高效液相色谱-内标法测定香辛料中15种多环芳烃类污染物（PAHs）

侯美玲，冯桂蓉，蔡小钦，黄丹丹，董宪兵

（重庆市食品药品检验检测研究院，国家市场监管重点实验室（调味品监管技术），重庆 401121）

多环芳香族碳氢化合物（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是一类具有“致畸、致癌、致突变”特性的环境污染物，因其危害性较大，美国环保署已将其中的16 种列为监测重点对象，欧盟食品安全局也对其中8 种做了限量要求，并选取了4 种（䓛、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽和苯并[a]蒽）作为评价食品中PAHs 污染的指标[1]。我国现行污染物限量标准（GB2762）中对苯并[a]芘作了限量要求，类别包括乳制品、谷物、肉类等，与欧盟等国外标准相比，无论品种还是限量，目前均存在一定差距。目前对香辛料中多环芳烃的检测方法以及污染水平国内未见相关报道，重庆作为香辛料盛产基地，在全国调味品市场占有十分重要地位，因此，有必要建立香辛料中多环芳烃的检测方法，对我市地产香辛料中多环芳烃污染污染状况及其生态防治研究具有重要意义。

多环芳烃检测方法中，气相色谱质谱法和高效液相色谱法运用较广，其中，高效液相色谱法法操作相对简单，灵敏度高，被广泛运用于地下水、熏烤肉制品、植物油等食品中多环芳烃的检测[2,3]。前处理方面主要有固相萃取方法或者不同固相萃取小柱串联的方式[4,5]、凝胶渗透色谱法[6]、QuEChERS法（Quick,Eeasy,Cheap,Effective,Rugged and Safe）[7]、超分子溶剂微萃取[8,9]等技术。香辛料基质复杂，内含色素、糖类、有机酸、甾类等多种成分，现行报道的检测方法大多数为有机溶剂提取，外标法定量，前处理对于香辛料类来说，存在的难点为：一是正己烷等脂溶性有机试剂提取目标物的同时也会将香辛料中油脂等杂质提取出来，净化时会堵塞小柱，净化效果不佳；二是香辛料中色素等杂质未能去除，上机前样品颜色太深，容易堵塞仪器；三是外标法定量，目标物回收率太低，数据重现性不好。

本研究选取来自市内不同种植基地花椒（青花椒、红花椒）和辣椒（二荆条、小米辣、石柱红）样品，建立了香辛料中多环芳烃污染的高效液相色谱-荧光检测器结合内标定量方法，同时采用统计学方法对不同区县、不同品种的香辛料样品中多环芳烃污染水平进行分析，以期为香辛料的食品安全科学监管，以及评价其环境污染程度及生态风险提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣椒和花椒样品均来自市内各种植基地，详见表1。

表1 香料样品信息Table 1 Sample information of spices

PAHs 混合标准溶液（含萘（Nap）、苊（Ace）、芴（Flu）、菲（Phe）、蒽（Ant）、荧蒽（Fle）、芘（Pyr）、苯并 [a]蒽（BaA）、䓛（Chr）、苯并 [b]荧蒽（BbF）、苯并[k]荧蒽（BkF）、苯并 [a]芘（BaP）、茚并 [1,2,3-c,d]芘（Inp）、二苯并[a,h]蒽（DahA）和苯并[g,h,i]苝)（BghiP）（200 μg/mL），上海安谱实验科技股份有限公司；苯并 [a]芘标准溶液-D12（BaP-D12）（200 μg/mL），上海安谱实验科技股份有限公司。

C18 多环芳烃专用色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），上海安谱实验科技股份有限公司；弗罗里硅土（Florisil）固相萃取小柱（500 mg，6 mL），华谱生物科技（重庆）有限公司；QuEChERS 净化管（2 mL），华谱生物科技（重庆）有限公司；高效液相色谱仪—荧光检测器（U3000），赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

氢氧化钠溶液（5 mol/L）：称取20 g 氢氧化钠，用水定容至100 mL，临用现配。

1.2 样品前处理

提取：称取1 g 试样于50 mL 离心管中，加入100 μL BaP-D12内标使用液（100 ng/mL），加入5 mL氢氧化钠溶液（5 mol/L）涡旋，超声10 min，加入10 mL 乙腈溶液，超声30 min，5 000 r/min 离心，上层溶液于30 ℃氮吹干，10 mL 正己烷溶解，待净化。

