木质素对纤维素酶酶解抑制研究进展

安艳霞, 刘欣, 李占超, 赵阳, 张剑, 李梦琴

(河南农业大学食品科学技术学院/农业农村部大宗粮食加工重点实验室,河南 郑州 450002)

木质纤维生物质资源丰富,可再生,价格低廉,含纤维素(40%～50%)、半纤维素(20%～30%)和可提取的木质素(extractable lignin, EL)(15%～30%)等组分,在生物转化和生物精炼方面具有巨大的应用潜力,其高值化转化与综合利用也是实现“碳达峰”和“碳中和”的重要途径[1]。纤维素通过酶解首先转化为纤维二糖、单糖或通过微生物降解成小分子物质,然后才能被进一步应用。木质素以愈创木基(guaiacyl,G)、丁香基(syringyl, S)和对羟苯基(p-hydroxyphenyl,H)为基本单位,通过连接键构成具有芳环结构的大分子,形成刚性结构,根据比例分为G型、S型和H型木质素[2]。原生物质酶解率极低,其原因通常归结为底物中木质素与纤维素酶之间的空间位阻,以及氢键、疏水和静电作用引起的非生产性吸附,使纤维素酶与纤维素组分之间接触的机会较少[3]。因此,木质纤维在利用前通常需预处理,以打破组分之间的牢固结构,促使纤维素酶与纤维素之间作用位点增加和可及性增强。

木质素对纤维素酶酶解抑制机制已有报道[4],主要包括空间位阻、木质素和纤维素酶之间产生的非生产性吸附。另外,也有研究表明,虽然木质素或木质素衍生物对纤维素酶存在抑制,但在酶解体系中添加改性木质素却可降低该效果[5]。因此,明确木质素的去除和分布、结构和性质等因素,采取有效措施以降低木质素对纤维素酶酶解抑制,从而合理设计酶解体系,为生物质组分的综合利用提供思路。

1 木质素对纤维素酶酶解抑制机制

木质素对纤维素酶酶解抑制机制主要包括空间位阻、非生产性吸附和酚类化合物的影响。

1.1 空间位阻

木质素本身三维网状结构及其独特的理化性能所形成的空间位阻,是抑制纤维素酶酶解的重要因素之一。VERMAAS等[6]模拟了纤维素酶与由纤维素和木质素构成的模型化合物的相互作用,发现木质素与纤维素酶之间形成的空间位阻,阻碍了酶与纤维素的有效接触,导致酶解效率降低。DJAJADI等[7]表明,经水热预处理的草本类生物质中的木质素是阻碍纤维素酶酶解的物理屏障,而不是通过酶的非生产吸附引起的抑制。此外,生物质预处理过程中形成的木质素液滴和伪木质素也会形成物理屏障,阻碍酶与纤维素的有效结合[8]。此外,木质素在纤维素表面的沉积和再分布也会阻碍酶与纤维素的接触。

1.2 非生产性吸附

木质素对纤维素酶的非生产性吸附被认为是木质素抑制纤维素酶酶解的关键因素之一。YARBROUGH等[3]发现,在木质素存在情况下,β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶蛋白很难单独存在,木质素极易与其结合,导致酶的活性降低。QIN等[9]指出,硫酸盐木质素与纤维素酶间的黏附力大于羟丙基纤维素与纤维素酶间的黏附力,表明疏水作用是纤维素酶与木质素结合的主要作用力。酶在木质素上的非生产性吸附主要表现为疏水作用、静电作用和氢键作用。

