睡眠调节相关褪黑素对类风湿关节炎滑膜细胞的作用

常乐 孙祯 蔡振煜 翁晓源 董学峰

摘要 目的：分析褪黑素对白细胞介素-17（IL-17）刺激下类风湿关节炎滑膜细胞活性及相关蛋白Rankl、Bcl-2和Bax表达水平的影响。方法：将类风湿关节炎滑膜细胞分为对照组、IL-17组及IL-17+褪黑素组，分别使用CCK8试剂盒以及蛋白质印迹实验检测细胞活性及相关蛋白Rankl、Bcl-2及Bax表达水平。结果：与对照组比较，IL-17组有更高的细胞活性（P<0.01）；而IL-17+褪黑素组的细胞活性低于IL-17组（P<0.01）。与对照组比较，IL-17组的Rankl、Bcl-2蛋白表达水平上升，Bax表达水平下降（P<0.01）；与IL-17处理组比较，IL-17+褪黑素组的Rankl、Bcl-2表达水平则下降，Bax表达水平上升（P<0.01）。结论：褪黑素能抑制IL-17对类风湿关节炎滑膜细胞的活性作用，同时褪黑素能减弱IL-17对類风湿关节炎滑膜细胞表达Rankl以及抗凋亡作用。

关键词 类风湿关节炎；白细胞介素-17；褪黑素；睡眠；昼夜规律

Effects of Sleep-regulated Melatonin on Synovial Cells in Rheumatoid ArthritisCHANG Le1，SUN Zhen1，CAI Zhenyu2，WENG Xiaoyuan1，DONG Xuefeng1

（1 Department of Internal Medicine，Quanzhou Medical College，Quanzhou 362000，China; 2 Department of Orthopedics，Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China）

Abstract Objective：To analyze the effect of melatonin on the activity of synovial cells and the expression of related proteins Rankl，Bcl-2 and Bax in rheumatoid arthritis stimulated by interleukin-17 （IL-17）.Methods：Rheumatoid arthritis synovial cells were divided into control group，IL-17 group and IL-17+melatonin group.Cell activity and expression levels of related proteins Rankl，Bcl-2 and Bax were detected by CCK8 kit and western blotting.Results：Compared with the control group，the IL-17 group had higher cell activity （P<0.01）.The cell activity of IL-17+melatonin group was lower than that of IL-17 group （P<0.01）.Compared with the control group，the expression levels of Rankl and Bcl-2 proteins in the IL-17 group increased，while the expression levels of Bax decreased （P<0.01）.Compared with the IL-17 treatment group，the expression levels of Rankl and Bcl-2 in the IL-17+melatonin group decreased，and the expression level of Bax increased （P<0.01）.Conclusion：Melatonin can inhibit the activity of IL-17 on rheumatoid arthritis synovial cells，and melatonin can reduce the expression of Rankl and anti apoptosis of IL-17 on rheumatoid arthritis synovial cells.

Keywords Rheumatoid arthritis; Interleukin-17; Melatonin; Sleep; Circadian rhythm

中图分类号：R593.22；R338.63文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2024.02.065

褪黑素是人体的一种内源性激素，主要由松果体分泌，它的分泌有昼夜规律并且和年龄有关，可以诱导自然睡眠并具有抗氧化和抗炎活性。白天的光照信息可以通过人和动物的视网膜、视神经传递到视交叉上核，从而抑制褪黑素的分泌，其含量低至几乎检测不到；然而褪黑素在夜间分泌量逐渐增多，于凌晨2～4点间达高峰［1-4］。由此可见，褪黑素分泌的高峰期正处于人和动物的睡眠期。褪黑素是一种天然有效的抗炎及抗氧化剂，富含电子的芳香系统及由氧甲基和氮乙酰基残基产生的化合物两亲性被认为是其功能的分子基础［5］。类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种由于滑膜增生导致关节破坏和残疾的慢性炎症性自身免疫性疾病。白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）是一种重要的炎症介质，可诱导成纤维细胞产生多种细胞因子，例如IL-6、IL-8和粒细胞集落刺激因子［6］。先前的研究表明，IL-17可增强成纤维滑膜细胞的迁移、侵袭，从而加重RA的后果［7］。本研究旨在探究褪黑素在IL-17刺激下的类风湿关节滑膜细胞中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

