基于粪便分析的大型食肉动物食性研究方法概述

赵筱涛, 刘文静, 窦海龙

(①曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市;②东北林业大学野生动物与自然保护地学院,150040,黑龙江省哈尔滨市)

0 引 言

陆生食肉动物一般是指食肉目哺乳动物(Carnivora),目前全球记录有13科250种[1]. 根据体重的大小,陆生食肉动物可分为大型陆生食肉动物(≥15 kg,以下简称大型食肉动物)和小型陆生食肉动物(<15 kg),其中大型食肉动物仅有31种[1,2]. 虽然大型食肉动物种类较少,但在生态系统中扮演极为重要的角色,其在生态系统中自上而下的控制作用(Top-down control)是生态系统结构和功能稳定的前提. 由于营养级联效应,大型食肉动物种群的波动,能直接影响到它们猎物以及同域分布中小型食肉动物种群,继而波及至鸟类、无脊椎动物等其他动物群体,乃至影响植物的丰富度和多样性,产生连锁反应.

在世界范围内,近几十年来由于人类活动的影响,大型食肉动物栖息地的丧失和破碎化严重,其地理分布范围及种群数量均较之前呈现大幅度缩减,生存面临巨大威胁[2]. 由于食物缺乏和栖息地丧失,大型食肉动物直接攻击人类或牲畜,从而导致人兽冲突. 而决定大型食肉动物种群分布和数量的关键因素是猎物,通过对大型食肉动物的食性进行研究,了解捕食行为模式、评估环境承载力、确定影响其生存的关键因素,才能为解决人兽冲突,科学保护管理其种群提供依据.

大型食肉食性研究方法非常多,包括觅食行为观察法、食痕分析法、胃内容物分析法、笼养实验法、同位素标记法、粪便分析法等[3],其中粪便分析法是目前大型食肉动物食性研究最常用的方法. 该方法可操作性强、准确度较高,加之是一种间接食性调查法,特别适合于种群数量稀少、行踪隐秘的大型濒危食肉动物的食性研究[4].

食肉动物作为一个物种数量庞大的动物类群,基于粪便样品的分析方法也同样多种多样[5]. 有研究证实对同样的物种使用不同的数据分析方法会导致结果出现差异,甚至是互相矛盾的结果[6],因此针对目标物种选取合适的研究方法是食肉动物食性研究能否成功的关键. 大型食肉动物大都是专性肉食动物、食物来源比较单一,相对于其他食肉动物来说,其食性分析方法具有统一性及相似性的特点. 基于此,本文在大量查阅国内外100余篇相关文献的基础上,从样品采集处理、数据分析及方法介绍等方面对粪便分析法在大型食肉动物食性研究中的应用进行了系统总结,并进行了研究前景的展望.

1 粪便分析法简介

1.1 传统粪便分析法

传统粪便分析法即粪便内容物鉴定法,指根据粪便残留物(如牙齿、毛发、骨骼、角、指甲等)形态确定动物食性的方法[7]. 野外采集到粪便后首先需要确定样品来源,早期的研究一般根据周围的活动痕迹(足迹、毛发或者抓痕等)确定来源[6].

粪便来源确定后,紧接着对内容物进行分离、鉴定[8]. 内容物中的牙齿、骨骼等可以直接与参考猎物标本进行比对鉴定[9];粪便内容物中的毛发,可通过外形、长度、颜色和细度进行比对鉴定[10]. 对于宏观表型差异比较小的毛发样品,可利用动物被毛显微形态观测技术进行鉴定,鉴定依据是动物被毛的鳞片排列、髓质结构以及色素颗粒的分布等[11].

1.2 粪便DNA分析法

粪便DNA分析法是通过提取粪便总DNA,然后利用分子生物学及生物信息学手段对粪便中猎物进行鉴定的方法[12]. 作为一种新兴的动物食性研究方法,其具有明显优势:(1)有效规避了研究者的主观判断和形态学经验对结果的影响;(2)可识别形态学难以区分的近缘种及隐存种;(3)不受食物类型(如肌肉、内脏等)的影响;(4)较高的灵敏度,能够检测到粪便内残留的微量DNA;(5)通量高,大量样品也可以混样并同步检测,节省了分析时间和成本[3].