净化：Florisil 小柱依次用3 mL 正己烷，3 mL二氯甲烷活化，将正己烷溶解液转移至小柱中，流量控制1 mL/min，待样液全部通过小柱后，依次用5 mL 正己烷和10 mL 二氯甲烷淋洗和洗脱，收集洗脱液于30 ℃氮吹，乙腈定容至1 mL，待测。

1.3 液相条件

流动相：A 乙腈和B 水。

梯度洗脱时间：0～25 min，40% A；25～35 min，40% A～100% A；35～40 min，100% A；40～45 min，40% A。

流量：1.0 mL/min。柱温：30 ℃。进样量：10 μL。波长设置：见表2。

表2 多环芳烃的波长切换参数Table 2 15th PAHs parameters of excitation wavelength and emission wavelength and switching time

1.4 数据处理

采用Dionex UltiMate 3000 的Chromeleon 色谱管理系统软件计算样品含量，试验数据的统计分析用SPSS 22.0 以及Origin Pro 2022 进行。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的优化

多环芳烃属于非极性物质，常用提取溶剂有正己烷、石油醚、乙腈等[10-12]，因正己烷极性较弱，根据相似相溶原理，选取正己烷当提取液，分别对阴性辣椒、花椒以及试剂空白进行同一质量浓度（20 μg/kg）加标试验。实验发现，试剂空白和花椒样品中多环芳烃化合物能有效分开，响应较稳定，回收率分别在81.40%～101.59%、74.06%～91.08%范围内，辣椒中多环芳烃响应值明显下降，回收率在3.22%～22.42%之间，且杂质峰较多，影响目标物出峰。因辣椒中主要含有辣椒素，辣椒素极性与多环芳烃类似，且具有荧光性质[13]，通过前期的实验摸索，我们推测辣椒素是影响辣椒中多环芳烃响应值的主要因素，因此，实验分别配制了含辣椒素与不含辣椒素的多环芳烃标准溶液进行对比（图1）。结果发现，含有辣椒素200 ng/mL 的多环芳烃与不含辣椒素的多环芳烃响应值相差不大，但含有辣椒素40 μg/mL 的多环芳烃响应值仅为不含辣椒素的十分之一，即多环芳烃响应值随着辣椒素浓度的升高而降低。辣椒素是辣椒的主要成分，不同辣椒的辣椒素含量虽不尽相同，但基本都在mg/kg 以上，含量较高[14]。有研究表明，辣椒素能抑制负责致癌多环芳烃代谢的芳香烃羟化酶，从而能够对多环芳烃诱导的癌症具有保护作用[15]，这也可能是辣椒素影响多环芳烃的原因之一，但具体影响机制有待进一步研究。

图1 添加不同浓度辣椒素的多环芳烃标准溶液响应值比较Fig.1 Comparison fluorescent response of standard solution of polycyclic aromatic hydrocarbons containing different concentrations of capsaicin

辣椒素因含有酚羟基，能溶于碱性水溶液，碱水法目前在辣椒素的分离、纯化中运用较广泛[16]，因此，本研究考虑采用氢氧化钠溶液去除辣椒素的干扰。分别对比了添加氢氧化钠和不添加氢氧化钠溶液的回收率（图2）。结果表明，加氢氧化钠的样品，多环芳烃回收率能提高1 倍左右，提取效率大大提高。

图2 加氢氧化钠和不加氢氧化钠的多环芳烃回收率对比Fig.2 The recovery of adding sodium hydroxide and not adding sodium hydroxide

多环芳烃属于亲脂性化合物，水溶液中多环芳烃需用有机溶剂萃取，本文分别考察了乙腈、正己烷、丙酮、二氯甲烷提取效果。向阴性辣椒基质中加入20 μg/kg 多环芳烃标准物质，比较提取效率。结果发现，4 种试剂的回收率范围在42.26%～64.07%之间，各试剂间回收率差别不明显，但是丙酮和二氯甲烷提取液的颜色更深，后续较难净化，这可能是因为一些脂溶性色素在丙酮和二氯甲烷中溶解性更好导致[17]，其中二氯甲烷因密度大，目标物在下层，萃取不方便。乙腈和正己烷溶液去除色素效果更好，正己烷沸点较低，在后续超声及转移过程中容易挥发，综合分析，采用乙腈作为萃取溶剂。

