大豆-坚果奶酪类似物的制备及其性质研究

陈斗艺，邱晓敏，林美云，郑倩望，叶志伟，郭丽琼，林俊芳，邹苑＊

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.汕头市华乐福食品有限公司，广东汕头 515825）

传统奶酪主要是以牛奶、羊奶等动物乳液为原料，通过添加发酵剂和凝乳酶使蛋白质絮凝聚集，析出部分乳清，继续发酵使其成熟的一种奶制品，其含有丰富的蛋白质、钙、脂肪、磷和维生素等成分，是一种营养丰富的天然乳制品[1]。由于我国面临奶源不足、奶酪制作成本高等问题，奶酪制品仍得不到普及。此外，大规模生产奶酪会导致温室气体排放增加、占用大量耕地面积、水资源等一系列环境问题[2,3]。随着人们对环境可持续发展、身体健康及动物保护意识的不断提高，越来越多的人开始关注奶酪类似物[4]。

奶酪类似物通常指的是由植物基原料制成的，具有与动物奶酪制品相似的外观、质地和口感[5]。目前，国内外有关奶酪类似物的研究还处于起步阶段，市面上的产品仍然存在各种问题，如口感粗糙、风味不佳、加工过度等。这也引起了食品科研工作者及企业的广泛关注。例如，Oyeyinka 等[6]采用40%的腰果乳替代豆乳生产奶酪类似物，干物质中的蛋白质含量达到63.99%，感官评分为7.0 分（满分为9.0）。Adejuyitan 等[7]发现，50%:50%的大豆乳和椰奶制备的奶酪类似物（7.3 分）比100%大豆奶酪有更高的感官评分（5.7 分），可能是椰奶掩盖了大豆的豆腥味。由此可知，豆类、谷物和坚果类可作为奶酪类似物的主要原料，并通过复配植物乳进一步改善奶酪类似物品质。然而，目前的研究主要是制备植物基奶酪类似物，很少系统研究奶酪类似物的质构、感官特性、消化特性、储藏特性等。

大豆乳在我国素有“绿色奶牛”之称，并且大豆乳是目前消费最广泛，接受度最高的植物乳，含有大量的多不饱和脂肪酸，不含胆固醇，是高质量蛋白质的良好来源[8]。但是，豆类物质的不良风味限制了其在奶酪类似物中的广泛应用。因此，有必要挖掘其他植物乳与大豆乳复配，以期在一定程度上降低或掩盖豆类物质的不良风味。其中，坚果类植物乳营养丰富，且具有坚果类特殊香味，如腰果富含脂肪、纤维、矿物质、蛋白质、单宁和维生素C[9]；巴旦木富含蛋白质，并含有少量胡萝卜素、维生素B1、B2 和消化酶[10]。基于此，本研究选用腰果乳和大豆乳复配再加入巴旦木蛋白制备具有高蛋白兼具优良风味的大豆-坚果奶酪类似物；为了更好地迎合不同年龄段消费者的喜好，将样品制备成携带食用方便的奶酪棒形式；以感官评分为主要评价指标，并通过单因素试验结合响应面优化确定最佳工艺配方；进一步对大豆-坚果奶酪类似物的理化性质、感官特性、储藏稳定性和消化特性进行系统研究。

1 材料与方法

1.1 原料及试剂

烘焙腰果、大豆、椰子油、葵花籽油、谷氨酰胺转氨酶（TG 酶）、蔗糖购于淘宝；黄原胶、卡拉胶、刺槐豆胶、巴旦木蛋白由大昌华嘉化学国际贸易（上海）有限公司提供；商品化植物基奶酪1、2 分别购于Daiyafood、Violife；商品化动物奶酪1、2 分别购于淘吉奶酪棒、夏洛克奶酪棒；胰蛋白酶（酶活250 U/mg）、胃蛋白酶（酶活3 000 U/g）、胰脂肪酶（酶活30 000 U/mg）均购于上海源叶生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS），德国生物弗罗克斯；考马斯亮蓝R-250，上海源叶生物科技有限公司。使用的所有其他化学品都是分析级的。