根据技术特点,粪便DNA分析法主要分为克隆法(Clone based technique)、宏条形码法(DNA metabarcoding)和宏基因组法(Metagenomics)3种[13]. 克隆法是使用一代Sanger测序技术对动物食性进行鉴定的方法[12]. 克隆法操作繁琐,工作量大,且影响食性分析结果的因素较多(转化效率、挑取阳性克隆量等)[14],在动物食性研究中应用较少. 第2种鉴定方法是宏条形码法,该方法将PCR产物交由高通量测序平台测序分析,进而获得食物组成结果[15]. 宏条形码法实验操作简捷、工作量小、鉴定准确率高,是目前分子食性研究最常用的方法[16]. 第3种方法是宏基因组法,虽然该方法省略了PCR扩增步骤,但是其具有准确度较高、可进行定量分析等优点. 同时,宏基因组法也具有测序花费较高、序列拼接组装难度较大等缺点,目前该方法在动物食性研究中的应用还处于起步阶段.

2 食性分析常用的方法及应用

2.1 样品数量

粪便样品量是影响大型食肉动物食性鉴定准确性的重要因素[17]. 研究中常使用观测曲线法(Observation area curve)评估样品数量是否能覆盖食谱中全部猎物种类,该方法通过随机分配结果的顺序,从所有样品中抽取一定量的样品绘制主要猎物出现频率曲线,根据曲线稳定性确定样品数[18]. Mondal等人使用该方法评估样品数量要求,发现豹至少需要70份粪便,老虎需要至少80份粪便才能准确反映其食物种类组成[19].

2.2 食性组成

猎物种类鉴定完成后紧接着要对粪便中样品组成进行量化,即对粪便中猎物出现比例进行标定,标定方法有两种:组成法和频率法. 组成法是在假设捕食者对所有猎物的消化率相同情况下,通过肉眼估计或测量猎物残留物的体积占比或质量占比,进而推算猎物在捕食者食物中的占比的方法[7]. 频率法是一种基于猎物存在/缺席的定性数据分析法[20],一般用出现频率和相对出现频率表示[21]. 出现频率计算方法是将含有某种猎物的粪便数量除以全部粪便数量,侧重表示猎物在食物中的常见程度;而相对出现频率计算方法是将某种猎物在粪便中出现的次数除以所有猎物出现的次数,侧重表示猎物在食性中的重要性[22]. Klare等人在系统总结了50篇食肉动物食性研究文献后,发现约94%的研究使用了频率法,侧面反映了频率法是目前最基本、最常用的食物组成分析方法[20].

粪便中的猎物组成在一定程度上可以反映出环境中捕食者与猎物的遭遇率[23]. 自然条件下,捕食者会改变其行为模式提高与猎物的遭遇率[24]. 因此,通过食性组成分析可帮助我们理解捕食者与猎物之间相互制约的共存模式. Dou等人对东北虎冬季食性调查发现野猪和梅花鹿是其主要猎物资源,基于红外相机的时空重叠分析显示东北虎与野猪时间重叠度高、与梅花鹿空间重叠度高,推测这种时空分布模式是东北虎捕食策略的一种体现[25].

2.3 猎物生物量

在使用频率法对食肉动物进行食性研究时,可能会造成大型猎物在食物中的相对重要性被低估,小型猎物被高估,所以单纯利用频率法不能很好地体现每种猎物对食肉动物食性的相对重要性[7]. 为了准确量化粪便数量与猎物体重(生物量)之间的关系,Ackerman等人通过饲喂实验获得了美洲狮修正系数(Correction factor)方程(X表示某种猎物的平均体重,Y表示一个粪便消耗的对应猎物生物量)[21],

Y=1.98+0.035X.

