2%超分子水杨酸对UVB 所致小鼠光老化损伤的修复研究

孙晓娟 杜晓婕 周红梅 王瞾 曾维惠

光老化为皮肤老化过程中的主要环节, 其中UVB是光老化发生的主要因素［1］, 其能够使得皮肤组织逐渐干燥缺水, 角质层功能受到破坏, 出现皮肤松弛粗糙、质地较硬, 形成皱纹等, 若不及时予以规范化治疗,可能会进展为光化性角化病, 严重的可引起皮肤鳞状细胞癌［2］。光老化致皮肤损伤目前尚无有效根治药物,故探索防治UVB 所致光老化损伤为皮肤科研究热点之一。2%超分子水杨酸为近年皮肤修复的新药, 现代药理学已证实其不仅有抗炎作用, 还有抗紫外线损伤、双向角质调理作用［3］。现为进一步明确2%超分子水杨酸对UVB 所致光老化是否存在修复作用, 并分析其可能作用机制, 本研究应用UVB 辐照小鼠以构建光老化损伤动物模型, 观察2%超分子水杨酸作用后皮肤形态变化以及皮肤组织p21、p53 表达变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物 新型超分子水杨酸祛痘调理凝露［博任达生化科技(上海)有限公司］。

1.1.2 试验动物 6～8 周龄30 只健康SPF 级昆明雌鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司), 体重20～25 g, 饲养于动物实验中心SPF 级实验室, 试验期间所有小鼠均自由摄食饮水。

1.1.3 试剂和仪器 Masson 三色染色试剂盒、HE染色试剂盒(购于南京森贝伽生物科技有限公司)；UVB 辐射仪(美国SPECTRONICS)；荧光显微镜(美国AMSCOPE)等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组 随机将30 只试验小鼠随机分为空白对照组、UVB 组、UVB+2%超分子水杨酸组, 各10 只。

1.2.2 干预方法 三组小鼠均适应性饲养7 d。试验开始时, 空白对照组小鼠正常日光照射饲养, 时间为40 min；UVB 组、UVB+2%超分子水杨酸组小鼠予以UVB 辐照, 辐照开始前将小鼠背部5.0 cm×5.0 cm 的皮肤表面毛发剃除(试验期间每5 天剃除毛发1 次),然后用UVB 辐照仪照射(预热15 min)小鼠剃除毛发后的背部皮肤, 照射40 min/次(UVB 光源311 nm), 照射期间每15 分钟轮换1 次鼠盒位置, 保证每个饲养笼内小鼠接收到的UVB照射强度是相同的, 共照射12周,第1 周给予1×MED, 隔1 d 照1 次(3 次/周)；第2 周给予2×MED, 隔1 d 照1 次(3 次/周)；第3 周给予3×MED, 隔1 d 照1 次(3 次/ 周)；第4～12 周 给 予4×MED, 隔1 d 照1 次(3 次/周)；与此同时, UVB+2%超分子水杨酸组在UVB 照射后涂抹1 次2%超分子水杨酸, 非照射日也涂抹1 次, 空白对照组、UVB组不给予药物干预。

1.3 观察指标及判定标准

1.3.1 观察三组小鼠背部皮肤外形情况 最后1 次辐照结束后48 h, 试验人员对三组小鼠背部照射区域皮肤损伤程度进行评分, 评定标准：0 分：皮肤表面未见有红斑；1 分：皮肤表面有轻微红斑；2 分：皮肤表面有明显红斑；4 分：皮肤表面有紫红色红斑, 或有结痂；3 分介于2～4 分之间。