2.2 内标的选择

受杂质影响，辣椒中多环芳烃响应值较低，加入碱性溶液后回收率虽有所提高，但也仅在60%左右。为了提高数据的准确性，本文考虑使用内标对目标物进行校正。目前内标法一般与气相色谱-质谱法结合测定多环芳烃运用较多，如沙贤亮等[18]、孙细珍等[19]和钱雅慧等[20]基于同位素内标分别建立了辣条、中药材以及土壤中多环芳烃测定方法，并取得了很好的效果，暂未有内标法与液相色谱法结合测定多环芳烃的报道。因辣椒中多环芳烃的独特性，本文考虑使用跟多环芳烃性质类似的同位素化合物作为内标，主要难点是将同一种化合物与其同位素内标峰有效分开。实验分别配制了苯并[a]蒽-D12（BaA-D12）、䓛-D12（Chr-D12）、苯并[b]荧蒽-D12（BbF-D12）、苯并[k]荧蒽-D12（BkF-D12）、BaP-D12共5 种内标标准溶液进行上机测试，并分别与各自外标溶液出峰时间进行对比（图3）。实验发现：通过调节梯度，Chr-D12与Chr 以及BbF-D12和BbF 能有效分开，但Chr-D12与BaA、BbF-D12与Chr 出峰时间相近，对目标物存在一定干扰。BaA-D12与BaA、BkF-D12与BkF以及BaP-D12与BaP 均能有效分开，适合作内标，但个别品种辣椒在BaA-D12出峰附近有杂质峰，难以区分，BaP-D12比BkF-D12响应值高很多，且出峰时间附近无其他干扰，综合分析，本文最终采用BaP-D12作为内标物质。内标法与外标法处理后的回收率见图4，从图中看出，加入内标校正后，15 种多环芳烃化合物回收率均不同程度上升，回收率在62.70%～109.81% 之间，能满足日常检测需求。

图3 多环芳烃内标溶液与外标溶液保留时间对比Fig.3 Comparison of retention time between internal and external standard mixed solutions of PAHs

图4 内标法与外标法处理样品后回收率比较Fig.4 Comparison of recoveries of samples pretreated by internal standard method and external standard method

2.3 净化条件的优化选择

目前对多环芳烃净化处理大多数采用固相萃取、QuEChERS 和超分子溶剂等方式，其中，超分子溶剂法对溶剂要求较高，适用性不强。对于富含脂质和色素的食品，用固相萃取方式净化效果较好[21-23]。本研究对比了4 种小柱（石墨碳化黑（Graphite Carbide Black，GCB）、分子印迹柱、QuEChERS和Florisil）对辣椒中多环芳烃的净化效果，如图5所示。

图5 4 种净化方式处理辣椒中多环芳烃回收率比较Fig.5 Comparison of recovery of 4th purification method effect on pepper

实验结果表明，GCB 小柱使目标物损失较大。GCB 带有芳香性的正六元环平面分子结构，能吸附平面环状目标物，而多环芳烃大多数种类都具有平面环状结构，如萘、菲、芘等，因此GCB 虽对吸附辣椒色素具有良好效果，但同时也造成目标物损失，这与陈玲等[24]的研究结果相似。Florisil、分子印迹柱以及QuEChERS 方法回收率相差不大，其中，分子印迹柱除色效果不佳，对辣椒基质中多环芳烃的吸附特异性表现不强，且上样时流动性差，净化效果不理想；QuEChERS 方法虽前处理简单，但对色素净化效果不明显，而Florisil 小柱不仅能吸附色素，除去部分极性物质，使样液保持透明澄清状态，同时回收率也能满足实验要求，Florisil、分子印迹柱以及QuEChERS 处理的样液见图6。综合考虑，本研究最终选择Florisil 小柱。

图6 分子印迹柱、QuEChERS 和Florisil 处理后的辣椒浓缩样品图Fig.6 Concentrated chilli samples after processed by monolithic molecular imprinted,QuEChERS and Florisil

2.4 方法学验证

配制质量浓度为0～100 ng/mL 的PAHs 系列标准溶液（含BaP-D1210 ng/mL），以标准物质的浓度（x）为横坐标，PAHs 峰面积与内标峰面积的比值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，结果显示15 种PAHs 呈良好线性，相关系数（r）在0.996 4～0.999 6 之间。分别向空白辣椒和花椒中添加一定浓度的标准溶液，以3 倍、10 倍信噪比确定方法检出限和定量限，辣椒中检出限：0.5～3.0 μg/kg；定量限2.0～10.0 μg/kg；花椒中检出限：0.5～1.0 μg/kg；定量限2.0～3.0 μg/kg，详见表3。

表3 15种PAHs方法学参数Table 3 Methodological parameters of 15th PAHs

分别向空白辣椒和花椒中添加2.0、10.0 和50.0 μg/kg 三个浓度水平的标准溶液，按照1.2 前处理步骤每个水平做6 个平行试验，结果见表4 和表5，得到辣椒粉中回收率范围为60.58%～119.48%，RSD 为1.25%～9.61%。花椒粉中回收率范围为60.46%～119.24%，RSD 为1.10%～8.56%。