由于不同的食肉动物在生理结构、食物组成、觅食行为、消化能力及排便模式等方面存在潜在的差异,因此其修正系数方程也各不相同[20]. 通过比较发现,这些修正系数方程绝大多数是线性方程[9]. 然而在真实野外环境下,考虑到捕食者胃容量、消化率、猎物选择等因素,修正系数方程更可能是渐进的[9]. 另外,某些食肉动物类群由于没有修正系数方程,计算生物量消耗时只能使用近缘物种的修正系数方程代替[10,15,26],显然这种简单的替代是不科学的. 基于此,Chakrabarti在综合考虑各种影响因素条件下,设计实验模拟真实野外环境,通过饲喂体型不同的4种猫科动物(亚洲狮、印度豹、丛林猫和家猫)固定猎物,探究粪便数量与捕食者及猎物体重之间的关系,最终获得一个适用于专性食肉类猫科动物食性研究的广义非线性生物量方程(相较于公式(1),增加了捕食者体重参数Z)[9],

Y/Z=0.033-0.025eX/Z.

使用该方程时,当猎物体重超过一定范围时,捕食者的捕食收益会随着猎物体重的增加而趋向稳定,符合最适觅食理论[27],因此能对动物的食性及捕食行为进行合理的解释.

为了消除频率法造成的猎物对于食性相对重要性的错误估计,引入了相对生物量的概念D(Relative proportion of biomass consumed),表示某种猎物在捕食者食物中所占的生物量比例[28],其计算方程为

其中,Yi表示第i种猎物的修正系数,Ai表示第i种猎物在粪便中的相对出现频率. 相对生物量能够较好的表征不同猎物对捕食者的重要性,因此在大型食肉动物食性研究中得到广泛的使用[25]. 另外,基于相对生物量的概念还衍生出相对贡献数量E(Relative number of a prey species consumed)[26],其方程式为

式中,Di表示第i种猎物相对生物量贡献率,Xi表示第i种猎物的体重. 通过该方程可直观的显示捕食者食物中猎物数量构成情况,基于此可对捕食者调控猎物种群数量的作用方式进行合理推测.

环境中猎物生物量是决定食肉动物密度的关键因素[29]. 开展基于食性研究的生物量和猎物资源调查,测算环境容纳量,评估濒危食肉动物的生存需求,可以预估其存活能力,推算种群的发展趋势,进而为濒危动物的保护和管理提供依据[2].

2.4 生态位宽幅

食性研究中的生态位是指从营养位角度衡量动物在生态系统中的位置. 这里的生态位宽幅通常指动物食谱的丰富度,可用作捕食者利用环境资源强度的指标. 为了更直观地比较物种间的生态位宽幅,通常使用标准Levins指数方程[30]

BS=(B-1)/(n-1),

式中,n表示总猎物种数,BS的取值范围0～1.BS值越接近1表明捕食者利用环境中猎物资源种类越丰富. Steinmetz等人在对泰国虎、豹和豺的食性分析发现,在猎物资源贫瘠的生境中,各物种的生态位宽幅均大于猎物资源丰富的生境[8].

2.5 竞争物种食性重叠指数

受制于有限的环境资源,同域分布的竞争者在长期进化过程中,逐渐形成了不同的觅食策略,表现在空间、时间和营养生态位的分化,以满足生存需求. 食物是物种竞争的关键资源,所以食性研究是探明竞争者共存机制的前提[26].

食性重叠指数能够量化竞争导致的分化,进而对食肉动物觅食行为、竞争者共存机制进行合理解读. 食性重叠指数P通常使用Pianka生态重叠指数[31]表示,

其中,pij表示猎物i在捕食者j食物中的出现频率,pik表示猎物i在捕食者k食物种的出现频率.P值取值范围为0～1,当P值越趋近于1表明两者食性重叠度越高. Andheria等人调查发现虽然印度班迪普尔保护区的老虎、豹和豺捕食的猎物重叠指数较高(Pinka指数0.75～0.93)[26],但这些重叠度较高的猎物种类并不是其各自捕食者的主要食物来源. 由于大型食肉动物存在选择性捕食的行为,单纯基于粪便出现频率计算获得的重叠指数只能从一定程度上说明同域捕食者选择食物种类的相似程度[26]. 要想真正理解同域竞争者的共存机制,需要在食性研究的基础上,结合行为观测、猎物资源调查等研究才能实现[32].