1.2 主要仪器设备

主要仪器设备如表1 所示。

1.3 实验方法

1.3.1 大豆-坚果奶酪类似物的制备

大豆-坚果奶酪类似物的制备工艺流程如下：

大豆、腰果打浆→大豆乳腰果乳混合→加入椰子油、葵花籽油、巴旦木蛋白→均质（1 500 r/min、10 min）→加入柠檬酸、乳酸酸化（45 ℃、2 h）→加入TG 酶交联（45 ℃、2 h）→过滤乳清→凝乳→胶体蔗糖复合溶液加入凝乳→搅拌→奶酪浆液→装模→冷却成型

以感官评分作为大豆-坚果奶酪类似物品质的主要评价指标，探究油脂种类和含量、酸化剂、蛋白质含量、胶体、TG 酶含量对其品质的影响，确定响应面优化最佳因素水平；进一步利用响应面的中心组合试验优化大豆-坚果奶酪类似物的最佳工艺配方。

1.3.2 感官评价

参照奶酪的食品安全国家标准GB 5420-2021 招募十名人员，五名男性，五名女性，年龄18～30 岁，培训后对样品进行感官评价。感官评分标准见表2，计算十名感官评分员的平均分即为样品的最终得分。

表2 大豆-坚果奶酪类似物的感官评分标准Table 2 Sensory scoring criteria of soybean-nut cheese analogues

1.3.3 化学组分测定

对大豆-坚果奶酪类似物的粗脂肪（GB 5009.6-2016）、蛋白质（杜马斯燃烧定氮法，蛋白质系数为6.25）、灰分（GB 5009.4-2016）、水分（GB 5009.3-2016）进行测定，差值法计算总碳水化合物[11]。

1.3.4 质构测定

将大豆-坚果奶酪类似物和商品化奶酪切块成3 mm×3 mm×3 mm 的正方体，采用TPA 模式对样品进行两次压缩。选用P/2 圆柱形探头（直径为5 mm），探头在测试前、测试中和测试后的速率分别为2、1、2 mm/s，触发力为0.20 N，将压缩应变设为60%。

1.3.5 体外消化

根据Minekus 等[12]的方法建立体外模拟静态消化模型，并略作改动，消化液组成用NaCl 代替NaHCO3[13]。将大豆-坚果奶酪类似物口腔咀嚼2 min 左右，直至适合吞咽的颗粒大小，取样品。将样品和唾液（SSF）1:1 混合，在pH 值7.0，37 ℃条件下消化2 min[14]。将口腔食糜与胃液（SGF）1:1混合，加入胃蛋白酶使其活性达到2 000 U/mL，调pH 值至3.0，在37 ℃消化2 h[15]。将上述胃消化后的食糜与肠液（SIF）1:1 混合，加入胆汁盐溶液（最终浓度为10 mmol/L）、胰蛋白酶（活性100 U/mL）和胰脂肪酶（活性2 000 U/mL），调pH 值至7.0，消化2 h 后在100 ℃水浴5 min 将酶灭活，终止反应。分别在胃消化0、30、60、120 min，肠消化135、150、180、240 min 取样进行SDS-PAGE，分析蛋白质消化情况。

1.3.5.1 SDS-PAGE

将消化液样品离心取沉淀物并进行真空干燥，对干燥样品进行SDS-PAGE 分析。将样品稀释液（质量分数为1%的蛋白溶液）与上样缓冲液（体积分数为10%的甘油，质量分数为10%的SDS，1.0 mol/L pH 值6.8 的Tris-HCl 缓冲液，体积分数为1%的β-巯基乙醇，质量分数为0.1%的溴酚蓝）混合，沸水浴5 min。制备体积分数为12%的分离胶和5%的浓缩胶，胶板厚度为1 mm，上样量为15 μL，于恒压下进行电泳。凝胶电泳后，用考马斯亮蓝（R-250）溶液染色1 h，然后在乙醇乙酸脱色液中脱色，直到观察到清晰的背景。使用分子成像仪Gel DocXR 系统（Bio-Rad）扫描SDS-PAGE 凝胶并用Image J 软件对谱带强度进行分析[16]。