类风湿关节炎滑膜细胞（广州吉妮欧生物科技有限公司），在含10%胎牛血清（HyClone，Logan，UT，USA）的DMEM培养基（Gibco，Grand Island，NY，USA）中培养，放置于37 ℃，5%CO2的孵箱中。细胞因子IL-17（PeproTech公司）；褪黑素（索莱宝生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒（优逸兰迪生物科技有限公司）；Rankl、Bcl-2和Bax一抗（Abcam公司）。

1.2 细胞活性实验

将滑膜细胞以3×103/cm2的密度接种到96孔板中，分别在0 h，1 d及2 d时，随机取出一块96孔板，将CCK-8溶液（10 μL）添加到每个孔中，并在37 ℃下孵育1 h。然后使用酶标仪测量450 nm处的吸光度，以此来检测各组细胞在不同刺激下的细胞活性。

1.3 蛋白質印迹实验

将细胞在4 ℃下用裂解缓冲液裂解并以12 000 r/min离心30 min后收集上清液。将上清液与上样缓冲液混合并煮沸5 min。样品通过12%SDS-PAGE分离后，在60 V条件下转膜至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭2 h，4 ℃孵育过夜。之后再将一抗稀释，1∶1 000孵育结合目的蛋白，随后将膜用TBST洗涤3次，并在室温下予以1∶6 000或1∶10 000稀释的二抗孵育2 h。使用EC3成像系统（UVP Inc.，Upland，CA，USA）对条带进行可视化，并使用ImageJ软件（NIH）测量每个条带的光密度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0（IBM，Armonk，NY，USA）统计软件进行单因素方差分析及LSD-t组间两两比较，所有的数据用均数±标准差（±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 褪黑素抑制IL-17对类风湿关节炎细胞的活性作用

细胞活性实验结果显示，与对照组比较，0.1 mmol/L褪黑素对细胞活性的影响无统计学差异，而0.5 mmol/L褪黑素抑制细胞的活性，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。为了排除高浓度褪黑素本身对细胞的不良反应，后续研究采用对细胞活性无明显抑制作用的0.1 mmol/L的褪黑素浓度。结果显示，与对照组比较，IL-17（20 ng/mL）组可以提高细胞活性（P<0.01），而在相同时间点上，IL-17（20 ng/mL）+褪黑素（0.1 mmol/L）组的细胞活性低于IL-17（20 ng/mL）组（P<0.01）。见表2。这意味着褪黑素能抑制IL-17对类风湿关节炎细胞的活性作用。

2.2 褪黑素可减弱IL-17刺激下的类风湿关节炎细胞生成骨侵蚀因子Rankl，同时减弱细胞抗凋亡水平

蛋白质印迹法结果显示，与对照组比较，IL-17处理组的Rankl蛋白表达水平显著增多（P<0.01），这表明IL-17能促进类风湿关节炎细胞表达Rankl蛋白。而与IL-17处理组比较，IL-17+褪黑素组的Rankl表达水平则明显下降（P<0.01），这表明褪黑素能减弱IL-17对类风湿关节炎细胞表达Rankl的作用。见图1。而在凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax蛋白表达水平上，与对照组比较，IL-17处理组的Bcl-2蛋白表达水平显著增多（P<0.01），Bax蛋白表达水平显著增减低（P<0.01），这表明IL-17促进类风湿关节炎细胞抗凋亡能力提升。而与IL-17处理组比较，IL-17+褪黑素组的Bcl-2表达水平则明显下降（P<0.01），Bax蛋白表达水平显著增高（P<0.01），这表明褪黑素能减弱IL-17对类风湿关节炎细胞抗凋亡作用。见图2。