3 总结及展望

由于一份粪便中可能含有多种食物成分,基于形态学鉴定可能出现假阳性(将其它猎物误认成目标猎物)和假阴性(将目标猎物误认成其他猎物或遗漏目标猎物),进而造成误判和误差[33]. 为减少误判,可以设置盲检或多名人员共同判读[25];为减少遗漏,需保证足够的粪便内容物抽检量. 大型食肉动物食性研究目前还未建立统一抽检量标准[1],实践中多采用每份粪便随机检验不少于20份内容物,以尽可能覆盖猎物组成[6]. 相对于传统形态学鉴定,粪便DNA鉴定误判率较低,但同样面临遗漏目标猎物的问题. 为减少漏检,使用克隆法调查动物食性时,每个样品需挑取5～20个阳性克隆进行测序[14];宏条形码法通过设定检测阈值来减少漏检,即只有序列数高于50或不低于总序列数的1%的猎物序列才能被保留分析[4]. Mcinnes等人认为增加样品数量是提高食性鉴定准确律的最有效方法,特别当食物中含有稀有猎物成分时[34].

粪便DNA技术在种群数量、遗传结构、肠道菌群甚至是病原体检测等领域应用广泛,解决了相关领域的众多问题[35]. 而在动物食性领域该技术还存在一些局限,主要体现在影响结果准确性的不确定因素较多(粪便DNA质量、PCR跳跃产生的扩增错误和嵌合序列、猎物细胞在粪便分布的不均匀性等)[34]. 宏条形码技术目前主要采用一种半定量分析方法,通过计算相对序列丰富度(Relative read abundance,RRA)来表征猎物相对生物量[4,36]. 由于序列比与猎物真实占比存在较大的差异,绝大多数情况下使用RRA会导致严重的误判,但在种群水平上的食性调查或猎物种类单一的食性评估中准确性较好[37]. 另外,在分子方法鉴定食性时,一定要考虑宿主及人类DNA的影响. 通常情况下,粪便中宿主DNA的量远大于猎物,由于PCR放大效应,会导致扩增终产物中宿主DNA占比偏高,而猎物DNA占比偏少或丢失,进而影响食性判读的准确性[38]. 为解决这个问题,需要在PCR反应体系中加入宿主DNA扩增片段的阻抑引物(Blocking primer)[39]. 而人类DNA的影响主要是样品污染导致阳性扩增的出现[36],因此在实验中应增加阴性及阳性对照,提高鉴定的准确性.

大型食肉动物的捕食行为是生态系统营养流动和物质循环的调节器,调节着众多的生态和进化过程[37]. 想要完整解释这种行为的调解机制,不能局限于有限的食性调查方法,要根据目标物种特点,综合利用各种方法,以求得到最真实最精确的数据. 例如,计算相对生物量时需要食物中猎物的体重数据,目前绝大多数研究使用成年猎物平均体重表示,而捕食者存在选择性捕食行为(性别、体型及年龄等),这就造成数据偏差[9]. 为解决这一问题,可借助无线电追踪、红外相机监测等技术了解其捕食行为特点,结合环境调查方法获得猎物种群大小、结构等数据,最终确定其猎物的平均体重数据[8]. 此外,目前基于食性分析的大型食肉动物区域共存及生态位重叠研究大都定位于营养位单一尺度,缺乏多维度的物种关系研究,进而造成信息的丢失以及结果的片面性[38]. 出现这种情况的主要原因是数据采集与分析方法单一,不同生态位间统计方法创新性及稳健性不足[39],监测体系间缺乏连通性.

综上,未来大型食肉动物食性研究想要有更好的发展,应该在以下几个方面寻求突破.

(1)开发新研究技术及方法. 在野生动物数据(个体识别、动物体重、生理指数、移动速度及三维立体结构等)和环境资源数据(植被组成、气候、温度及湿度等)收集方面重点突破,研发大数据互联平台,加强信息整合能力.

(2)扩大食性研究的尺度和维度. 目前食性研究大多局限于有限的物种,或定位于单一空间、时间尺度. 在不同的尺度及维度上,物种之间相互作用的类型和方向是不同的. 扩大研究尺度维度,有助于更好地理解食肉动物共存、生态系统形成及维持机制.

(3)优化宏条形码定量分析方法. 开发简化、高效、准确的序列拼接组装算法,降低宏基因组法的应用成本.

(4)建立大型食肉动物食性检测统一标准,使研究规范化、系统化、体系化.