1.2.1 疏水作用 疏水作用被认为是纤维素酶和木质素之间非生产性吸附的主要作用之一。纤维素酶分散在水解液后疏水基团伸展,疏水作用与纤维素酶的纤维素结合域(cellulose binding domain,CBD)密切相关, CBD在Cel7B酶中的疏水性比在Cel7A酶中高,因此Cel7B酶更易吸附木质素[10]。此外,抑制效果与纤维素酶构成有关。LU等[11]发现,木质素对Cel7A酶的活性抑制影响最大,其次是木聚糖酶、内切β-1,4葡聚糖酶(Cel5B酶、Cel5C酶和Cel7B酶)和β-葡萄糖苷酶。除了纤维素酶本身的疏水性外,木质素的存在使底物的疏水性增强,底物的疏水性将影响酶与底物的有效吸附[12]。LI等[13]借助旋转涂布机制备的薄膜研究木质素和纤维素的疏水性作用,证实了上述结论。上述研究表明疏水作用促进了酶在木质素上的非生产性吸附,抑制了纤维素酶酶解。

1.2.2 静电作用 静电作用是酶在木质素上产生非生产性吸附的原因之一。酶表面因存在羧基、氨基和磷酸基等基团而带电荷,酶分子的净电荷与其等电点(isoelectric point, pI)、组分和酶解液的pH值有关。大多数纤维素酶的pI值≤4.8,在酶解液(pH值为4.8～5.0)时带正电荷。此外,纤维素酶所携带的电荷也与其组成有关。在pH值为4.8～5.0时,里氏木霉(Trichodermareesei)的Cel6A酶、Cel12A酶和β-葡萄糖苷酶带正电荷,而Cel7A酶、Cel7A酶、Cel7B酶和Cel5A酶则带负电荷[14]。另一方面,预处理分离的木质素通常含羧基、酚羟基和醇羟基等基团[15],改性后的磺化木质素含有磺酸基团,在酸性条件下(pH值为4.8～5.0),木质素通常带负电荷,因此纤维素酶与木质素之间会产生静电作用。

此外,有研究表明静电作用与酶解体系的pH值有关。LOU等[16]研究表明,当pH值从4.5提高至6.0时,纤维素分解酶和蛋白酶Zeta电位的负性增大,木质素的亲水性提高,木质素对纤维素酶的亲和力下降。该研究结果与酶解时最佳pH值为4.8～5.0的观点不同。由于调整酶解体系的pH值易于实行,商业化成本低,因此该研究结果具有一定的科学和现实意义。

1.2.3 氢键作用 关于纤维素酶和木质素或木质纤维素底物之间形成的氢键作用也有研究。QIN等[9]利用原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)考察了木质素与纤维素酶的黏附力,发现氢键在一定程度上加强了木质素与酶的相互作用。ZHANG等[17]和LIN等[18]发现,添加聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)等表面活性剂可与木质素的酚羟基形成氢键,进而形成PEG -纤维素酶复合物,减少了酶通过氢键在木质素上的非生产性吸附,避免了纤维素酶的聚集。关于氢键作用研究较少,因此,氢键对酶解的影响尚需深入研究。

此外,木质素易与酶蛋白结合,酶蛋白被不可逆吸附,被吸附的酶蛋白折叠结构消失,活性降低或消失[19]。通过添加阻断剂吐温80、牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)、PEG和金属离子等可减少纤维素酶在木质素上的非生产性吸附,从而提高酶与纤维素的接触机会[20-21]。AKIMKULOVA等[22]研究表明,Mg2+削弱了纤维素酶在静电作用和氢键作用下对木质素的非生产吸附。

为进一步研究木质素非产性吸附与酶之间的关系,采用Langmuir吸附等温线模型测定了纤维素酶对水不溶性木质素(water insoluble lignin, WIL)的吸附参数如吸附量、亲和力和结合强度等。NAKAGAME等[14]发现,不同来源的WIL吸附数据与Langmuir吸附等温线模型吻合较好。有研究发现,酶解体系中,软木和硬木磨木木质素(milled wood lignin, MWL)分别吸附了68%和40%的纤维素酶,糖转化率分别降低了4%和13%[23]。经稀酸处理的酶解残留木质素(enzymatic residual lignin, ERL)阻碍了纤维素的水解,稀酸预处理的ERL与纤维素酶的结合强度高于未处理的ERL[24]。上述结果表明,酶的吸附性能与木质素的类型密切相关。近年来,利用石英晶体微天平(quartz crystal microbalance with dissipation, QCM-D)实时监测分离木质素对酶的吸附。LAI等[25]利用QCM-D计算纤维素酶吸附参数,发现EL的最大吸附容量和不可逆吸附量均低于MWL,表明相对于MWL,EL的存在有助于酶解。蒲福龙等[26]研究表明,基于乳酸的低共熔溶剂(deep eutectic solvent, DES)提取的水稻秸秆木质素的疏水性与酶蛋白的吸附性能呈正相关,即疏水性越大则木质素对酶蛋白吸附能力越强,纤维素水解效率则越低。