1.3.2 观察三组小鼠背部皮肤显微结构改变情况 试验人员肉眼观察小鼠背部皮肤后以断颈法将试验小鼠处死, 将日光照射或UVB 辐照小鼠的背部皮肤组织取下, 将取下的皮肤组织一半置于10%福尔马林溶液中固定保存, 将其制为病理组织切片；另一半皮肤组织去除皮下脂肪后将其置于冷冻0.9%氯化钠溶液中漂洗, 保存在-80℃冰箱中以用于制作皮肤组织匀浆。取福尔马林溶液固定的病理组织, 经酒精梯度脱水、石蜡包埋后制作切片, 分别进行HE 染色和Masson 染色。在荧光显微镜下观察HE 染色切片, 随机选择5 个视野,利用显微镜配置的微尺测量出小鼠背部皮肤表皮厚度、真皮厚度, 取5 个视野的均值作为最终测定结果。经Masson 染色的切片通过荧光显微镜观察皮肤组织中真皮胶原纤维排列情况, 并通过IMAGE-PRO PREMIER 2D 图像分析软件算出染为蓝色区域中胶原纤维光密度值, 以此结果作为胶原纤维的含量。

1.3.3 观察三组小鼠背部皮肤组织p21、p53 表达情况 应用免疫组化染色法, 取组织匀浆, 石蜡包埋制片(厚度4.0～5.0 μm), 经脱蜡→水化→过氧化氢灭活→微波修复抗原等步骤处理切片, 再分别滴加p21 单抗和p53 单抗, 孵育过夜后滴加二抗, 用磷酸缓冲盐溶液(PBS 溶液)反复冲洗样本3 次。最后给予二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木素、酒精梯度脱水, 二甲苯透明、中性树胶封片。在显微镜下观察切片, 结果判定标准［4,5］：p21 阳性表达：p21 主要位于细胞浆、细胞膜,见染色为棕黄色评定为阳性, 反之不着色评定为阴性；p53 阳性表达：p53 主要位于细胞核, 见着色为棕黄色评定为阳性, 反之不着色评为阴性。

1.4 统计学方法 应用统计学SPSS 25.0 软件处理数据。计量资料以均数±标准差 (±s)表示, 采用t 检验, 多组比较采用方差分析；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验, 等级资料予以秩和检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠背部皮肤外形情况比较 与空白对照组(该组小鼠背部皮肤色泽较腹部皮肤偏黑, 皮肤光滑无皱纹, 未见有明显红斑, 无明显毛细血管扩张等改变)相比, UVB 组小鼠皮肤粗糙, 有深皱纹毛孔扩大, 缺乏弹性, 皮肤呈褐黄色斑, 皮革样外观, 镜下见毛细血管扩张, 结痂, 为典型光老化特征, UVB+2%超分子水杨酸组皮肤外观有隐约褐色斑, 有散在、不规则褐色斑片,光老化症状较轻。三组背部皮肤损伤程度比较有明显差异性(P<0.05)；UVB 组背部皮肤损伤程度明显大于空白对照组和UVB+2%超分子水杨酸组, 有明显差异性(Z=3.964、2.893, P=0.000、0.004<0.05)；空白对照组与UVB+2%超分子水杨酸组皮损程度比较也有明显差异性(Z=3.183, P=0.001<0.05)。见表1。

表1 三组小鼠背部皮肤损伤程度比较(只)

2.2 三组小鼠背部皮肤显微结构改变情况比较 空白对照组小鼠背部皮肤镜下见皮肤表面结构完整, 真皮层纤维组织与表皮平行, 呈波浪状；UVB 组小鼠背部皮肤表皮显著变厚, 见有角化不全或过及, 真皮纤维组织与表皮分层不清楚, 分布不均匀；UVB+2%超分子水杨酸组小鼠背部皮肤表皮厚度较UVB 组少, 真皮纤维组织排列稀疏。三组表皮厚度、真皮厚度及真皮胶原纤维含量比较, 有明显差异性(P<0.05)；UVB+2%超分子水杨酸组和UVB 组表皮厚度、真皮厚度明显多于空白对照组, 真皮胶原纤维含量显著少于空白对照组,有明显差异性(P<0.05)；UVB+2%超分子水杨酸组表皮厚度、真皮厚度明显少于UVB 组, 真皮胶原纤维含量多于UVB 组, 有明显差异性(P<0.05)。见表2。