1.3.5.2 游离脂肪酸的测定

肠消化阶段，使用自动滴定仪通过pH-Endpoint方法监测H+的产生，测定游离脂肪酸（FFA）释放速度。采用0.1 mol/L 的NaOH 自动滴定，保持消化过程中pH 值为7.0，记录全程NaOH 的体积消耗曲线，参考Hu 等[17]的方法计算游离脂肪酸的含量。

1.4 数据处理与统计分析

所有试验重复3 次，结果为平均值±标准误差，使用Origin 2018 作图；采用SPSS 26 统计软件对数据进行差异显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 大豆-坚果奶酪类似物的制备

以感官评分为参考指标，研究油脂含量、不同油的比例、酸化剂含量、TG 酶含量、胶体含量及蛋白质含量对大豆-坚果奶酪类似物品质的影响（皆为质量分数），结果如图1 所示。当植物油3.60%、蛋白质1.80%、TG 酶0.40%，酸化剂0.20%（其中柠檬酸0.10%，乳酸0.10%）以及亲水胶体1.10%（其中卡拉胶0.60%，黄原胶0.20%，刺槐豆胶0.30%）时，大豆-坚果奶酪类似物的感官评分最高，分别为81.70、85.65、80.20、82.00、85.20 分。依据此结论，进一步以大豆-坚果奶酪类似物感官评分作为响应值，采用对其感官评分有显著影响的油含量、蛋白含量、TG 酶含量和胶体含量为4 因素，进行4 因素3 水平的响应面分析实验，试验因素水平见表3。运用响应面软件共设计29 组试验，结果如表4 所示。验证这四个因素彼此之间的交互作用，从而得出最优配方组合为油脂3.09%，蛋白2.01%，TG 酶0.33%，胶体1.08%（其中卡拉胶0.60%，黄原胶0.20%，刺槐豆胶0.28%）。后续对该最佳配方制备的大豆-坚果奶酪类似物的理化、质构、感官及消化特性进行系统性研究。

图1 油脂含量（a）、不同油比例（b）、酸化剂含量（c）、TG酶含量（d）、胶体含量（e）及蛋白质含量（f）对大豆-坚果奶酪类似物感官评价的影响Fig.1 The effects of oil content (a),proportion of different oils (b),acidifier content (c),TG enzyme content (d),colloid content (e),protein content (f) on sensory evaluation scores of soybean-nut cheese analogues

表3 响应面优化实验的因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface optimized experiments

表4 响应面分析方案及结果Table 4 Response surface analysis and results

2.2 大豆-坚果奶酪类似物的化学组成

大豆-坚果奶酪类似物与商品化动物/植物基奶酪化学组成如表5 所示。可知大豆-坚果奶酪类似物的蛋白质含量远高于商品化植物基奶酪制品，甚至是优于商品化动物奶酪制品；碳水化合物含量显著低于商品化植物基和动物基奶酪；脂肪含量也相对较低。另外，大豆-坚果奶酪类似物蛋白质含量显著高于张琦[18]报告的大豆奶酪（7.10%～13.60%），脂肪含量低于Vs 等[19]报告的豆乳-椰奶制作的奶酪类似物（25.61%～27.10%）与Ali 等[20]的牛奶-豆乳奶酪（43.51%～47.33%）。这些结果表明本研究所制备的大豆-坚果奶酪类似物具有高蛋白、低碳水化合物、低脂肪的特点，这也正是符合当代消费者对健康食品的理念。

表5 大豆-坚果奶酪类似物与商品化动物/植物基奶酪制品的化学组成表Table 5 Chemical compositions of soybean-nut cheese analogues and commercial animal/plant-based cheese products

2.3 大豆-坚果奶酪类似物的质构

奶酪的质构与奶酪的组成和结构密切相关，是评价奶酪品质的一项重要指标。图2 是大豆-坚果奶酪类似物和商品化动物和植物基奶酪制品的硬度值比较。结果发现，大豆-坚果奶酪类似物的硬度为0.88 N，与商品化植物基奶酪1（0.98 N）和动物奶酪2 硬度值（0.94 N）没有显著性差异，但明显低于商品化动物奶酪1（1.41 N）和植物奶酪2 的硬度值（2.18 N）。可能原因是大豆-坚果奶酪类似物含有较低的脂肪和碳水化合物含量，形成的凝胶网络结构要弱于其它商品化奶酪产品。这与前人研究结果一致，Rogers 等[21]提到在奶酪中脂肪小球占据蛋白质基质的空间，在奶酪中随着脂肪含量的增加，脂肪颗粒会破坏蛋白质的网络结构，从而导致硬度值下降。此外，有文献提到在凝乳中加入多糖，凝胶机械强度会随碳水化合物（多糖）浓度的增加而增加，侯俊杰[22]采用大豆球蛋白（SG）-甜菜果胶（SBP）制备凝胶，随着SBP 含量的增加，凝胶的破裂应力从11.13 N 增加到31.39 N。