综上,通过降低木质素对纤维素酶的空间位阻、添加阻断剂或PEG或金属离子、调整酶解体系的pH值等措施,可降低木质素对纤维素酶酶解的非生产性吸附。

1.3 酚类化合物

预处理通常有利于纤维素的酶解,然而高强度的预处理可能有木质素衍生的酚类化合物生成[27]。当纤维素酶暴露于这些酚类化合物时,随着暴露或接触时间的延长,纤维素酶酶活及其稳定性逐步丧失[28],究其原因是酚类化合物与纤维素酶形成了共沉淀[29]。KIM等[30]对蒸汽爆破预处理后的硬木洗涤液浓缩后添加于酶解体系时发现,葡萄糖产率从88%降至20%～30%,该研究表明对纤维素酶酶解抑制来自于洗涤浓缩液中的酚类化合物。同时,也有研究发现里氏木霉的β-葡萄糖苷酶比黑曲霉的β-葡萄糖苷酶更易受酚类化合物的抑制[31]。因此,抑制效果取决于酚类化合物的类型、纤维素酶的来源及类型等[32]。综上,采取一些措施例如对纤维素酶的来源、类型等进行有效调控,可降低酚类化合物的抑制。

2 木质素对纤维素酶酶解抑制影响因素

2.1 预处理及底物中木质素的含量

木质纤维原料中的木质素很大程度上阻碍了酶对纤维素的可及性,致使其酶解效率低[33-34],因此需通过预处理以去除木质素和降低木质素的天然抗性,这是生物质组分分离和提高酶解效率的关键步骤之一[35-37]。常用的预处理溶剂有酸、碱、亚硫酸盐、有机溶剂、离子液体(ionic liquid, IL)和DES等[38-39]。采用碱和绿液(green liquor, GL)等溶剂进行预处理以提高酶解效率已被广泛应用。碱预处理时,底物中木质素的醚键断裂,纤维素酶对纤维素的可及性增大。采用亚硫酸钠和亚硫酸铵预处理可有效去除木质素,亚硫酸盐攻击木质素的脂肪族侧链、取代羟基和醚等官能团,木质素被磺化亲水性增强,因此预处理降低了纤维素酶在木质素上的非生产性吸附和空间位阻[40-41]。同样,有机溶剂也是通过去除木质素后纤维素裸露,酶与纤维素的接触面积增加,酶解效率提高。一般认为ILs去除木质素是通过阴离子氢键的碱性和阳离子氢键的酸性、π-π共价键作用和疏水作用来实现,预处理后木质素的天然抗性降低,酶和纤维素的有效接触机会增加,酶解效率提高[42]。DES由氢键供体和氢键受体构成,是室温下呈熔融态的混合体系,对木质素的作用及后续生物质酶解规律与ILs相似[43-45]。

BRIENZO等[46]对不同含量木质素的蔗渣的研究发现,木质素含量低的酶解效率较高。ZHANG等[47]采用仅由木质素和纤维素构成的新型薄膜模型研究木质素含量对酶解的影响,表明膜中的木质素含量越低越有利于膜的酶解。HAO等[48]通过稀酸(dilute acid, DA)和稀碱预处理玉米秸秆获取富含木质素组分(lignin-rich residues, LRR),分别为LRR-DA和LRR-NaOH,对比发现LRR-DA对酶解的抑制大于LRR-NaOH,其原因是LRR-DA木质素含量较高所致。

