拮抗CC趋化因子受体5信号诱导肿瘤细胞凋亡并调节肿瘤微环境抑制肿瘤生长

何伟 刘丽萍 卓静薇 张小冬 杨通 冯巨滨

广州医科大学附属第二医院（广州 510260）

长期以来，肺癌的发病率和病死率在各种恶性肿瘤中一直排在前列，尽管不断有新的治疗方法用于肺癌的治疗，但患者的5 年生存率仍然不到15%［1］。因此，迫切需要进行更全面深入的研究来提高患者的预后。肿瘤的生长和转移是一个多步骤而复杂的生物学过程，其中趋化因子发挥了十分关键的作用［2］。

趋化因子是一个包含各种可分泌蛋白质的大家族，它们通过与靶细胞表面的相应受体结合，调节各种与细胞归巢、迁移相关的病理或生理过程［3］。在生理情况下，趋化因子和受体主要表达于免疫细胞、内皮或上皮细胞、纤维母细胞、角质细胞等表面，其主要作用就是维持机体内环境稳定［4］。近来，越来越多的研究显示：肿瘤细胞也能够过表达趋化因子或受体，以自分泌的方式促进肿瘤的存活、增殖、侵袭和转移［5］。另外，高表达趋化因子的肿瘤细胞还能够通过配受体相互作用招募表达相应受体的抑制性免疫细胞进入微环境，从而形成抑制性免疫微环境，进一步促进肿瘤的生长和转移［6］。其中，CCR5 是研究最为广泛的趋化因子之一。CCR5，也称为CD195，是G 蛋白偶联受体超家族成员之一，其主要的配体有3 个，即：CC 趋化因子配体3（CCL3）、CCL4、CCL5［7］。CCR5 与配体结合主要参与人类免疫缺陷病毒（HIV）感染，细胞增殖、迁移、血管生成和细胞存活等病理或生理过程［7］。近来许多研究显示，肿瘤细胞可高表达CCR5 或其配体［3］，从而激活PI3K/AKT、NF-κB、ERK/MEK 和HIF-α 等信号通路，获得无限增殖和永生化特性［7］。另外，癌细胞也可以利用CCR5 信号通路，诱导调节性T 细胞（Tregs）、髓系起源抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等免疫抑制细胞异常迁移进入肿瘤微环境（TME），形成有利于癌细胞存活的环境［7-8］。然而，趋化因子在肿瘤发生发展中的作用才刚刚引起关注，很多问题尚未明确［9］。

本项目旨在检测Maraviroc 拮抗CCR5 信号通路，对Lewis 小鼠肺腺癌细胞存活和增殖的影响，重点关注肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和Treg 细胞的数量和比例的变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和抗体 CCK-8 试剂盒购自Dojindo公司。Maraviroc 由MedChem 公司提供。TSAPLus荧光双染试剂盒、即用型DAPI 染色液、荧光猝灭剂、抗荧光淬灭封片剂以及AnnexinⅤ-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。Alexa Fluor 488 和Alexa Fluor 594 联结的重组兔抗小鼠CD4 和CD8 单抗、正常山羊血清和兔抗小鼠Foxp3 单抗购自Abcam 公司。兔抗小鼠CCR5 多抗来源于北京博奥森生物技术有限公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔/小鼠二抗购自基因科技有限公司。Trizol RNA分离试剂购自MRC（Molecular Research Center， Inc）。M-MLV逆转录酶由Promega提供。ChamQ SYBR qPCR Master Mix 购自Vazyme Biotech 公司。Caspase 8（Cas8）基因引物序列如下［10］：正向：5'-TGAAGGACAGAAAAGGAACAA-3'；反向：5'-CTTGTTCACCGTGGGATAGATA-3'

1.2 动物和细胞株 Lewis 小鼠肺癌细胞株由广州呼吸疾病研究所刘明教授惠赠，在添加10%胎牛血清（Gibco），100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素的RPMI-1640 培养基（Hyclone）中，置于37℃，5% CO2的培养箱中传代培养。4 周龄雄性C57BL/6 小鼠购买自广州锐格生物科技有限公司，饲养于广州永诺医学实验动物中心。所有动物实验均获得广州永诺医学实验动物中心动物伦理委员会批准，并遵循实验动物的护理和使用指南。

1.3 细胞毒性实验 CCK-8实验如之前所述［11］。收获生长至70%汇合的Lewis 细胞，按1.0 × 104个/孔接种到96 孔板中培养12 h，然后去除上清液，加入含有5 μmol/L Maraviroc 或DMSO（对照组）的培养基继续培养24、48、72、96、120、144、168 h。每孔设2 个复孔。在结束培养前4 h，去除上清液，加入含有10 μL CCK-8 溶液的110 μL 培养基，继续孵育4 h。最后，用酶联免疫测定仪在450 nm 处检测每个孔的光密度（OD），并计算2 个复孔的平均OD值。实验重复3 次。

