淋巴结转移有密切关系；下调hsa_circ_0013958表达可有效抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。然而hsa_circ_0013958在瘢痕疙瘩中作用及其对成纤维细胞的增殖、迁移侵袭的影响也尚不清楚。微小RNA（microRNA， miRNA）在调节瘢痕疙瘩细胞的增殖和转移中发挥关键作用[7]。研究报道miR-637的上调通过靶向调控Smad3抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和转移[8]。miR-637通过调控AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1， AKT1）抑制肝癌细胞的增殖和侵袭[9]。因此，本实验旨在研究hsa_circ_0013958对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其与miR-637的关系。

1  材料和方法

1.1 组织标本来源：选取2016年1月-2020年1月笔者医院收治的33例瘢痕疙瘩患者的瘢痕疙瘩组织，以同一患者手术取皮修剪后的剩余正常皮肤组织作自身对照。患者对本研究内容知情同意，且实验方案经笔者医院伦理审查委员会批准，批准号为20151224L3。

1.2 主要试剂、材料：人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKF）（上海彩佑实业有限公司）；Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's minimum essential medium， DMEM）（北京杰辉博高生物技术有限公司）；Trizol试剂（日本Takara公司）；RT-qPCR试剂盒（上海沪峥生物科技有限公司）；MTT试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；聚碳酸酯膜细胞培养（Transwell）小室（美国BD公司）；蛋白提取试剂盒（上海科拉曼试剂有限公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）。靶向hsa_circ_0013958的小干扰RNA（siRNA，si-hsa_circ_0013958，正义5＇-CCGAAACCAUAUUCUCCUUTT-3＇和反义5＇-AAGGAGAAUAUGGUUUCGGTT-3＇）及siRNA阴性对照（si-NC，正义5＇-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3＇和反义5＇-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3＇）购自上海GenePharma公司。miR-637模拟物（mimic，有义，5＇-ACUGGGGGCUUUCGGGCUCUGCGU-3，反义，5＇-GCAGAGCCCGAAAGCCCCCAGUUUUU-3＇）及其陰性对照（miR-NC，有义，5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇，反义，5＇-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3＇），miR-637抑制剂（anti-miR-637，5＇-ACGCAGAGCCCGAAAGCCCCCCAGU-3＇）及其阴性对照anti-miR-NC（5＇-CAGUACUUUUGUGUAGUCAA-3＇）购自广州RiboBio公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养、转染与分组：将人瘢痕疙瘩成纤维细胞HKF培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，待细胞生长至对数生长期，按5.0×105个/孔接种至96孔板。将上述细胞分为si-NC组（转染si-NC）、si-hsa_circ_0013958组（转染si-hsa_circ_0013958）、miR-NC组（转染miR-NC）、miR-637组（转染miR-637）、si-hsa_circ_0013958+anti-miR-NC组（共转染si-hsa_circ_0013958和anti-miR-NC）和si-hsa_circ_0013958+anti-miR-637组（共转染si-hsa_circ_0013958和anti-miR-637）。

1.3.2 hsa_circ_0013958和miR-637表达水平检测：分别取瘢痕疙瘩组织、正常皮肤组织及HKF细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录得到cDNA后，circ_0013958和miR-637分别以3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）和U6为内参进行PCR扩增，反应条件包括95℃ 1 min、95℃ 20 s、58℃ 20 s。用2-△△Ct法计算circ_0013958和miR-637相对表达量。引物序列如下：circ_0013958，正向引物：5＇-GAACCCCCAGCTATTAGAGGTCCC-3＇和反向引物5＇-GGAAAAGCCCAGCCAGCAAAC-3＇；GAPDH，正向引物：5＇-TTCTTTTGCGTCGCCAGCCG-3＇和反向引物5＇-GGTGACCAGGCGCCCAATAC-3＇；miR-637，正向引物：5＇-ACUGGGGGCUUUCGGGCUCUGCGU-3＇和反向引物5＇-ACGCAGAGCCCGAAAGCCCCCAGU-3＇；U6，正向引物：5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇和反向引物5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。

1.3.3 细胞存活率检测：分别将各组细胞常规培养48 h，依照MTT试剂盒说明书操作步骤进行操作，应用多功能酶标仪（490 nm）检测各组细胞吸光度（Optical density， OD）值并计算细胞存活率。细胞存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.3.4 细胞集落形成数检测：取各组细胞分别接种至6孔板中正常培养约2周，磷酸缓冲盐液充分清洗细胞后，加入甲醇固定2～3 min，加入吉姆萨染液染色30 min，显微镜下统计各组细胞集落形成数（＞50个细胞）。

1.3.5 细胞迁移和侵袭能力检测：收集各组细胞，离心后通过无血清DMEM培养基重悬细胞，将细胞按5.0×105个/孔接种至Transwell小室上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。常规培养24 h后，加入多聚甲醛固定过膜细胞，结晶紫染色，光学显微镜下观察并计数迁移细胞数。侵袭实验需在用Matrigel包被Transwell上室室膜，其余步骤同迁移实验。

1.3.6 蛋白表达检测：收集各组细胞加入细胞裂解液，通过蛋白提取试剂盒提取总蛋白，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid， BCA）法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分离等量的蛋白样品，将蛋白转膜并封闭后，加入上皮黏附蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）、GAPDH一抗4℃孵育过夜，次日加入经辣根过氧化物酶标记的二抗室温条件下孵育2 h，显影曝光，采用凝胶分析软件分析各蛋白条带相对灰度值。