此外,通过基因调控也可降低木质素含量或调节木质素生物合成以减少木质素对纤维素酶的非生产性吸附[49]。EDMUNDS等[50]发现,与对照组相比,木质素含量低的转基因火炬松(PinustaedaL.)的葡萄糖释放量增加了1.9倍～3.2倍。MANSFIELD等[51]通过调控木质素含量评估细胞壁中木质素对水解效率的影响,发现木质素含量低的纤维素水解率接近100%。综上,通过预处理或基因调控可降低底物中木质素的含量,可有效降低木质素对纤维素酶酶解抑制。

2.2 木质素的分布

无论选用何种预处理溶剂或预处理方式,经预处理的木质纤维中仍有木质素残留,然而预处理过程中木质素和半纤维素的部分去除及组分间化学连接键的断裂,使木质素含量和原有位置发生轻微移动并重新分布。例如水热、氨纤维膨胀(ammonia fiber expansion, AFEX)、蒸汽爆破和稀硫酸等预处理均引起了底物组成和结构的改变,纤维素酶与纤维素的可及性增强,酶解效率提高[52]。WANG等[53]发现水热预处理后酶解效率有大幅度提升,发酵糖的转化率提高了3.5倍。

然而,预处理会导致木质素发生缩合沉积或形成伪木质素等,对纤维素酶产生非生产性吸附从而抑制酶解[54]。经水热预处理后形成的球形木质素液滴对酶解产生了抑制[29]。ZHAO等[55]发现与未处理时相比,经H2O2/底物加载AFEX预处理后毛竹中的木质素含量增加,这是预处理过程中解离的木质素液滴再凝结形成新的大分子、木质素和半纤维素部分降解形成伪木质素,造成木质素含量提高。类似地,经水热预处理的秸秆由于木质素液滴在底物表面的不断积累,水解速率呈降低的趋势[56]。SHINDE等[57]报道了稀酸预处理时有木质素类聚物(伪木质素)形成,对酶有非生产性吸附。同时HU等[58]发现,伪木质素对酶解的抑制较大,这是伪木质素中存在甲氧基和多芳烃结构,对纤维素酶有较强的吸附性,导致底物与酶接触机会减小,抑制效果增强。

2.3 木质素的结构

2.3.1 木质素相对分子质量 不同相对分子质量的木质素对酶解有不同的影响[59]。LI等[60]发现高相对分子质量的木质素易沉积到纤维素表面,沉积的木质素增大了纤维素酶与纤维素的空间位阻;相反,低相对分子质量的木质素不易沉积反而有降低木质素对纤维素酶的非生产性吸附作用。云杉水解预处理中,2-萘酚和二甲基间苯三酚的引入导致木质素的相对分子质量显著降低,酶解效率提高了39%和42%[61]。此外,LAI等[62-63]发现低相对分子质量的有机溶剂木质素,在添加酶解体系后促进了木质纤维的酶解。综上,不同来源和相对分子质量的木质素对纤维素的酶解有不同程度的影响,低相对分子质量的木质素对酶解的抑制小于高相对分子质量的木质素,甚至对酶解有促进作用。

2.3.2 木质素S/G值及相对丰度 不同S/G值的木质素对酶解效率也有一定影响。STUDER等[64]发现高S/G值的样品有利于酶解中还原糖的释放。温和的预处理条件和相近的纤维素酶用量条件下,玉米秸秆的酶解效率远高于柳枝稷[65],且发现玉米秸秆中木质素的S/G值为1.4,柳枝稷则为0.8,这与高S/G值有利于酶解的结论相吻合[66-67]。然而也有不一致的报道。XU等[68]发现高S/G值的木质素对纤维素酶的非生产吸附增强,不利于纤维素的酶解。TAN等[69]观察到经亚硫酸氢盐预处理的油棕空果束木质素的S/G值较高,然而S/G值的高低却与酶解效率呈负相关。PAPA等[70]表明,IL预处理的桉木S/G值对生物质糖化效率几乎无影响,同时该课题组也发现对未处理的生物质,虽然底物有高S/G值但酶解效率仍很低。因此,木质素S/G值对纤维素的酶解规律尚需深入研究。