3 讨论

睡眠障碍是风湿病的一个常见但未被认识的特征。睡眠对人类免疫力有着重大而广泛的影响，对人类健康至关重要，并且越来越被认同是一种影响生活的行为。在新西兰进行的一项动物模型研究表明，睡眠不足会导致免疫紊乱，这不仅可能包括对病原体的反应降低，还可能破坏免疫自我耐受，从而导致自身免疫性疾病的出现。根据研究，50%～75%的RA患者患有睡眠障碍，睡眠质量差和总睡眠时间减少是RA患者的常见症状，失眠影响了一半以上的患者。

在横断面研究中，睡眠障碍与RA有关，但研究结果相互矛盾，尚不清楚睡眠问题是否是RA的独立风险因素。根据RA睡眠障碍队列研究的基线评估数据，87.4%的人睡眠时间短。随着疾病活动的恶化，包括疼痛、疲劳和功能障碍在内的身体健康状况受到影响，睡眠障碍变得更加常见。英国的一项队列的基线数据显示，类风湿因子水平与睡眠时间有关，这意味着睡眠时间可能会影响类风湿因子水平。这些结果表明，睡眠障碍可能导致类风湿性关节炎的发展［8］。

尽管有证据表明，这些患者在慢波睡眠期间的睡眠潜伏期更长，睡眠效率较差，觉醒次数更多，但是目前很少有对照研究对RA患者的睡眠进行定量评估。据我们所知，只有2项研究使用活动记录仪来评估RA患者夜间觉醒的次数。此外，大多数研究受到缺乏比较对照、样本量小和依赖传统睡眠评分方法的限制，相对缺乏对RA患者的睡眠和神经生物学机制进行综合评估的研究。

RA患者的睡眠质量比正常人群差，50%～75%的患者会出现睡眠问题，RA患者睡眠障碍可能跟疼痛、抑郁和疾病活动有关。RA患者已被证实昼夜节律存在异常，其关节肿痛、僵硬等临床症状晨起加重的临床现象被认为与患者体内的炎症介质如IL-6、IL-1、IL-2、IL-12、肿瘤坏死因子α等在夜间异常升高，而具有抗炎作用的皮质醇等激素分泌相对不足有关［9］。下丘脑-垂体-肾上腺轴损伤、褪黑素的水平波动可能在造成RA昼夜节律异常中起重要作用。褪黑素在负责调节昼夜节律外，被证明在哺乳动物中具有抗氧化、抗炎和免疫调节活性［10］。在一项涉及RA患者的临床试验中，褪黑素被认为是通过其抗氧化作用发挥着治疗的效果［11］。成纤维滑膜细胞是RA的关键参与者，其通过分泌细胞因子、炎症介质和降解细胞外基质的蛋白水解酶促进RA的进展。本人既往研究已证实IL-17可以促进类风湿关节炎细胞增殖，同时通过STAT3通路调控细胞自噬水平［12］。有研究支持IL-17在RA中具有促炎、加重关节损伤、促进免疫因子释放等作用［13］。本研究结果显示，褪黑素可以减弱类风湿滑膜细胞Bcl-2蛋白表达，升高Bax蛋白水平，意味着细胞的抗凋亡能力下降。

綜上所述，结合本研究结果，褪黑素能抑制IL-17对类风湿关节炎细胞的活性作用，同时褪黑素能减弱IL-17对类风湿关节炎细胞表达Rankl以及抗凋亡作用。因此，在临床治疗上，我们可以通过有效地管理睡眠，促进患者自身褪黑素水平的增加，可能会对减缓RA的症状有所作用。

利益冲突声明：无。

参考文献

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［12］CHANG L，FENG X，GAO W.Proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes is enhanced by IL-17-mediated autophagy through STAT3 activation［J］.Connect Tissue Res，2019，60（4）：358-366.

［13］陈向华，王建吉，耿学丽，等.白细胞介素-17对老年类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞增殖和趋化因子分泌的影响及作用机制［J］.中国老年学杂志，2018，38（1）：45-47.

基金项目：泉州医学高等专科学校校级课题青年科技（XJK1922B）通信作者：董学峰，E-mail：707683823@qq.com