1.4 凋亡检测 按前述方法收获细胞并接种到96孔板中培养12 h，然后除去上清，加入含有5 μmol/L的Maraviroc 或DMSO 的培养基继续培养144 h 后，收获细胞进行Annexin V 和PI 染色。使用MoFlo免疫细胞仪系统（Dako）进行流式分析，并使用FlowJo 软件（TreeStar）分析数据。每孔设2 个复孔，实验重复3 次。

1.5 RT-PCR 分析Cas8 基因表达 如前所述，将接种至96 孔板中的细胞用Maraviroc 或DMSO 处理144 h 后，收集细胞，分离总RNA，将含有2 μg 总RNA 和1 μg 引物的10 μL 无RNase 水加热至75℃5 min，然后立即在冰上冷却5 min。随后加入反应缓冲液、dNTPs、无RNase 水和逆转录酶，将终体积为25 μL 的反应混合物在42 ℃下孵育60 min。在RT-PCR仪（ABI StepOnePlus）上定量分析Cas8基因的mRNA 水平。GAPDH 作为内参照。每孔设2 个复孔。实验重复3 次。

1.6 同基因小鼠肺癌模型的建立 将1.0 × 106个Lewis 细胞皮下接种至每只小鼠的右侧腹。保证所有小鼠只出现一个皮下肿瘤。一旦肿瘤直径达到0.5 cm，将小鼠随机分为两组（每组4 只）。实验组每2 d 腹腔内注射Maraviroc（30 mg/kg），对照组接受等体积的无菌PBS。每3 d 测量一次肿瘤大小，并根据以下公式计算肿瘤体积：体积=（长×宽2）/2。在第12 天处死所有小鼠，取出肿瘤块，在室温下置于4%缓冲的多聚甲醛中固定30 min，然后石蜡包埋。

1.7 免疫荧光染色 将石蜡包埋组织制成5 μm切片，然后脱蜡至水。按操作指南依次进行抗原修复、阻断内源性过氧化物酶后，用PBS 洗涤3 次，5 min/次。切片甩干后，滴加正常山羊血清封闭30 min。对于CCR5 和CD4 或CD8 双染，以1∶1 000 稀释加入CCR5 多抗以覆盖组织切片，4℃ 孵育过夜。PBS 清洗3 次。然后滴加50 μL HRP 标记的抗兔二抗，RT 下孵育50 min。3 次清洗后，滴加50 μL TSA555（CD4 和CCR5 染色）或TSA488（CD8 和CCR5 染色）工作液，RT 避光孵育10 min，然后清洗3 次。为了去除已结合的一抗、二抗，将组织切片置于充满柠檬酸钠缓冲液的修复盒中，微波加热至95 ℃，持续15 min。为进行第2 个一抗染色，以1∶200 稀释加入Alexa-Fluo 联结的CD4 或CD8 单抗，并如前所述进行孵育。然后PBS 清洗3 次，进行DAPI 细胞核复染和荧光猝灭。清洗甩干切片后封片。最后用BK6000-FL 荧光显微镜（重庆奥泰克）观察免疫荧光。对于CCR5 和Foxp3双染，将1∶1 000 稀释的CCR5 多抗用作第1 个一抗，以HRP 标记的抗兔抗体用作二抗。TSA-488染色工作液作为荧光显示剂。如前所述去除结合的一抗和二抗后，1∶500 稀释的抗Foxp3 单抗和HRP 标记的抗兔抗体分别用作第2 个一抗和二抗。TSA-555 溶液为荧光显示剂。其他步骤如前所述。采用Image J 软件（1.53t，美国国立卫生研究院） 随机选择3 个200 倍放大视野测量阳性信号强度或面积。

1.8 统计学方法 所有数据均以均数±标准差表示。GraphPad Prism v.5.01 软件用于绘图和统计分析。采用双侧非配对Studentt检验对两个均值进行比较。使用双向方差分析比较相对细胞活力和肿瘤体积，然后进行Bonferroni 多重比较分析。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外阻断CCR5 信号可能通过诱导凋亡来抑制Lewis 细胞的增殖 为了探讨CCR5 拮抗剂对Lewis 细胞生长的体外影响，建立了Maraviroc 和Lewis 细胞共培养体系，数据表明：与对照组相比，从共培养后72 h 开始，Maraviroc 可明显（P＜ 0.05）抑制Lewis 细胞的生长（图1A）。接下来通过流式细胞术分析细胞凋亡。Annexin V 阳性细胞的百分比被用作评估凋亡的指标。见图1B 和1C，在共培养144 h 后，与对照组相比，实验组细胞凋亡增加了近3 倍（P＜ 0.001）。随后基因表达分析显示：Cas8 基因的表达增加了近3 倍（图1D）。表明拮抗CCR5 可能通过增强凋亡诱导基因（如Cas8）的表达从而增强细胞凋亡来抑制Lewis 细胞的生长。

