脑胶质瘤组织ZEB2、CCL20表达及其与患者预后的相关性

肖仕和 李钢 刘仲海 刘珍

三亚中心医院 （海南三亚 572000）

脑胶质瘤是由神经上皮组织胶质细胞病变引发的肿瘤，是原发性中枢神经系统恶性肿瘤中最常见的肿瘤类型，占比高达50%左右［1-2］。目前，临床常给予手术切除、术后放化疗、免疫治疗等干预，但患者的预后极差，中位生存期仅10 ～ 15 个月，而导致脑胶质瘤患者整体生存时间短的潜在原因主要是其具有易侵袭、易远处迁移、易复发等特点，且其对临床治疗具有较强的抵抗性［3-4］。因此，寻找有效的预后标志物对于脑胶质瘤预后判断，并指导临床治疗具有重要价值。E 盒结合锌指蛋白2（zinc finger E-box-binding protein 2， ZEB2）是一种可参与多种肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡等过程的细胞因子［5］，MYUNG 等［6］表示，ZEB2 在儿童与成人胶质母细胞瘤中可调控肿瘤细胞的增殖与活性，影响肿瘤细胞的进展。CC 趋化因子配体20（CC chemokine ligand 20， CCL20）是一种重要的趋化因子，在多种癌症的浸润与转移中发挥关键作用，可参与血管生成、上皮间质转化（EMT）等多种病理过程［7］，SCHULZ 等［8］表示，前列腺癌细胞中CCL20 表达水平上调，其作为致癌因子参与前列腺癌的发生与发展。上述研究中ZEB2、CCL20 均与肿瘤的恶性生物学行为有关，但目前关于二者在脑胶质瘤患者肿瘤组织中的表达如何，是否与预后存在相关性，国内鲜见报道。鉴于此，本研究检测了脑胶质瘤患者肿瘤组织中ZEB2与CCL20 表达情况并分析了二者与脑胶质瘤患者预后之间的关系，以期为脑胶质瘤的临床治疗与预后改善提供思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017 年1 月至2020 年1 月在本院行手术治疗的156 例脑胶质瘤患者的肿瘤组织作肿瘤组。纳入标准：（1）均为原发性肿瘤；（2）切除的肿瘤组织经病理检查确诊为脑胶质瘤；（3）患者临床资料均保存完整；（4）术前均未进行放化疗等相关治疗。排除标准：（1）脑外伤、颅脑手术者；（2）合并其他部位或类型肿瘤者；（3）合并其他类型中枢神经系统疾病患者；（4）合并有严重并发症者；（5）合并有血液系统、免疫系统疾病、全身感染性疾病者；（6）合并心肝肾等脏器严重功能不全者。另收集同时期52 例在本院行其他脑部手术切除的正常脑组织为正常组。肿瘤组：男108 例，女48 例；年龄19 ～ 77 岁，平均（41.25 ±7.13）岁。正常组：男38例，女14例；年龄21 ～ 75岁，平均（41.75 ± 7.02）岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。本研究患者均知情并自愿签署知情同意书，且经本院医学伦理委员会审批（编号：LLKY210110）。

另收集患者的临床资料，包括：性别、年龄、术前卡式评分（KPS）、术前水肿、术前癫痫、肿瘤最大直径、肿瘤病理分级、手术术式、术后放疗、术后化疗、替莫唑胺使用情况等。

1.2 方法

1.2.1 组织样本收集及ZEB2、CCL20水平检测 采用免疫组织化学（SP）法检测组织ZEB2、CCL20 表达情况，试剂盒均购自上海雅吉生物科技有限公司。（1）术中获取组织样本并采用4%的多聚甲醛固定液（上海彩佑实业）于4 ℃下固定过夜；（2）固定好的组织样本制成蜡块并切成4 μm 厚的切片；（3）65 ℃下烤片1.5 h，二甲苯溶液脱蜡，梯度乙醇溶液水化，磷酸缓冲液（PBS）冲洗干净；（4）柠檬酸盐溶液（0.1 mmol/L，pH=6）高压抗原修复，PBS冲洗干净；（5）加入过氧化物酶阻断剂阻断10 min（避光环境），PBS 冲洗干净，再加入10%山羊血清封闭20 min 后擦去周边残余液；（6）加入一抗（均按照1∶100 稀释），4 ℃孵育过夜；次日取出，复温45 min，PBS 冲洗干净，加入二抗37 ℃孵育（ZEB2进行30 min，CCL20 进行20 min），取出并用PBS冲洗干净；（7）使用二氨基联苯胺（DAB）显色5 ～10 min，苏木素复染5 ～ 7 min，乙醇水化、二甲苯透明、封片、镜检。