图2 大豆-坚果奶酪类似物与商品化动物/植物基奶酪制品的质构Fig.2 Texture properties of soybean-nut cheese analogues and commercial animal/plant-based cheese products

2.4 大豆-坚果奶酪类似物的感官评价

对大豆-坚果奶酪类似物进行感官评价，并与商品化动物/植物基奶酪进行比较，结果见图3。从图3a 可知大豆-坚果奶酪类似物的外观与商品化动物奶酪两者皆表皮均匀、无损伤，色泽呈乳白色、有光泽，商品化植物基奶酪表皮无光泽、粗糙，存在裂缝。从图3b 可知商品化动物奶酪整体感官评分8.00 分、口感气味8.50 分，大豆-坚果奶酪类似物在色泽、外形和组织状态可与商品化动物奶酪相媲美但整体感官为7.71 分不及动物奶酪，因为在口感及气味（7.98 分）上不够理想，仍存在少量的豆类风味，乳脂感较差。植物基奶酪1、2 的色泽（5.65 分、5.27 分）、外形（5.98 分、5.24 分）评分最低，与图3a 相对应。其质地粗糙呈颗粒状，因为大量使用碳水化合物来取代脂肪使产品具有颗粒状质地[23]，同时存在一种令人不愉快的味道，这可能与调味剂用量过多有关[24]，因此感官评分最低（6.31分、5.18 分）。总的来说，大豆-坚果奶酪类似物比商品化植物基奶酪接受度更高，但对比动物奶酪其口感、风味略有不足。

图3 大豆-坚果奶酪类似物与商品化动物/植物基奶酪制品的外观（a）和感官评价雷达图（b）Fig.3 The appearance (a) and sensory evaluation radar map(b) of soybean-nut cheese analogues and commercial animal/plant-based cheese products

2.5 大豆-坚果奶酪类似物的储藏稳定性

本研究还考察了大豆-坚果奶酪类似物在4 ℃贮藏条件下的外观和硬度变化，结果如图4 所示。样品随着储藏时间的增加光泽度略微降低，出现轻微析水的现象，硬度值缓慢增加，贮存20 d 其硬度从0.94 N 增加到1.15 N。这个结果可能与储藏过程中水分的析出和脂肪氧化有关，增强了体系内蛋白质、脂肪和碳水化合物之间的相互作用。Ramos等[25]发现了类似的结果，未涂层奶酪在储藏20 d 后硬度值从0.25 N 增加到2.00 N。

图4 大豆-坚果奶酪类似物在4 ℃贮藏条件下的外观和硬度变化Fig.4 The appearance and hardness of soybean-nut cheese analogues during storage at 4 ℃

2.6 大豆-坚果奶酪类似物的消化特性

样品在消化过程中的外观变化图如图5 所示，图5a 可观察到在胃消化初始阶段，消化液有明显的大颗粒，到120 min 胃消化结束，在胃液、胃蛋白酶作用下，消化液固体内容物明显减少；随着肠道消化的进行，肉眼可见消化液浑浊，肠道消化结束时大颗粒不存在。

图5 大豆-坚果奶酪类似物在静态消化过程中的消化产物（a）、SDS-PAGE图谱（b）、条带灰度值（条带对应于SDS-PAGE结果，c）Fig.5 The photos of digestive product (a),SDS-PAGE profile(b),band intensity (c) of soybean-nut cheese analogues during digestion in vitro

