杜仲叶多糖的提取、结构及抗氧化活性研究

刘梦培, 王嵘, 李格, 张李兵, 纵伟, 黄琳

(1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南 郑州 450002;2.好想你健康食品股份有限公司,河南 新郑 451162;3.中国林业科学研究院经济林研究所,河南 郑州 450003)

杜仲(Eucommiaulmoides)为杜仲科植物,单属单种,是中国宝贵的药食同源资源,具有很好的药用价值与食用效益。目前,杜仲的皮、雄花和籽等研究较多[1],但产量最高、最有价值的副产物杜仲叶,却得不到充分利用。研究表明,杜仲叶与杜仲皮的有效成分和药理作用相似[2]。多糖作为杜仲叶中主要活性成分之一,具有免疫调节[3-4]、降血糖[5]、抗氧化[6]和抗肿瘤[7-8]等多种生物活性。SUN等[9]研究表明,杜仲叶多糖有利于调节巨噬细胞的免疫行为,并促进免疫能力的增强。GAO等[10]研究发现,杜仲叶多糖具有调节肝缺血再灌注损伤中的抗炎和抗氧化作用。不同品种杜仲叶的植物功效成分及生物活性具有一定差异,对不同品种杜仲叶的综合开发利用可有效提高杜仲产品附加值。目前,多糖常用提取技术包括热水提取[11]、超声辅助提取[12]、微波辅助提取[13]、生物酶提取[14]和超临界提取等。传统热水提取具有提取时间长、得率低等缺点。超声辅助提取是利用空化作用和次级效应破碎细胞壁促进植物多糖提取,但热效应较低[15]。而微波辅助提取使细胞内部极性分子在电磁波作用下振动、摩擦,并迅速达到较高反应温度,使细胞内的活性成分更易释放,有效减少提取时间,极大程度上提高天然产物得率[16]。李玲梅等[17]研究了不同提取方法对枸杞多糖得率的影响,发现在相同条件下,微波辅助提取枸杞多糖得率和多糖含量明显高于其他提取方法。

目前,在杜仲叶多糖的结构方面,闫芝茜[18]对杜仲叶多糖结构中的各单糖进行了表征;陈雪花[19]研究了杜仲叶多糖结构与结肠癌细胞抑制活性的关系;黄伟等[20]特别针对杜仲叶酸性多糖的结构进行了分析。但是,鲜有研究比较不同杜仲品种叶多糖的差异,且对杜仲叶多糖的抗氧化能力研究也相对有限。全熙宇等[21]研究了杜仲叶热水提多糖和碱提多糖的铁离子还原能力,以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)自由基清除能力,发现2种杜仲叶多糖均具有良好的抗氧化活性,但碱提杜仲叶多糖抗氧化能力略高。XU等[22]分别使用微波辅助提取法和热水提取法提取杜仲叶多糖,并比较其清除DPPH自由基能力,结果发现,微波辅助提取DPPH自由基清除活性显著高于热水提取。华仲1号、华仲5号、华仲12号、华仲13号、华仲15号和华仲24号是中国最常见的杜仲栽培品种,其中华仲13号为主栽品种,全国的种植面积最大,叶子的采摘量也最高。基于此,本研究使用微波辅助法提取杜仲叶多糖,采用正交试验优化其提取工艺,对上述6个品种杜仲叶多糖进行提取,优化资源的选育,并对杜仲多糖的结构及抗氧化活性进行探究,以期为杜仲叶多糖提取及综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜仲叶(华仲1号、华仲5号、华仲12号、华仲13号、华仲15号、华仲24号),来自中国林科院新乡市原阳县杜仲研究基地,2020年9月采摘,2021年试验完成。采摘的杜仲叶片于50 ℃烘干,粉碎过孔径0.42 mm筛。

葡萄糖购自天津市化学试剂三厂,分析纯;AB-8大孔树脂购自上海麦克林生化科技有限公司;滤膜购自天津市津腾实验设备有限公司;透析袋购自湖南翊博生物科技有限公司;无水乙醇购自天津市富宇精细化工公司,分析纯;浓硫酸购自洛阳昊华化学试剂有限公司,优级纯;苯酚、溴化钾、三氟乙酸、甲醇、盐酸羟胺、吡啶、乙酸酐等其余试剂(分析纯)均购自上海易恩化学技术有限公司。

