桥本甲状腺炎伴甲状腺肿患者的肠道菌群特征研究

孟淑华 肖瑶 高云逸 魏军平

桥本甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis,HT)是一种临床上常见的自身免疫性甲状腺疾病,也是目前导致甲状腺功减退的主要原因[1]。我国HT的患病率为1.6%,发病率为0.69%,且近年来HT的发病率也逐渐升高[2]。该病临床特征主要包括甲状腺体积增大、淋巴细胞浸润以及甲状腺自身抗体水平升高。HT又分为甲状腺肿型和萎缩型,然而,HT以及造成两种不同类型的发病机制尚未完全明确,目前临床上针对HT的治疗也主要以改善甲状腺功能、调节免疫为主,针对甲状腺肿尚无特殊治疗方式。因此,需要从新的角度探讨HT及HT相关甲状腺肿的发生发展机制,以助开发新的治疗用药。 肠道菌群对人体健康存在影响已被广泛认可。近年来,随着16S rRNA测序技术的发展,肠道菌群与自身免疫性疾病以及内分泌代谢相关疾病的研究成为热点。研究表明,HT患者肠道菌群的丰度及多样性与健康人有明显差异,因此肠道菌群物种组成和丰度改变可能与HT发病相关[3-5]。同时,从组织胚胎学角度看,甲状腺是由原始消化管的前肠分化而来,肠道菌群的改变可能对甲状腺组织的形态、大小也存在一定的影响。然而,关于甲状腺肿与肠道菌群之间的关系尚不明确。因此,本研究采用16S rRNA测序技术对HT伴甲状腺肿患者、HT不伴甲状腺肿患者和健康人群进行肠道菌群检测,以观察HT及HT伴甲状腺肿患者的肠道菌群丰度、多样性等特征。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年10月至2021年12月于北京市西城区广外医院、中国中医科学院广安门医院招募的健康受试者(A组,n=10)、HT伴甲状腺肿患者(B组,n=9)、HT不伴甲状腺肿患者(C组,n=12)。

1.2 诊断标准

1.2.1 HT诊断标准:参考2008年中华医学会内分泌学分会发布的《中国甲状腺疾病诊治指南-甲状腺炎》[6]中HT的诊断标准。

1.2.2 甲状腺肿判断标准:甲状腺肿的判断以临床医生的望诊及触诊为主,其判断标准参见《诊断学》[7]:①甲状腺Ⅰ度肿大:外观上看不出,但触诊可以触及甲状腺;②甲状腺Ⅱ度肿大:既可以看到又可以触及甲状腺肿大,但肿大范围在胸锁乳突肌以内;③甲状腺Ⅲ 度肿大:肿大程度超过胸锁乳突肌外侧缘。

1.3 纳入标准

1.3.1 纳入桥本甲状腺炎伴甲状腺肿组、不伴甲状腺肿组的标准:①符合桥本甲状腺炎诊断标准;②近3个月内未服用硒酵母片(或胶囊)等硒制剂;③近3个月内未患有感染性疾病或服用抗生素类药物;④近3个月内未服用任何中药(包括中成药、成分明确的汤剂以及成分未知的偏方等);⑤近3个月内未服用过益生菌/益生元或其他微生态调节剂;⑥近3个月内未曾患过包括急性胃肠炎在内的任何肠道相关疾病;⑦年龄18～65岁;纳入患者需符合以上全部条件,任何一项为“否”,此受试者不能参加试验。

1.3.2 纳入健康受试组的标准:①无桥本病或甲状腺疾病及相关家族病史;②近3个月内未患有感染性疾病或服用抗生素类药物;③近3个月内未服用任何中药(包括中成药、成分明确的汤剂以及成分未知的偏方等);④近3个月内未服用过益生菌/益生元或其他微生态调节剂;⑤近3个月内未曾患过包括急性胃肠炎在内的任何肠道相关疾病;⑥年龄18～65岁。纳入人群需符合以上全部条件,任何一项为“否”,此受试者不能参加试验。