图1 拮抗CCR5 信号可能通过诱导凋亡来抑制Lewis 细胞的体外增殖Fig.1 CCR5 blockade markedly inhibited the in vitro proliferation of Lewis lung cancer cells presumably by apoptosis induction

2.2 拮抗CCR5 信号在体内抑制Lewis 细胞的生长 为了阐明Maraviroc 对Lewis 细胞体内生长的影响，建立了肺癌同基因小鼠模型。见图2B，实验组小鼠的肿瘤生长明显慢于对照组（P＜ 0.001）。在第12 天，测量瘤块体积显示：实验组肿瘤平均体积明显大于对照组（图2A，P＜ 0.001）。表明Maraviroc 可抑制Lewis 细胞的体内生长。

图2 拮抗CCR5 抑制Lewis 细胞的体内生长Fig.2 CCR5 blockade retarded the in vivo growth of Lewis lung cancer cells

2.3 拮抗CCR5 信号可增加TME 中CD4+和CD8+细胞的比例而减少Foxp3+细胞的比例 免疫荧光染色显示：与对照组相比，实验组瘤组织中发现了更高比例的CD4+细胞（图3A-B，P= 0.016 4）和CD8+细胞（图3C-D，P= 0.011 6）。而Foxp3+细胞的情况正好相反。对照组瘤组织中Foxp3+细胞比例反而比实验组更高（图3E-F，P= 0.004）。

图3 拮抗CCR5 明显增加肿瘤组织中CD4+和CD8+细胞比例及减少Foxp3+细胞比例Fig.3 CCR5 blockade induced more CD4+ and CD8+ cells but less Foxp3+ cells gathering in tumor tissues

3 讨论

近年来，在癌症诊疗领域出现的进展中，趋化因子和受体无疑是最具吸引力的发现之一。趋化因子及其受体最初被认为是许多正常生理过程的介质［12］。然而，最近发现许多肿瘤可异常表达趋化因子和（或）其受体，利用趋化因子信号通路支持自身的生长和进展［3］。其中，CCL5/CCR5 是研究最广泛的配体/受体对之一。

CCL5，也称为RANTES，是C-C 趋化因子配体5 的缩写。虽然CCL5 可以与CCR1、CCR3、CCR4和CCR5 结合，但它对CCR5 的亲和力最高。在过去的十年里，越来越多的研究数据表明：CCR5/CCL5 信号通路参与了肿瘤的发生、生长和转移。一方面，肿瘤细胞具有异常升高的CCR5 和（或）CCL5 表达，以自分泌的方式促进肿瘤生存和进展［4］。另一方面，趋化因子的异常表达可以旁分泌的方式将抑制性免疫细胞募集到TME 中，从而导致肿瘤免疫逃逸［13］。TME 是指肿瘤细胞所处的内外环境，它是一种复杂的结构，由多种细胞类型和分子组成，如成纤维细胞、内皮细胞、周细胞、免疫细胞、生长因子、细胞因子和趋化因子等［14］。其中，趋化因子和受体是肿瘤细胞与其他细胞相互作用的主要信使之一。最近发现，一些抑制性免疫细胞，包括Tregs、MDSCs、TAMs 和癌症相关成纤维细胞（CAFs）等，可高表达CCR5，通过与肿瘤细胞分泌的CCL5 相互作用，异常迁移至TME 中，从而形成免疫抑制环境，阻止肿瘤细胞被免疫系统识别和杀死［6］。

然而，由于趋化因子/受体网络的复杂性，仍有太多细节未知。目前，CCL5/CCR5 信号轴在肿瘤发展中的作用仍然存在争议。它既可以促进肿瘤生长，也可能具有抗肿瘤作用。例如在乳腺癌［15］和结直肠癌［16］中，就分别报道了CCR5 信号对肿瘤生长截然相反的影响。此外，研究人员认为：每种肿瘤都有其独特的TME。结直肠癌和胰腺癌细胞通过分泌CCL5 将大量CCR5+Tregs 募集到TME中，以促进肿瘤侵袭和扩散［17-18］。而胃癌［19］或恶性黑色素瘤［7］的TME 中则发现高表达CCR5的MDSCs 大量积聚。TAMs［8］和TAFs［20］也可以利用CCL5/CCR5 信号通路，帮助形成免疫抑制性TME。但人们对肺癌的TME 却知之甚少。笔者既往研究［11］表明：CXC 趋化因子受体4（CXCR4）及其特异性配体，CXC 趋化因子配体12（CXCL12），参与了肺癌细胞的增殖、迁移和血管生成，而有关TME 的情况尚不清楚。有研究［21］显示：肺癌分子靶向治疗的耐药可能与TME 有关，而CCL5 表达与肺腺癌的低生存率相关，这表明：肺癌的TME影响了患者的疗效，CCL5/CCR5信号可能通过TME参与肺癌的进展［22］。总之，在CCR5 靶向治疗大规模用于临床之前，还需要更多更深入的研究。