1.2 仪器与设备

HC-3618R高速冷冻离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司;TU1810紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;7890B 5977气相色谱-质谱联用仪:安捷伦科技有限公司;E-scan Bruker 电子顺磁共振波谱仪;Vertex 70傅里叶变换红外光谱仪;JP-400B高速多功能粉碎机:浙江永康市久品工贸有限公司;LGJ-12真空冷冻干燥机:郑州鸣一仪器设备有限公司;R1010EX旋转蒸发器:上海向帆仪器有限公司;M1-L213B微波炉:广东美的厨房电器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 杜仲叶多糖提取方法 精确称取2.0 g杜仲叶粉末,以蒸馏水为提取溶剂,在不同温度下水浴2 h,然后按照单因素设定参数进行微波处理。提取结束后,提取液于4 000 r·min-1下离心10 min,上清液在60 ℃下减压浓缩至10～15 mL,加入无水乙醇至溶液乙醇体积分数达80%,4 ℃静置12～24 h。混合物于4 000 r·min-1下离心10 min,弃去上清液,将沉淀冷冻干燥后即得到杜仲叶粗多糖。将粗多糖制成1 g·L-1水溶液,取250 mL多糖溶液加入40 g预处理后的大孔树脂AB-8,置于摇床中25 ℃、140 r·min-1脱色3 h,抽滤后浓缩,将浓缩液装入截留量3.5 kD的透析袋中透析24 h,冷冻干燥得杜仲叶多糖[23-24]。

1.3.2 单因素试验 选取杜仲主栽品种华仲13号样品,以杜仲叶多糖得率为指标,以m(杜仲叶粉/g)∶V(H2O/mL)(以下简称质量体积比)为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、微波时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 min、水浴温度20、40、60、80 ℃、微波功率120(低档)、230(中低档)、385(中档)、539(中高档)、700 W(高档)设计单因素试验。其中,以质量体积比1∶40、微波时间1.0 min、水浴温度60 ℃、微波功率385 W为基础条件。

1.3.3 正交试验设计 在单因素试验结果基础上,以杜仲叶多糖得率为指标,选取质量体积比(A)、微波时间(B)、水浴温度(C)、微波功率(D)做L9(34)正交试验。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Orthogonal test factor levels

1.3.4 杜仲叶多糖结构组成分析 参考吴静等[25]方法,采用糖腈乙酸酯衍生化法将多糖水解产物进行衍生化。分别称取经最佳提取条件提取的6个品种杜仲叶多糖各3 mg,置于安瓿瓶中,加入2 mol·L-1三氟乙酸 3 mL,封口在120 ℃烘箱中保持4 h后冷却至25 ℃,转移至茄形烧瓶中60 ℃减压蒸干,取下敞口放置10 min,加入甲醇,蒸干,重复5次,脱除三氟乙酸,得杜仲叶多糖水解样品。加10 mg盐酸羟胺、0.5 mL吡啶,90 ℃反应 30 min,取出后冷却至25 ℃,加入0.5 mL的乙酸酐,旋涡彻底混合,90 ℃继续反应30 min。反应液减压蒸干,加入适量甲醇溶解并定容至5 mL后,过0.22 μm滤膜。

(1)单糖组成测定 采用气相色谱法-质谱法联用(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)测定单糖组成。参考杨永晶等[26]分析方法。色谱条件:HP-5柱(30 m×250 μm×0.25 μm);进样口温度250 ℃;程序升温,起始温度100 ℃,以5 ℃·min-1升至200 ℃,保持1 min,再以10 ℃·min-1升至250 ℃,保持5 min;载气流速1.0 mL·min-1,分流比10∶1,载气为氦气。质谱条件:接口温度 280 ℃;四极杆温度:150 ℃;电离方式:EI;电子轰击能量:70 eV;溶剂延长时间:5 min;全扫描范围:50～800 m·z-1。

(2)红外光谱测定 分别称取经最佳提取条件提取的6个品种杜仲叶多糖3 mg,充分研磨,加入溴化钾固体粉末300 mg,研磨均匀后用压片机压片,用傅立叶红外分光光度计在 4 000～400 cm-1范围内检测红外吸收光谱。

1.3.5 杜仲叶多糖抗氧化活性测定 通过测定DPPH自由基清除率来表征杜仲叶多糖抗氧化活性。参考郭学文等[27]测定及分析方法,称取一定质量的DPPH粉末,用甲醇溶解配制成0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol·L-1的DPPH溶液,绘制DPPH标准曲线。采用电子顺磁共振波谱法进行测定。电子顺磁波谱法测定条件:频率9.792 069 GHz,功率5.0 mW,中心磁场3.487×10-1T,扫描宽度1×10-2T,调制幅度2.27×10-4T,调制频率86.00 kHz,扫描时间83.89 s(20.97 s×4次),横坐标点数512,接收机增益为3.17×103。测试完毕后,根据二次积分值计算自由基清除能力,积分区域为(3 450±0.010)×10-4～(3 525±0.010)×10-4T。其中,DPPH在0.1～0.9 mol·L-1范围内其特征峰二次积分值与质量浓度呈良好的线性关系,满足线性方程y=7.659x+0.141(R2=0.996)[27]。