1.4 排除标准 (1)合并有感染性疾病、恶性肿瘤、冠心病、高血压、糖尿病、脑血管疾病、白血病、急性心力衰竭、急性冠脉综合征等严重基础疾病者;(2)妊娠期或哺乳期女性;(3)具有精神性疾病患者及不能配合完成试验期间实验室检查及问卷调查者。如以上任何一项为“是”,此受试者不能参加试验。

1.5 调查内容 (1)一般资料:包括受试者的性别、年龄、身高、体重、体重指数(BMI)、血压、心率等;(2)甲状腺功能及自身抗体水平:甲状腺功能包括:促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4);甲状腺自身抗体包括:甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)和甲状腺球蛋白抗体(Tg-Ab);(3)甲状腺超声检查;(4)甲状腺查体:包括甲状腺的质地、大小、是否触及结节及是否存在触痛等;(5)临床症状及中医基本证型:基本证型根据受试者临床症状及舌脉进行判定,分为阴证及阳证两大证型。

1.6 16S rRNA基因测序检测

1.6.1 粪便样本采集与保存:准备粪便样本收集套装(包括一次性采样拭子、稳定剂、防震袋、采样纸、一次性手套)交于受试者。告知受试者先排空尿液,戴上一次性手套取中层未被污染(未直接接触空气及便池)的新鲜粪便样本约2 g置于试管中,嘱受试者采集后立即交研究人员。待取得受试者的新鲜粪便样本后,立刻放入-80℃冰箱保存待行后续16S rRNA检测。

1.6.2 生物信息数据提取流程:①常规方法提取粪便样本中的总DNA;②针对V3与V4测序区域合成引物,进行PCR扩增;③将扩增后的PCR产物纯化并进行二次扩增,引入所需的接头序列,构建16S扩增子文库,并进行文库的纯化和质检;④运用Illumina MiSeq平台将质量良好的产物上机测序,得到原始数据。

1.6.3 生物信息数据分析流程:将高通量平台测序后得到的原始数据去杂处理后进行拼接,得到可用的优质序列数据,将相似度高于97%的序列聚类为1个操作分类单元(OTU),之后与相关的数据库比对并进行物种注释。基于OTU丰度进行Alpha多样性分析及Beta多样性分析,结果关联后得出肠道菌群的物种丰度及群落结构。Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性,使用mothur[9]计算Alpha多样性指数,以反映样本中微生物的丰富度和均匀度。其中,Chao1指数和ACE指数反映物种的丰富度,分别是使用Chao1和ACE方法估计所得样品中实际存在的物种数,数值越大说明物种越丰富;shannon为香农指数,评价物种数和各种间个体分配的均匀性两部分,其数值越大,说明样品多样性越高,个体分配越均匀;simpson为辛普森指数,是指随机抽取的两个个体属于不同种的概率,其数值越小,表明物种多样性越高。

2 结果

2.1 3组受试者一般情况比较 3 组受试者的年龄、性别比、身高、体重、BMI、血压(收缩压、舒张压)、心率等一般情况比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组受试者一般情况比较

2.2 HT受试者甲状腺功能、自身抗体水平及甲状腺结节伴随情况比较 依据检验结果参考值范围为标准将HT受试者分为甲功正常期、亚临床甲减期与甲减期;根据TPO-Ab及Tg-Ab>1 000 U/mL作为抗体高滴度的评判标准;根据甲状腺超声是否检测出甲状腺结节作为是否伴有甲状腺结节的评判标准。B组与C组间在甲功分期、甲状腺滴度、是否伴有甲状腺结节等方面差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 HT受试者甲状腺功能、抗体及超声情况比较 例(%)