表2 三组小鼠背部皮肤表皮厚度、真皮厚度、真皮胶原纤维含量比较( ±s)

表2 三组小鼠背部皮肤表皮厚度、真皮厚度、真皮胶原纤维含量比较( ±s)

注：与空白对照组比较, aP<0.05；与UVB 组比较, bP<0.05

组别 只数 表皮厚度(μm) 真皮厚度(μm) 真皮胶原纤维含量(OD)空白对照组 10 18.55±1.80 350.08±35.16 0.46±0.05 UVB 组 10 79.68±21.37a 611.62±16.37a 0.15±0.30a UVB+2%超分子水杨酸组 10 60.99±11.49ab 467.94±20.71ab 0.32±0.03ab F 18.484 99.738 117.331 P 0.000 0.000 0.000

2.3 三组小鼠背部皮肤组织p21、p53 阳性表达比较免疫组化显示空白对照组未见有p21、p53 阳性表达。UVB+2%超分子水杨酸组皮肤组织p21、p53 阳性表达率低于UVB 组, 有明显差异性(P<0.05)。见表3。

表3 三组小鼠背部皮肤组织p21、p53 阳性表达比较［只(%)］

3 讨论

紫外线是引起皮肤老化的重要原因之一, 其皮肤组织表现主要是表皮组织变厚、组织角化过度并伴角化不全, 表皮与真皮纤维层次不清, 并且有退行性改变［6］。本研究中, UVB 组大鼠背部皮肤外观改变,而且UVB 组真皮厚度、表皮厚度明显增多, 真皮胶原纤维含量明显减少, 与上述光老化表现相一致。而UVB+2%超分子水杨酸组表皮、真皮厚度及真皮胶原纤维含量优于UVB 组, 由此可见本研究UVB 组构建的UVB 所致小鼠光老化损伤模型比较成功, 而2%超分子水杨酸对UVB 所致小鼠光老化损伤有一定修复作用。

大量研究报道［7,8］, UVB 对皮肤最明显的影响是急性炎症反应, UVB 照射剂量达到一定程度时可诱使角质形成细胞启动炎症级联反应, 与此同时UVB 还会激活核转录因子(NF-κB), 释放更多促炎细胞因子表达, 进而加剧皮肤老化进程。另有研究指出［9-11］, UVB辐照过度可导致活性氧(ROS)簇激活, 引起氧化应激反应, 上调基质金属蛋白酶(MMP)产生和活性, 从而导致真皮胶原纤维分解, 最终造成光老化, 因此, 抗炎、抗氧化及减少氧自由基生成、清除老化代谢产物是UVB 光老化的治疗原则。

p21、p53 为细胞老化标志物［12］, 本研究结果显示,UVB 组背部皮肤组织P21、p53 阳性表达率显著高于UVB+2%超分子水杨酸组, 与孙楠等［13］研究相一致,p21、p53 表达增加与抑制细胞周期依赖性激酶活性、细胞周期停滞有一定的相关性。而经2%超分子水杨酸处理后大鼠皮肤组织p21、p53 阳性表达显著减少,提示2%超分子水杨酸修复光老化皮肤损伤可能与通过调节皮肤组织p21、p53 表达有关。2%超分子水杨酸与传统水杨酸有明显不同, 其主要是利用超分子技术将水杨酸溶于水, 在制作过程中不使用任何有机溶剂, 故该产品较为温和, 发挥疗效的同时还可以降低对皮肤的刺激性［14-16］。2%超分子水杨酸有双向角质调节作用, 能够去除老化的角质层, 达到更新角质的治疗目的, 而且对于角化不成熟的角质层细胞还能够促进其成熟, 调节p21、p53 蛋白进而改善细胞周期停滞［17-19］。

综上所述, 2%超分子水杨酸对UVB 所致小鼠光老化皮肤有修护保护作用, 其机制与抑制凋亡相关基因p21、p53 表达有关。