选择0.5 mmol·L-1的DPPH溶液进行多糖清除率测定试验。取适量杜仲主栽品种华仲13号叶多糖配制成0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 g·L-1,分别取0.1 mL各质量浓度样品与0.1 mL DPPH溶液混合,避光反应30 min。用0.1 mL甲醇代替多糖溶液,以此为空白组。杜仲多糖DPPH自由基清除率计算如式(1)所示。IC50值为自由基清除率达到50%时所对应的样品质量浓度,根据不同质量浓度多糖的自由基清除能力的变化曲线可直观得到,常作为比较不同样品自由基清除能力的标准。以华仲13号杜仲叶多糖半抑制浓度IC50为标准,比较华仲1号、华仲5号、华仲12号、华仲15号、华仲24号杜仲叶多糖的DPPH自由基清除能力。

(1)

式中:R为DPPH自由基清除率;A0为空白组特征峰的二次积分值;A为样品组特征峰的二次积分值。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次,试验结果表示为平均值±标准差。采用 Origin 8.5、SPSS 25 和Graph Pad Prism 6软件对数据进行统计分析,多重比较采用SPSS 25 软件的Dunnet法(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 杜仲叶多糖提取方法优化

2.1.1 杜仲叶多糖提取单因素试验结果 由图1-a可知,杜仲叶多糖得率随质量体积比变化呈现先上升后下降的趋势,在质量体积比1∶20时多糖得率达到最大,为6.15%。由图1-b可知,杜仲叶多糖得率随微波处理时间增加呈先上升后下降的趋势,在微波处理时间1.5 min时多糖得率达到最大,为5.86%。由图1-c可知,在20～60 ℃温度范围内,杜仲叶多糖得率随水浴温度增加而上升,当温度达到60 ℃时,多糖得率达到最大,为5.73%;随后水浴温度上升到80 ℃时,多糖得率略有下降,但变化不大。由图1-d可知,整体上杜仲叶多糖得率随微波功率增加呈先上升后下降趋势,在230～539 W之间多糖得率较高且趋于平稳,且在微波功率385 W时多糖得率达到最大,为6.34%。

a:料液比;b:微波时间;c:水浴温度;d:微波功率。

2.1.2 杜仲叶多糖提取正交试验结果 采用微波辅助水提醇沉法提取杜仲叶粗多糖,在单因素试验基础上,以华仲13号为原料优化提取工艺。正交试验结果见表2,各因素对得率的影响顺序为微波功率>质量体积比>水浴温度>微波时间,最佳工艺水平为A2B2C1D2,即微波辅助提取杜仲叶多糖最佳工艺条件是质量体积比1∶30、微波时间1.5 min、水浴温度40 ℃、微波功率230 W。

表2 正交试验结果表

2.1.3 不同品种杜仲叶多糖提取效果比较分析 以最佳提取条件对6个品种杜仲叶多糖进行提取,得到多糖得率如表3所示。6个品种杜仲叶多糖得率由大到小顺序为华仲24号>华仲15号>华仲1号>华仲12号>华仲13号>华仲5号。

表3 不同品种杜仲叶多糖得率分析Table 3 Analysis of extraction rate of polysaccharides from six E.ulmoides leaves

2.2 不同品种杜仲叶多糖结构组成分析

2.2.1 不同品种杜仲叶多糖单糖组成比较分析 6个品种杜仲叶多糖GC-MS结果显示,杜仲叶多糖主要由L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖6种单糖组成,在此基础上采用面积归一化法进行单糖组分计算,如表4所示。不同杜仲叶多糖中华仲1号的D-半乳糖(40.65%±0.09%)、L-鼠李糖(7.56%±0.08%)、D-阿拉伯(16.66%±0.06%)均高于其余5个品种。华仲5号的D-葡萄糖(47.59%±0.27%)最高,而L-鼠李糖(3.31%±0.04%)、D-木糖(2.91%±0.44%)、D-甘露糖(5.80%±0.54%)与其余5个品种相比最低。华仲13号的D-木糖最高。华仲15号的D-甘露糖(14.7%±0.11%)最高,而其D-半乳糖(27.16%±0.09%)最低。