2.3 肠道菌群分析结果

2.3.1 肠道菌群测序结果及OTU聚类分析:本研究共纳入31个样本,共得到4 238 310个原始序列;将原始序列进行拼接及过滤后,共得到1 437 030个序列。使用 USEARCH[8]将序列相似度>97%的序列聚类为1个OTU,OTU 聚类时将稀有序列弃去,最终共聚类为16 941个OTU,以OTU为基础进行多样性分析。由于每组均有多个样本,若检测到某个OTU样本数达到该组样本数量的50%以上,认为这组含有这个OUT。B组肠道菌群样品平均OTU;A组肠道菌群OTU(622.5±176.8)个相较于B组(544.2±194.4)个及C组(484.8±243.3)个更多,但OTU数目总体数差异无统计学意义(P=0.324)。此外,分析3组共有和特有的OTU发现,3组共有的OTU有120个,A组、B组、C组特有的OTU分别为123个、75个、15个。 见表3。

表3 3组OTU数量比较 个,

2.3.2 Alpha多样性比较:检测3组样本覆盖率均>0.99,表明样本中序列被检出的概率均很高。A组菌群的丰富度及均匀度较B组和C组更高,而C组的菌群多样性较B组更低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 3组受试者肠道菌群Alpha多样性指数

2.3.3 Beta多样性比较:Beta多样性反映的是不同样本间的微生物群落构成差异情况。本研究采用Unifrac生成群落间距离矩阵,计算不同样本间的差异。UniFrac度量方法又分为weighted UniFrac和unweighted UniFrac,其中unweighted UniFrac只考虑 OTU 组成,不考虑其丰度;weighted UniFrac则需考虑其丰度。unweighted UniFrac的聚类热图分析,热图以颜色代表群落距离,距离越小(越红)群落相似度越高,距离取值为[0, 1]。在不考虑OTU丰度的情况下,健康受试者的肠道菌群样本间差异更小,而HT患者(不论是否伴有甲状腺肿)样本间差异相对更大,但3组间差异不明显。weighted UniFrac的PCoA三维分析,坐标轴为 PcoA 降维后产生的新变量,括号内百分比为新变量的解释量。在考虑OTU丰度的情况下,3组间样本可呈现相互分离的趋势,且桥本伴甲状腺肿组间不同样本分布更离散,相似性更小。见图1、2。

图1 unweighted UniFrac距离热图;A 健康受试者;B 桥本伴甲状腺肿者;C 桥本不伴甲状腺肿者

图2 weighted UniFrac的 PcoA三维图;A 健康受试者;B 桥本伴甲状腺肿者;C 桥本不伴甲状腺肿者

2.3.4 物种分布及其丰度的比较:为探讨3组肠道菌群的分布特征,寻找组间在科、属水平的差异物种,行Kruskal-Wallis检验,找出差异显著的菌科和菌属。

2.3.4.1 在科水平上:B组患者的拟杆菌科(Bacteroidaceae)显著低于A组和C组,而普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)及韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)则显著高于A组和C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 3组肠道菌群科水平相对丰度水平(前10位) M(P25,P75)

2.3.4.2 在属水平上:B组患者的拟杆菌属(Bacteroides)显著低于A组和C组,差异有统计学意义(P<0.05),而B组的普氏菌属(Prevotella)显著高于A组和C组,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,HT患者的罗氏菌属(Roseburia)和布劳特氏菌属(Blautia)相对丰度较A组低,且B组较桥C组更低,但3组间Roseburia和Blautia比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 3组肠道菌群属水平相对丰度水平(前10位) M(P25,P75)

3 讨论

人体内的肠道菌群种类丰富,数量庞大,其复杂性与多样性是人类和微生物共同进化的结果,对人体健康有许多直接或间接的影响。随着近年来肠道菌群与甲状腺疾病研究的深入,证据表明可能存在一个甲状腺-肠轴使肠道菌群参与各种甲状腺疾病的发生发展之中[10]。本研究发现,从整体微生物群落构成角度来看，健康受试者肠道菌群的丰富度及均匀度较HT受试者更高,且HT伴甲状腺肿与HT不伴甲状腺肿2组间也具有菌群分布差异,说明HT患者肠道菌群的改变与是否伴有甲状腺肿有一定关系。此外,本研究从科、属水平对3组间的菌群丰度进行了非参数秩和检验,发现HT伴甲状腺肿组拟杆菌科及菌属的丰度显著低于其他2组,而普雷沃氏菌科、韦荣氏球菌科及普氏菌属的丰度则显著高于另外2组,说明这些菌科及菌属可能是区别HT是否伴有甲状腺肿的生物标志物。但由于是否伴有甲状腺肿是以临床医生查体作为判断标准,临床查体手法的差异可能在区别无甲状腺肿及Ⅰ度甲状腺肿时存在一定误差,可能对HT伴甲状腺肿组和HT不伴甲状腺肿组肠道菌群差异性分析造成一些影响。