有研究表明,木质素中S型、G型和H型的相对丰度对酶解效率也有不同程度的影响。KIM等[71]发现,与经硫酸预处理的生物质对比,草酸预处理的对酶解抑制更明显,原因是经草酸预处理的样品含有大量的G型木质素,对纤维素酶具有较高的亲和力,抑制明显。类似地,KO等[72]发现,含有较高G型的软木木质素比硬木对酶解有更强的抑制。此外,也有研究表明从木材中提取的木质素比从草本类中提取的对纤维素酶酶解抑制更显著,并且发现草本木质素结构松散,H型结构含量高[73],这是由于G型木质素对纤维素酶的亲和力高于S型和H型[72, 74]。BONAWITZ等[75]研制了一种新的拟南芥突变体,其木质素几乎完全由H型组成,发现其酶解效率较高。另外还有研究发现,木质素中羟基肉桂酸酯的存在使生物质的顽固性和抗性更强,阿魏酸酯(ferulates, FA)和对香豆酸酯(p-coumarates, pCA)是草本中2种重要的羟基肉桂酸酯,FA的存在木质素与纤维素之间结合更为紧密,底物的顽固性更强,因而酶解效率较低[76]。REINOSO等[77]发现,由于酯链pCA的存在,底物的抗性较强,然而经碱预处理后底物的FA和pCA发生裂解,对酶解有促进作用。

2.3.3 木质素化学结构 木质素含有的官能团例如酚羟基、脂肪羟基、羧基和甲氧基等对纤维素的酶解也有影响。研究表明,酚羟基含量高的木质素对纤维素酶的非生产性吸附较强[78],原因是氢键的形成促进了纤维素酶与木质素的结合。HUANG等[79]发现,木质素中酚羟基的含量与对纤维素酶的非生产性吸附能力呈正相关,而与脂肪羟基含量呈负相关。YU等[23]研究了羟基对酶解的影响,发现纤维素酶对MWL的吸附能力随着总羟基含量的减少而增加,而脂肪族羟基的减少是引起总羟基变化的主要原因。羧基的存在对酶解有一定的促进作用,原因是羧基增加了亲水性能。YING等[80]发现,碱预处理结合羧基化处理可将酶促效率提高1.5倍～3.4倍,归因于羧基含量的增加。GUO等[81]发现,与红麻和白杨木质素相比,玉米秸秆中MWL与纤维素酶具有较强的亲和力,原因是玉米秸秆MWL的羧基含量低,酚羟基含量高,对酶解有抑制。此外,有研究表明,甲氧基与酶解效率之间无相关性[82]。QIN等[83]利用木质素模型化合物研究了甲氧基与酶解效率的关系,发现甲氧基的引入对酶解无明显影响。木质素中的官能团与酶解效率之间的关系与生物质来源和预处理方法有关,因此木质素的官能团对酶解的影响有待于深入研究。

除官能团外,木质素的化学键例如β—O—4键的含量等对纤维素酶酶解也有影响。预处理通常引起β—O—4键的断裂和新化学键的形成,β—O—4键的断裂破坏细胞壁的天然抗性,理论上有助于纤维素酶酶解。杨木经水热预处理[78]和柳枝稷经稀酸预处理后大量的β—O—4键发生断裂[67],对酶解有促进作用。但β—O—4键的断裂产生较多的游离酚羟基,酚羟基不利于酶解。YOO等[19]表明,杨木经有机溶剂预处理后残留木质素中β—O—4键的含量显著降低但酚羟基含量明显增加,随酚羟基含量的增加木质素对纤维素酶吸附能力增强,但经预处理的杨木酶解效率并未提高。此外,预处理中木质素通过缩合形成新的碳-碳键,导致底物与纤维素酶之间疏水作用增加[79]。SONG等[84]发现,经DES预处理的柳木和玉米秸秆中的木质素发生了缩合反应,木质素与酶的疏水作用增强,预处理后酶解效率并未升高。