1.2.2 免疫组化结果判定 由两位病理学医师结合双盲法判定。ZEB2 定位于细胞核，CCL20 主要定位于细胞质和膜。以染色强度与染色范围评分乘积判断：染色强度：不着色为0 分，弱着色为1 分，中等着色为2 分，强着色为3 分；染色范围：＜ 5%为0 分，5% ～ 25%为1 分，26% ～ 50%为2 分，51% ～ 75%为3 分，＞ 75%为4 分。两项评分乘积＜ 4 为阴性表达，≥ 4 为阳性表达［9］。

1.3 随访与预后分组 术后对脑胶质瘤患者随访3 年，随访形式为电话随访，截止至患者病死或2023 年1 月，根据患者随访结束时的生存情况进行分组，将随访结束时生存患者纳入预后良好组，将病死患者纳入预后不良组。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件分析统计学数据；“例（%）”描述计数资料，以χ2检验分析两组间差异；计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验；采用Kaplan-Meier 生存曲线分析脑胶质瘤患者肿瘤组织ZEB2、CCL20 表达水平与生存率的关系；采用COX 回归分析脑胶质瘤患者预后的影响因素；P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组与正常组组织中ZEB2、CCL20 表达量比较 SP 结果表示，肿瘤组ZEB2、CCL20 阳性表达率均高于正常组（P＜ 0.05），见表1 和图1。

图1 肿瘤组织与正常脑组织ZEB2、CCL20 表达（50 μm）Fig.1 Expression of ZEB2 and CCL20 in tumor tissue and normal brain tissue （50 μm）

表1 肿瘤组与正常组组织中ZEB2、CCL20 表达比较Tab.1 Comparison of ZEB2 and CCL20 expression between tumor group and normal group 例（%）

2.2 脑胶质瘤患者肿瘤组织ZEB2、CCL20 表达与生存情况的关系 156 例脑胶质瘤患者3 年生存率为69.87%（109/156）。ZEB2、CCL20 阳性表达患者的生存率分别为60.38（64/106）、58.16%（57/98），均低于ZEB2、CCL20 阴性表达患者生存率90.00%（45/50）、89.66%（52/58），差异有统计学意义（Log Rank χ2= 14.129、18.117，P＜ 0.001），见图2。

图2 脑胶质瘤患者肿瘤组织中ZEB2、CCL20 表达与生存率的关系Fig.2 Relationship between ZEB2 and CCL20 expression and survival rate in tumor tissues of glioma patients

2.3 预后不良与预后良好组脑胶质瘤患者临床资料比较 预后不良组年龄＞ 40 岁、肿瘤最大直径≥ 6 cm、肿瘤病理分级为Ⅲ-Ⅳ级、ZEB2 阳性表达、CCL20 阳性表达患者占比均高于预后良好组（P＜ 0.05），术前KPS 评分＞ 70 分、行全切除术、术后放疗、术后化疗、替莫唑胺化疗≥ 4 疗程患者占比均低于预后良好组（P＜ 0.05）；但其患者的性别、术前水肿、术前癫痫情况与预后良好组比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表2。

表2 预后不良与预后良好组脑胶质瘤患者临床资料比较Tab.2 Comparison of clinical data between the poor prognosis group and the good prognosis group of glioma patients例（%）

2.4 COX 回归分析脑胶质瘤患者预后的影响因素 将表2 中P＜ 0.05 的因素纳入为自变量，脑胶质瘤患者预后纳入因变量，进行COX 回归分析，变量赋值见表3。单因素COX 分析显示，年龄、术前KPS、肿瘤最大直径、肿瘤病理分级、手术术式、术后放疗、替莫唑胺疗程、ZEB2 表达、CCL20 表达均是脑胶质瘤患者预后的影响因素（P＜ 0.05）；多因素COX 回归分析表示，年龄、肿瘤最大直径、肿瘤病理分级、ZEB2 与CCL20 阳性表达均是导致脑胶质瘤患者预后不良的危险因素（P＜ 0.05），术前KPS、术后放疗、替莫唑胺疗程为保护因素（P＜0.05）。见表4。

表3 COX 变量赋值表Tab.3 COX variable assignment table

表4 COX 回归分析脑胶质瘤患者预后影响因素Tab.4 COX regression analysis of prognostic factors in patients with glioma

3 讨论

脑胶质瘤是一类发病率、复发率、致死率高，治愈率低，进展迅速的颅内恶性肿瘤，其发病率在全部颅内恶性肿瘤中的占比已高达81%，且呈现出明显的上涨趋势，但其5 年存活率却不足5%［10］。据统计，脑胶质瘤在国内的年均发病率已达到（5 ～ 8）/10 万，其5 年病死率在所有的全身性肿瘤中已高居第3 位，严重威胁着国人的生命健康［11］。目前，脑胶质瘤的治疗方法虽在不断创新、优化，但治疗效果不佳，对患者的生存与预后改善效果并不突出［12-14］，故探索与脑胶质瘤患者预后相关的生物因素非常必要。