表4 辣椒中多环芳烃回收率和RSDTable 4 Recovery and relative standard deviation of PAHs in Capsicum (n=6)

表5 花椒粉中多环芳烃回收率和RSDTable 5 Recovery and relative standard deviation of PAHs in Zanthoxylum (n=6)

以添加浓度水平、化合物以及品种为固定因子，回收率为因变量，进行了多因素方差分析,对不同数据间进行事后多重比较,以P＜0.05 作为差异显著的标准。结果显示，不同浓度水平以及化合物间回收率有显著差异（P＜0.05），而品种间差别不大（P=0.133）。

2.5 地产香辛料中多环芳烃污染水平

采用所建立的方法对我市种植基地的69 批次样品进行了测定（含辣椒30 批次，花椒39 批次），包括二荆条、石柱红、小米辣和青花椒、红花椒5 个品种，多环芳烃总量（∑PAHs）检出值从大到小依次为：青花椒（561.2 μg/kg）＞二荆条（448.8 μg/kg）＞红花椒（358.3 μg/kg）＞石柱红（353.6 μg/kg）＞小米辣（243.5 μg/kg）。不同品种中多环芳烃检出含量差别较大，其中，Nap、BghiP 和InP 检出率较低，仅在二荆条和青花椒中检出，石柱红和小米辣均未检出这三种物质；Ace、BkF、BaP、DahA 平均含量均低于10.0 μg/kg；Phe、Fle、Pyr 检出率较高，且都是各品种中检出值较高的化合物，Phe 的平均检出值最高，范围为170.8～243.6 μg/kg；Fle 的平均值范围为28.3～83.0 μg/kg；Pyr 的平均值范围为21.7～118.2 μg/kg，各种植区县中，璧山、江津、荣昌、黔江受多环芳烃污染较严重，∑PAHs 检出值在500 μg/kg 以上。详见图7 和图8。将样品检测结果进行方差分析，得出F=6.022，P＜0.05。其中，产地、品种和化合物均P＜0.05，说明不同产地、不同品种、不同化合物间均具有显著差异，产地与化合物之间交互作用不明显，详见表6。

图7 5 种香辛料中多环芳烃污染水平Fig.7 Contamination levels of 15 kinds of PAHs in 5 kinds of spices (μg/kg)

图8 不同种植区县香辛料中∑PAHs 检出值Fig.8 Distribution total content of 15 kinds of PAHs in different districts of Chongqing spices materials (μg/kg)

表6 样品方差分析Table 6 Variance analysis of samples

近年来，国内外对PAHs 在种植土壤、地下水、蔬菜等介质中的残留、分布及特征等进行了大量研究。如Agarwal 等[25]分析了印度德里各个农场表层土壤中16 种PAHs 范围在830～3 880 μg/kg 之间，并且市区浓度均高于农村；杨国义等[26]研究表明珠江三角洲典型区域农业土壤中16 种PAHs 的平均含量24 412 μg/kg 且以三环和四环的PAHs 为主；龙明华等[27]检测出南宁市不同区域5 种蔬菜的∑PAHs 含量范围在140.62～741.06 μg/kg；也有少量报道表明香辛料在加工过程中容易受到多环芳烃污染，如Rozentale 等[28]研究发现，经由干燥后的大部分干香料（黑胡椒、辣椒粉和肉豆蔻）和香草（小叶薄荷、罗勒和百里香）样品的PAH4 含量增加至1.0～25.8 μg/kg；Fasano 等[29]测得西班牙烟熏辣椒粉中的10 种PAHs，范围从5 332 μg/kg 到18 118 μg/kg，主要为是荧蒽和芘，与本研究结果相似。

3 结论

本研究采用氢氧化钠-乙腈作为提取液，经正己烷复溶后，采用弗罗里硅土固相萃取小柱富集除杂，用苯并[a]芘-D12对目标物进行定量，建立了香辛料中多环芳烃的高效液相色谱方法。与之前的研究方法相比，本文创新性的采用内标与液相结合的方式，提高了检测效率，适用于含香辛料基质的食品中PAHs 的检测。另外，本文对我市地产辣椒和花椒样品中多环芳烃含量水平进行了检测，发现我市不同种植基地以及不同香辛料品种均不同程度受到多环芳烃污染，下一步可对不同香辛料、不同种植区域、不同种植土壤等研究，以探究其影响因素、产生来源及暴露风险评估等。