图5b 是样品消化内容物的SDS-PAGE 图谱。消化内容物具有五条清晰条带（a、b、c、d、e），其中a 条带主要是小分子蛋白和多肽，bc 条带主要包括11S 球蛋白碱性亚基B（20～25 ku）和2S 白蛋白（18～22 ku），d 条带主要是11S 球蛋白酸性亚基A（30～37 ku），e 条带是7S 球蛋白，由α亚基（72 ku）、α′亚基（85 ku）和β亚基（53 ku）三种亚基组成。大豆蛋白中11S 和7S 的含量最高，达到了总蛋白含量的70%～75%[26]，腰果蛋白中包括7S 球蛋白[27]，但e 条带在SDS-PAGE 图谱上不清晰，主要是因为对大豆和腰果进行热处理会使7S 蛋白完全变性[28,29]，同时在凝乳过程中TG 酶使7S 蛋白交联形成更大分子量的蛋白，可以观察到样品槽中存在少量大分子聚集体无法进入浓缩胶[30]，造成7S条带变浅。

在胃消化阶段，所有条带从30～60 min 颜色逐渐加深，这可能是蛋白质先从基质中释放出来导致的，之后随着消化的进行，b、c、d、e 的蛋白条带明显变浅，同时a 条带颜色加深，说明随着消化时间延长蛋白质逐渐被水解成6～15 ku 的多肽和小分子蛋白，在肠道消化180 min 后所有条带消失，说明蛋白被水解成更小的短肽或氨基酸。进一步分析条带灰度值，灰度值越大蛋白质含量越高。如图5c 所示所有条带在胃消化30～60 min 灰度值增加，之后随着消化时间的增加，b、c、d、e 条带的灰度值急剧降低，条带a 灰度增加，在180 min 时灰度值趋近0，与图5b 结果一致。这与传统奶酪中酪蛋白水解动力学一致，在胃消化120 min 时，凝胶上看不到完整的酪蛋白，但仍可见约4～6 ku 的大片段酪蛋白和多肽，在肠道消化180 min 后，酪蛋白已经完全消失[31]。

脂肪主要在小肠被水解为甘油、脂肪酸等，通过记录NaOH 的体积消耗曲线，能够计算出产生的游离脂肪酸含量，从而分析样品脂肪消化速率。图6 显示了肠消化过程中游离脂肪酸的释放行为。大豆-坚果奶酪类似物在消化初期FFA 释放速率缓慢，1 h 后释放速率快速增长，在肠消化结束时，FFA 释放速率为60%，说明脂肪没有被完全消化。Lamothe 等[32]比较不同动物干酪在胃肠道环境中脂肪酸释放的动力学，了解到不同动物干酪的脂肪酸释放率平均为80%。由此说明，大豆-坚果奶酪类似物脂肪具有一定抗消化能力且相较于动物奶酪具有更低的脂肪消化率。

图6 大豆-坚果奶酪类似物消化中游离脂肪酸的释放行为Fig.6 Release of FFA from soybean-nut cheese analogues during digestion

3 结论

在大豆乳50.00%和腰果乳50.00%混合的基础上，以植物乳质量为基准，依次添加3.09%植物油（椰子油与葵花籽油比例为7:3）、2.01%巴旦木蛋白、0.33% TG 酶、0.10%柠檬酸、0.10%乳酸；以凝乳质量为基准添加1.08%胶体，4.00%蔗糖，可制备出最佳品质的大豆-坚果奶酪类似物（以上皆为质量分数）。该大豆-坚果奶酪类似物含有蛋白质20.05%，脂肪13.83%，水分62.53%，灰分0.43%，碳水化合物3.16%，具有高蛋白、低脂肪、低碳水化合物的优点，符合现代消费者对健康食品的追求。大豆-坚果奶酪类似物的硬度为0.88 N，整体感官评分为7.71 分，质构特性和感官特性与商品化动物奶酪相似，但口感和气味略逊色。随着储藏时间的延长，大豆-坚果奶酪类似物硬度从0.94 N 上升到1.15 N，有轻微上升，主要是由于有少量水从奶酪凝胶中析出。体外静态消化结果发现蛋白电泳条带在消化180 min 时消失，说明其蛋白质易于被消化，FFA释放速率为60%，脂肪未被完全消化。综上所述，大豆-坚果奶酪类似物可以作为动物奶酪的替代品。