ZEB2是一类由人2号染色体2q22.3区域Zfhxlb基因编码合成的锌指结构蛋白，具有EMT 诱导作用与促癌功效［15］。ZEB2可抑制E-cadherin表达，激活多种基质金属蛋白酶（MMP），诱发EMT，促进癌细胞浸润与转移［16］；其也可特异性结合E-cadherin基因转录调节区域的增强子，抑制E-cadherin 转录合成，促进癌细胞的游走、转移，导致癌症进展［17］。WANG等［18］表示，微小RNA可靶向抑制ZEB2表达，调控Wnt/β-catenin 信号通路抑制脑胶质瘤进展。CHENG 等［19］表示，ZEB2 的表达上调会促进神经胶质瘤的恶性进展。NAGAISHI等［20］表示，ZEB2 可促进脑胶质瘤皮肤转移，且越高级别的皮肤转移患者的ZEB2 表达水平越高。本研究发现，肿瘤组织中ZEB2 阳性表达率明显高于正常脑组织，ZEB2 阳性表达者的生存率明显低于阴性表达者，预后不良患者的ZEB2 阳性表达率高于预后良好患者，与上述报道的ZEB2 发挥促癌作用一致。推测ZEB2可能通过诱发EMT、诱导癌细胞浸润、远处转移等方式促进癌症进展、恶化，因此，ZEB2 表达水平升高，使得脑胶质瘤的恶化与进展越严重，生存预后越差。

CCL20 是1997 年由ROSSI 首次发现的一类对单核细胞、淋巴细胞、未成熟树突状细胞等多种细胞均具有趋化作用的细胞因子，可参与机体的免疫与炎症反应，与乳腺癌、结直肠癌等多种癌症的进展密切相关［21］。CHEN 等［22］表示，介导Wnt/β-catenin 信号通路可上调CCL20 表达水平，促进胶质瘤生长。FAN 等［23］表示，CCL20 高表达会导致肺腺癌患者EMT 效应显著增强，引发炎症反应，激活肿瘤坏死因子通路，促进癌症发展，是不良预后的重要标志；而当其被敲除后，患者癌细胞EMT 过程、增殖现象、对抗治疗反应等均受到明显抑制。NAN 等［24］表示，在食管癌患者中，启动子的低甲基化致使CCL20 在肿瘤细胞中的表达水平明显上调，CCL20 在食管癌中发挥促进癌症进展、引发免疫紊乱的作用。MO 等［25］表示，阴茎癌患者的血清CCL20 水平明显升高，CCL20 敲低可显著抑制癌细胞系中信号传导及转录激活因子-AKT信号通路，削弱MMP 表达，抑制癌细胞增殖、迁移、凋亡逃逸等恶性表现。本研究发现，肿瘤组织中CCL20 阳性表达率高于正常脑组织，CCL20 阳性表达者的生存率明显低于阴性表达者，预后不良者的CCL20 阳性表达率高于预后良好者，与上述报道的CCL20 发挥促肿瘤作用一致。推测CCL20 可能通过强化EMT 效应、诱发炎症因子表达、激活肿瘤因子通路、增加癌细胞恶性表现、对抗治疗等途径促进脑胶质瘤的发展，导致患者不良预后。

另本研究还发现，年龄＞ 40 岁、肿瘤最大直径≥ 6 cm、肿瘤病理分级为Ⅲ-Ⅳ级、ZEB2 与CCL20阳性表达均是导致脑胶质瘤患者预后不良的危险因素，术前高KPS、术后放疗、替莫唑胺疗程≥ 4 为保护因素，提示肿瘤组织ZEB2 与CCL20 表达情况均可用作脑胶质瘤患者长期预后评估指标，同时提示临床需增加对肿瘤组织ZEB2 与CCL20 阳性表达脑胶质瘤患者的关注度，及早实施特异性干预，改善患者生存预后。

综上所述，脑胶质瘤患者肿瘤组织ZEB2 与CCL20 表达均上调，两者均与脑胶质瘤患者预后相关，均可用于脑胶质瘤患者预后的临床评估，这些发现为进一步研究脑胶质瘤的发病机制、治疗靶点提供了有益的信息。不足之处：本研究样本量较小，且预后不良与预后良好组病例相差较大，结果可能存在偏倚。今后的研究中将对荷瘤模型小鼠及临床病理样本进一步验证，以更深入地阐明ZEB2 与CCL20 在脑胶质瘤中的功能和调控机制。

【Author contributions】XIAO Shihe designed the study and wrote the article.LI Gang and LIU Zhen collected all the case data. LIU Zhonghai revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.