HT分为甲状腺肿型和萎缩型。有研究认为,HT引起甲状腺肿的原因可能与细胞及抗体介导的甲状腺组织破坏、甲状腺功能受损,反馈性刺激腺体分泌TSH,进而刺激甲状腺细胞肿大有关,故甲状腺体积大小在一定程度上可能也反映了甲状腺局部免疫反应的情况[11]。此外,HT患者甲状腺体积/质量大小与甲状腺功能[12-13]、淋巴细胞浸润与局部水肿[14]、甲状腺细胞增殖与细胞凋亡关系的失衡[15]、血清TSH水平[16]和碘水平[17]等具有一定关系。肠道菌群对T细胞亚群介导的免疫调节、碘的吸收、细胞凋亡等方面都具有影响。拟杆菌属主要与免疫调节、碘吸收等方面相关。研究表明,脆弱拟杆菌的荚膜多糖可以刺激IL-10等免疫抑制因子的产生,并诱导激活其向Tregs转化[18],而Th17 /Treg细胞失衡与HT的发生密切相关;多形拟杆菌及其代谢产物也可通过减少与肠上皮细胞表面Toll样受体结合,抑制NF-κB活性,下调IL-6、IL-1β、TNF-α等下游炎性因子的表达,进而抑制局部免疫反应的发生[19]。此外,人体内有一种Na+/多种维生素转运蛋白,可以代表肠吸收碘的互补结构,若肠道菌群出现紊乱、肠黏膜屏障受损,则可能影响碘的吸收[20];而拟杆菌属可以促进短链脂肪酸的生成,进而保护肠黏膜屏障[21],对碘的吸收产生影响。本研究中,HT伴甲状腺肿患者拟杆菌属水平明显较其余2组降低,因此可能由于免疫调节或肠道黏膜屏障保护作用的减弱,造成甲状腺局部免疫反应增强及碘吸收减少,出现甲状腺肿明显的表现。同时,韦荣氏球菌科与普氏菌属则可能通过抑制细胞凋亡对HT及甲状腺肿产生影响。HT患者的甲状腺滤泡上皮细胞具有细胞凋亡现象,而一项针对HT患者甲状腺体积和全基因组的关联发现,AATF和SMARCA2这两个与细胞凋亡相关的基因与HT患者的甲状腺体积显著相关[22]。Ebersole等[23]发现,韦荣氏球菌科、普雷沃氏菌属与抗细胞凋亡相关蛋白如AKT3、PI3KCG、CSF2RB、PIK3CD、CFLAR等呈正相关作用。也有研究显示,进行益生菌、药物、灸法等干预前后,小鼠胰腺细胞[24]、肝细胞[25]和胃癌细胞[26]的凋亡情况与普雷沃氏菌的变化呈负相关关系,间接说明了普雷沃氏菌与细胞凋亡之间可能存在的联系。体外研究也表明,韦荣氏球菌科可能通过分泌GroEL蛋白激活CRC细胞的PI3K/AKT通路,从而抑制细胞凋亡[27]。本研究中,普雷沃氏菌、韦荣氏球菌在HT伴甲状腺肿组丰度较高,可能与这两种菌对细胞凋亡的抑制性影响相关。

综上综述,HT伴甲状腺肿患者的常见拟杆菌属等的丰度较HT不伴甲状腺肿者和健康受试者降低,而普雷沃氏菌科、韦荣氏球菌科及普氏菌属等丰度则较高。考虑到年龄[28]、性别[29]等因素对肠道菌群会产生影响,因此本研究根据纳入HT患者的基本情况对符合纳排标准的健康受试者进行匹配以减少偏倚。