1.3.7 hsa_circ_0013958和miR-637的靶向关系检测：Circular RNA Interactome数据库预测显示hsa_circ_0013958与miR-637存在的相互作用的核苷酸位点。构建双荧光素酶报告载体wt-hsa_circ_0013958（野生型）和mut-hsa_circ_0013958（突变型），将其与miR-NC或miR-637共转染至HKF中，按照试剂盒说明书操作步骤检测miR-NC和miR-637细胞中hsa_circ_0013958荧光素酶活性。

1.4 统计学分析：采用SPSS 20.0软件进行统计学检验，符合正态分布的计量资料以均数标准差（x?±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 hsa_circ_0013958和miR-637在瘢痕疙瘩中的表达：与正常皮肤组织相比，瘢痕疙瘩组织中hsa_circ_0013958表达水平升高，miR-637表达水平降低（P＜0.05）。见表1。

2.2 干扰hsa_circ_0013958对HKF增殖迁移侵袭的影响：与转染si-NC相比，转染si-hsa_circ_0013958后提高了miR-637表达水平，降低了HKF细胞存活率，减少了细胞的集落形成数和迁移、侵袭数，提高了E-cadherin表达水平，降低了N-cadherin表达水平（P＜0.05）。见图1～2、表2～3。

2.3 hsa_circ_0013958和miR-637的靶向关系：Circular RNA Interactome数据库预测显示miR-637中存在hsa_circ_0013958的结合位点（见图3）。与miR-NC相比，miR-637和wt-hsa_circ_0013958共转染的细胞荧光素酶活性降低（P＜0.05），而miR-637和mut-hsa_circ_0013958共转染的细胞荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05）。见表4。

2.4 miR-637对HKF增殖、迁移、侵袭的影响：与miR-NC组相比，miR-637组细胞存活率降低，集落形成数、迁移和侵袭细胞数以及N-cadherin蛋白水平均降低，miR-637表达水平和E-cadherin蛋白水平均升高（P＜0.05）。见图4～5、表5。

2.5 抑制miR-637对HKF增殖迁移侵袭的影响：与si-hsa_circ_0013958+anti-miR-NC组相比，si-hsa_circ_0013958+anti-miR-637组细胞存活率升高，集落形成数、迁移和侵袭细胞数以及N-cadherin蛋白水平均升高，miR-637表达水平和E-cadherin蛋白水平降低（P＜0.05）。表明抑制miR-637可逆转干扰hsa_circ_0013958对HKF增殖迁移侵袭的影响。见图6～7、表6。

3  讨论

瘢痕疙瘩是皮肤损伤后引起的以成纤维细胞过度增生和细胞外基质异常积聚为特征的良性皮肤肿瘤，目前治疗瘢痕疙瘩的主要药物有三类，分别为细胞外基质靶向药物，细胞靶向药物和生化微环境靶向药物[10-11]。研究发现circRNA可能与瘢痕疙瘩的发生有关，并且可以作为新型的诊断和治疗靶标[12-13]。研究报道敲低circ_101238通过miR-138-5p/周期性依赖性激酶6（Cyclin-dependent kinase 6， CDK6）轴可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，促进细胞凋亡[14]。CircRNA TADA2A通过抑制成纤维细胞的增殖和活化来缓解特发性肺纤维化[15]。Circ_LAS1L通过miR-125b/分泌型卷曲相关蛋白5（Secreted frizzled related protein 5， SFRP5）途径调节心脏成纤维细胞的活化，生长和迁移[16]。本实验结果顯示，circ_0013958在瘢痕疙瘩患者瘢痕疙瘩组织中表达水平升高，提示circ_0013958的表达可能与瘢痕疙瘩的发生发展有关。本实验进一步干扰circ_0013958表达后，瘢痕疙瘩成纤维细胞的存活率、集落形成数、迁移、侵袭细胞数及N-cadherin表达水平均降低，E-cadherin表达水平升高，提示干扰circ_0013958表达可抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭。

有研究顯示，miR-637的过表达可降低胆管癌/胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移能力[17-18]。HOXA末端转录本反义RNA（HOXA transcript at the distal tip， HOTTIP）通过上调miR-637来抑制Akt1表达并抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖，侵袭和迁移[19]。沉默circ_0051240通过上调miR-637抑制卵巢癌细胞的增殖，迁移和侵袭[20]。以上研究表明miR-637是细胞恶性增殖、迁移和侵袭的抑制剂。在本实验中，与正常皮肤组织相比，miR-637在瘢痕疙瘩患者的瘢痕疙瘩组织中的表达水平显著降低，这与以往的研究[7]一致；功能实验结果显示，上调miR-637表达可降低瘢痕疙瘩成纤维细胞的存活率，减少集落形成数及迁移、侵袭细胞数；说明过表达miR-637可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，本实验发现，circ_0013958和miR-637的存在靶向调控关系；而下调miR-637表达逆转了干扰hsa_circ_0013958表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞HKF增殖、迁移和侵袭的影响。

综上所述，干扰hsa_circ_0013958通过靶向调控miR-637抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭。为瘢痕疙瘩的发病机制研究提供理论依据，且为临床探寻瘢痕疙瘩的治疗靶点研究提供先期实验工作。

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[收稿日期]2022-12-05

本文引用格式：林顏，阮树斌，陈晓东，等.干扰hsa_circ_0013958/miR-637对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响[J].中国美容医学，2024，33（4）：54-58.