木质素通过共价键与半纤维素的侧链形成木质素-碳水化合物复合物(lignin-carbohydrate complex, LCC),形成天然抗性[68],因此通过预处理破坏LCC的链接键,提高底物的酶解效率。SINGH等[85]通过AFEX预处理破坏了LCC,发现预处理后酶解效率显著提高。同时LI等[86]也发现,经水热预处理后LCC的断裂促进了样品的酶解。JEONG等[87]采用Fenton氧化-水热法分别预处理落叶松和黄杨获取对应的LCC,结果发现落叶松和黄杨LCC的酶解率分别为26.23%和93.53%,同时发现落叶松LCC中β—β键和β—5键的含量高于黄杨LCC,表明β—β键和β—5键的存在不利于酶解。另外,LAI等[25]从乙醇有机溶剂预处理的木屑中分离出EL和MWL,发现MWL对纤维素酶酶解抑制大于EL,原因是MWL的β—5键丰度较高。TAN等[69]发现样品中木质素含量相当的情况下,LCC的含量与S/香草醛(vanillin,V)值呈正相关,表明S/V值越高对酶解的抑制越强。上述研究表明,β—β键和β—5键的存在不利于底物的酶解。

综上,预处理及木质素的含量、木质素的分布、相对分子质量、木质素中S/G值及丰度、木质素含有的官能团和化学键类型及含量等对纤维素酶酶解均有一定的影响。经预处理的底物酶解效率除了受本身组成、结构特点和理化特性例如比表面积和孔体积等影响外,还与预处理过程中解离的木质素和木质素基衍生物的空间位阻等有关[88]。底物中残留木质素含有高S/G值、羧基和脂肪族羟基含量高有利于纤维素酶酶解,然而高含量的酚羟基、羟基肉桂酸酯、β—β键、β—5键等对酶解不利[64, 82]。

3 木质素降低纤维素酶酶解抑制途径

3.1 不同类型木质素的引入

3.1.1 改性木质素 对木质素进行改性,可适当降低木质素对纤维素酶酶解抑制。磺化木质素(sulfonated lignin ,SL)、木质素磺酸盐(lignosulfonate, LS)、水溶性木质素(water soluble lignin,WSL)及一些相对分子质量低的碱木质素等可以适当降低对纤维素酶酶解抑制。研究发现,LS的引入降低了对纤维素酶酶解抑制,原因是LS有亲水性能,对纤维素酶的非生产性吸附减少[24]。ZHU等[89]将3种不同相对分子质量的LS引入酶解体系中,发现低相对分子质量的LS比高相对分子质量更有助于降低纤维素酶酶解抑制。此外,可溶性碱木质素和硫酸盐Kraft木质素也可有效降低对纤维素酶酶解抑制[90]。上述研究表明,LS对底物的酶解影响与底物中残留的木质素有关,WSL降低对维素酶酶解的抑制与WSL和残留木质素对纤维素酶形成“竞争性吸附”有关。

受WSL可有效降低对纤维素酶酶解抑制的启发,关于木质素亲水改性以降低对酶解抑制方面的研究得到关注[91-94]。乙醇有机溶剂木质素的亲水改性使木质素与纤维素酶的结合强度降低,从而消除了76%～96%的木质素抑制[88]。碱木质素通过磺化改性、氧化改性和羧基化改性[80]可使木质素接触角降低,对纤维素酶的非生产性吸附降低。类似地,木质素的磺化和羧基化改性提高了木质素的亲水性,相对于未改性的木质素,改性木质素可使纤维素酶酶解效率提高8.0%～15.3%。另外也有研究发现,经PEG-1000修饰后的碱木质素则对纤维素酶酶解有促进作用[16]。总之,木质素的亲水改性一定程度上减少了纤维素酶在木质素上的非生产性吸附,有利于酶解。这一现象表明,改性后的WSL有效地降低了对纤维素酶酶解抑制。上述研究结果为木质素的应用提供了新的思路。