本研究采用小鼠Lewis 细胞作为模型，使用CCR5 选择性抑制剂阻断CCR5 的内在化和由此产生的信号转导，发现可延迟Lewis细胞的生长。随后FACS 和PCR 证明这可能是靶向CCR5 信号提高了Cas8 基因的表达而增强细胞凋亡的结果。因为该基因的表达和激活是细胞凋亡的重要启动因子之一。但要注意的是，细胞凋亡是凋亡诱导和凋亡抑制基因共同作用的结果。本研究数据并没有提供凋亡抑制基因如Bcl-2、Bcl-xL的表达情况。接下来，建立了具有免疫活性的同基因小鼠肺癌模型。本研究发现：拮抗CCR5 延缓了Lewis 癌肿的生长。由于在癌症患者的肿瘤中发现Treg 细胞增加且与预后相关［23］，因此比较了肿瘤组织中CD4+、CD8+和Foxp3+细胞的百分比，结果发现：在阻断组中有更多的CD4+和CD8+细胞，Foxp3+细胞则更少。考虑到CD4+和CD8+细胞主要由T淋巴细胞组成，因此可以推测：阻断CCR5 信号增强了T 淋巴细胞对TME 的浸润。同样，Foxp3+细胞主要由Treg 细胞构成，这表明：拮抗CCR5 信号可能抑制了Treg 细胞在瘤组织中的聚集。综上所述，可以合理地推测：拮抗CCR5信号可增加免疫效应细胞而减少免疫抑制细胞在瘤组织中的聚集，从而重塑肿瘤免疫微环境，激活抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长。TME 中的CD4+和CD8+细胞主要由T 淋巴细胞组成，被称为TILs，在抗肿瘤免疫中起着关键作用。大多数Foxp3+细胞是Tregs，它是最常见的抑制性免疫细胞，对抗肿瘤免疫具有很强的抑制作用。正是基于此发现，推测：CCR5阻断可能通过削弱TME的免疫抑制来激活抗肿瘤免疫。然而，应特别注意几点：首先，除了T淋巴细胞外，CD4+细胞还包括少数具有免疫抑制作用的Treg。其次，更多的CD4+和CD8+细胞不一定代表更强的抗肿瘤免疫。Treg 减少并不意味着免疫抑制减弱。因此还需要对免疫细胞的功能进行研究。最后，除了Tregs，其他细胞，如TAM，也可能参与癌症TME 的免疫抑制［24］。为了解决这些问题，还需要进行更深入和全面的研究。

在过去的二十年里，由于靶向治疗和免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现，肺腺癌患者的预后显著改善。但患者的5年生存率仍低于15%［1］。基于CCR5在癌症发生和发展中的重要性，一些CCR5 拮抗剂已被测试用于治疗某些类型的癌症，如胰腺癌、乳腺癌、肝细胞癌等，并获得了一些令人兴奋的临床前数据［6］。目前的研究为CCR5 拮抗剂作为一种新的靶向治疗方法在肺腺癌中的未来临床应用提供了支持性的临床前数据。此外，虽然ICIs 免疫疗法为包括肺癌在内的许多癌症的治疗带来了突破，但癌细胞总是能够进化出一些逃避宿主免疫系统攻击的机制，即免疫逃避［25］。故此，只有一小部分癌症患者可以从ICIs 疗法中最终受益［26］。幸运的是，最近临床前研究发现：CCR5 拮抗剂与ICIs 联合可协同抑制胰腺癌［27］和结直肠癌［28］肿瘤的生长，这强烈提示：CCR5 拮抗剂可以在一定程度上逆转肿瘤细胞对ICIs 的耐药性，增强其疗效。

综上所述，本研究表明：拮抗CCR5 信号可以重塑肺腺癌的免疫微环境，这将为未来联合CCR5拮抗剂和ICIs 治疗肺癌的研究提供一个良好的开端。

【Author contributions】HE Wei and FENG Jubin conceived the experimental design and wrote the manuscript. HE Wei， LIU Liping，ZUO Jingwei， ZHANG Xiaodong and YANG Tong conducted the experiments. LIU Liping， ZUO Jingwei and ZHANG Xiaodong analyzed the obtained data. All authors read and approved the final manuscript.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.