表4 6个品种杜仲叶多糖单糖组成分析

图2 不同品种杜仲叶多糖的傅里叶红外光谱图

2.3 不同品种杜仲叶多糖抗氧化活性比较分析

图3-a为华仲13号的DPPH自由基清除能力曲线。在0.04～0.18 g·L-1范围内,随着多糖质量浓度升高,DPPH自由基清除能力也随之上升。IC50值常作为比较不同样品自由基清除能力的标准,IC50值越低,自由基清除能力越强[28]。根据图3-a自由基清除能力曲线,华仲13号的IC50值,即自由基清除率达50%时质量浓度为0.06 g·L-1。以此质量浓度为参考,测定华仲1号、华仲5号、华仲12号、华仲15号、华仲24号的DPPH自由基清除能力。如图3-b所示,相同质量浓度下,DPPH自由基清除能力从高到低为华仲1号>华仲13号>华仲12号>华仲24号>华仲5号>华仲15号。

a:华仲13号的DPPH自由基清除率曲线;b:在华仲13号的IC50值下不同品种杜仲叶多糖的DPPH自由基清除率。不同字母表示不同组别存在差异显著(p<0.05)。

3 结论与讨论

杜仲是中国著名乡土经济林树种,其应用产业涉及医药、食品和化工产品等多个领域,目前市场中杜仲产品有杜仲牙膏、杜仲茶和杜仲胶囊等[29]。针对不同种质资源杜仲叶多糖的研究可为优化杜仲资源的选育、发掘杜仲叶潜在价值提供重要依据。本研究以华仲1号、华仲5号、华仲12号、华仲13号、华仲15号、华仲24号6个品种杜仲叶为原料,采用微波辅助提取法,在单因素试验的基础上,使用正交试验优化杜仲叶多糖提取最佳条件,并对6个品种杜仲叶多糖结构及抗氧化能力进行比较。在单因素试验中,质量体积比大于1∶20以后多糖得率下降,出现这一现象推测是因为溶剂体积增大,溶质接受到的微波辐射下降,进而分子间相互作用下降,多糖溶出量下降[30]。在微波时间在0.5～1.5 min范围内,多糖得率随时间延长而上升,这是由于在一定时间范围内,随着时间的延长,微波辐射的热效应不断强化,细胞内部温度上升,且压力上升使细胞产生孔洞,增强了细胞溶出率和传质速率,多糖得率上升。当微波时间超过1.5 min、水浴温度超过60 ℃、微波功率超过385 W时,局部热量过高,提取液剧烈沸腾,可能导致多糖发生降解,使得率下降[31]。经过正交试验优化,杜仲叶多糖提取最佳条件为质量体积比1∶30、水浴温度40 ℃、微波时间1.5 min、微波功率230 W,在最佳提取条件下6个品种杜仲叶多糖得率分别为华仲1号6.90%±0.04%、华仲5号6.47%±0.13%、华仲12号6.68%±0.11%、华仲13号6.53%±0.07%、华仲15号7.21%±0.02%、华仲24号7.64%±0.05%。陈雪花等[32]使用超声波协同酶法优化杜仲叶多糖提取工艺,得到杜仲叶多糖得率达到4.79%,低于本研究结果,推测是由于该研究提取时间过短,多糖没有完全溶出。此外,本研究采用微波辅助提取法的提取结果优于传统热水提取法,这是因为传统热水浸提法提取时间过长且温度过高,多糖发生降解,从而造成杜仲叶多糖得率下降[33]。

通过对6个品种杜仲叶多糖结构研究发现,不同杜仲叶多糖具有相似的结构组成,均为吡喃多糖,且由L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成,这一结果与张学俊等[34]研究结果一致。D-葡萄糖和D-半乳糖摩尔比例均超过60%,但不同杜仲叶多糖单糖组成比例有差异。本研究中发现6个品种杜仲叶多糖均有良好DPPH自由基清除活性,当多糖质量浓度0.06 g·L-1时,华仲1号自由基清除力最高,达到59.14%,而华仲15号自由基清除能力较低,为35.23%。多糖质量浓度越高,抗氧化能力越强。本研究中杜仲叶多糖质量浓度为0.06 g·L-1,但与全熙宇等[21]与XU等[22]研究相比,同样也具有较好的抗氧化能力。6个品种组分抗氧化能力的差异,推测是单糖组成、多糖结构及分支程度等综合原因引起的。本研究结果将为杜仲叶这一新的药食同源资源的开发提供参考,并为开发新的抗氧化剂提供依据。