3.1.2 含有羧基的不溶性木质素 从木质纤维原料中提取或经预处理后可获取木质素,在中性或酸性条件下得到的木质素大多不溶于水,这类木质素称为WIL。多数木质素对纤维素酶酶解存在抑制。然而,有报道引入某种类型的WIL时对纤维素酶酶解抑制有一定程度下降。例如,乙醇有机溶剂木质素可降低对纤维素酶酶解抑制[62],其原因是乙醇和水极性相似,有少许溶于水,并且该木质素的相对分子质量较低,抑制是由这部分水溶性木质素引起的。此外,WIL中羧基含量高也可降低纤维素酶酶解抑制[14]。JIA等[91]研究了外源木质素对纤维素酶酶解的影响,采用γ-戊内酯/水预处理玉米秸秆获得的2种木质素分别加入酶解体系后,纤维素的转化率从28.0%提高到37.4%和31.3%,对纤维素酶酶解抑制降低的原因是这2种木质素中均含有羧基。上述研究表明,含有羧基的WIL可降低对纤维素酶酶解抑制。

3.1.3 降低纤维素酶酶解抑制原理 有报道表明,低相对分子质量WIL和WSL,以及改性木质素在一定程度上降低了木质素对纤维素酶酶解抑制[95],该结论为降低纤维素酶酶解抑制提供了新的思路。WSL属于新型木质素,可减少纤维素酶在木质素上的非生产性吸附,但WSL降低纤维素酶酶解抑制的原因尚无明确定论。WSL与纤维素酶结合会形成木质素-纤维素酶复合物,推测这是WSL降低纤维素酶酶解抑制的关键。WSL引入酶解体系后,纤维素酶将和底物中含有的内源性木质素及添加的外源性WSL同时作用,而二者因分子结构的差异影响其相互作用即产生竞争性吸附。WSL降低纤维素酶酶解抑制主要分为2种,即WSL的引入导致WSL与底物中的木质素发生竞争性吸附,形成WSL-纤维素酶配合物,以及WSL作为表面活性剂稳定纤维素酶促进纤维素酶对纤维素的可及性[90, 96]。

在含有木质素的底物中,WSL的添加可降低纤维素酶与底物中木质素之间的非生产性吸附。另外,通过调控底物中木质素分子结构可以增加纤维素酶与外来木质素之间的竞争性,降低对纤维素酶酶解抑制。有研究表明,LS与其他阴离子聚电解质含有相同的电离基团,可与BSA结合形成LS-BSA复合物[94]。WANG等[90]报道了LS与纤维素酶结合形成亲水的纤维素酶- LS复合物,通过减弱疏水和静电作用降低木质素对纤维素酶酶解抑制。ZHENG等[21]研究表明LS的引入促进了LS-稀酸预处理甘蔗渣 (dilute acid pretreated sugarcane bagasse,DA-SCB)木质素复合物和LS-纤维素酶复合物的形成,从而增加了纤维素酶与DA-SCB木质素之间的静电排斥作用,纤维素酶与纤维素的结合位点增加,从而减少了纤维素酶在DA-SCB上的非生产吸附。同时,LS作为表面活性剂减少了纤维素酶在木质素上的非生产吸附作用。除LS外,还开发了其他改性木质素,类似地也降低了纤维素酶在木质素上的非生产性吸附[95]。

对纯纤维素底物,多数研究表明WSL抑制纯纤维素的酶解,原因是纯纤维素底物中不含木质素,WSL作为外源木质素无法和底物形成竞争性吸附,相反纤维素酶在WSL上产生非生产性吸附,导致纤维素酶在纤维素表面的有效吸附减少[96]。与酶蛋白相比,WSL的相对分子质量较小,特定条件下WSL与纤维素酶的吸附域结合形成复合物,即WSL封闭了纤维素酶的部分吸附域,限制了纤维素酶与纤维素的结合,因此在纯纤维素底物酶解时WSL对酶解并无促进作用。同时也有研究表明,LS阻碍了纯纤维素的酶解,ZHENG等[21]发现LS与Avicel结合,形成Avice-LS配合物,占据了纤维素酶与Avicel的结合位点,从而纤维素酶在Avicel上的有效吸附降低。LIU等[96]和WANG等[97]的研究也证实了该结论,即纤维素酶在LS上的非生产性吸附是抑制纯纤维素底物酶解的主要原因。但也有少许关于WSL促进纯纤维素水解的报道。LOU等[16]发现,3种不同分子质量的LS的引入可提高纯纤维素的酶解,认为LS-纤维素酶复合物可以改善和稳定纤维素酶与纤维素的结合。WSL的引入对纯纤维素酶酶解体系产生影响,该影响与WSL的相对分子质量和类型有关。

综上,对木质素进行亲水改性和提高WIL的羧基含量是降低对纤维素酶抑制的有效策略,且WSL-纤维素酶复合物的形成可降低木质素对纤维素酶酶解抑制[98],但是复合物如何影响纤维素-木质素-酶的相互作用尚无定论,仍需深入研究。

3.2 现代技术手段的应用

用于解析木质素对纤维素酶酶解抑制的现代技术分析手段主要有QCM-D、表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)、AFM、傅里叶变换衰减全反射红外光谱(fourier transform attenuated total reflection infrared spectroscopy, FTIR-ATR)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)光谱、荧光光谱(fluorescence spectroscopy, FLS)和分子动力学(molecular dynamics, MD)模拟等。其中,QCM-D、SPR和AFM在揭示木质素-纤维素酶作用方面取得了一定进展。HE等[99]借助QCM-D研究了伪木质素和残余木质素对酶解的影响,酶解动力学研究表明当伪木质素和残留木质素与纤维素混合时,葡萄糖释放量减少。JIANG等[100]借助LiCl/DMSO体系制备了全组分木质纤维素超薄膜,QCM-D薄膜的原位酶解过程证实了纤维素酶对木质素的非生产性吸附。PEREIRA等[101]利用 SPR 在不同离子强度的缓冲溶液中进行酶吸附实验,发现静电作用起着重要作用。

利用AFM测定木质素与纤维素酶之间的相互作用力获得表面图像,同时也可用于化学特性的分析,测定特定材料和分子之间的相互作用。ARSLAN等[102]利用AFM分析纤维素酶疏水残基模型表面和用不同方法预处理的生物质底物之间的纳米尺度空间作用力。AFM也用于测定Cel7A 的碳水化合物结合模块(carbohydrate binding module, CBM)和3种木质纤维素基底之间的纳米尺度,结果表明,基质对CBM的总黏附力与表面木质素覆盖率呈正相关,同时,改变木质素的表面疏水性和表面能是避免纤维素在LS上非生产性吸附的先决条件[103]。

综上,随着科技的进步,解析木质素对纤维素酶酶解抑制的技术手段将越来越先进,明确其机制然后采取对应的措施降低其抑制,有助于木质纤维资源全组分的开发与利用。

4 存在问题与展望

木质纤维素酶酶解是利用糖平台技术转化生物平台化合物和生物燃料的关键步骤,由于木质素和纤维素酶结构的复杂性,其相互作用尚未清晰,明确木质素与纤维素酶间的疏水作用、氢键、静电缔合等作用是提高酶解效率的前提条件。因此,如何识别木质素与纤维素酶间的疏水、静电和氢键相互作用,是未来研究木质素对纤维素酶酶解抑制的出发点之一。

通过预处理去除木质素的成本高,预处理后废液对环境有不良影响,同时预处理过程还会导致木质素缩合或伪木质素的形成,促使木质素对纤维素酶的非生产性吸附增强。因此,选择适宜的预处理溶剂或技术,或对木质素进行适宜的改性等,是降低木质素对纤维素酶酶解抑制的有效途径之一。另外也可通过基因工程技术改变木质素含量、调控木质素的生物合成等方式降低对纤维素酶酶解抑制。未来的研究需借助先进的技术手段,从微观角度和分子水平上揭示木质素与纤维素酶的相互作用,以降低木质素对纤维素酶酶解抑制,为高效、经济利用纤维素和木质素生物质组分提供有效途径。