两色金鸡菊降血脂活性部位筛选研究

★ 颜仁梁 李田 卓友铭（广东食品药品职业学院 广州 510520）

两色金鸡菊来源于菊科金鸡菊属两色金鸡菊Coreopsis tinctoriaNutt.的干燥头状花序，在新疆南疆地区海拔3 000 m 左右的昆仑山区有大量种植，是常用的维吾尔族民族药，始载于《新华本草纲要》。其味甘，性平，归大肠经。现代药理学实验证明，两色金鸡菊在降血糖、降血脂和降血压方面具有多样而显著的生物活性［1-3］，体现在清热解毒、活血化瘀、和胃健脾、降血脂、软化血管等方面［4-5］，对冠心病、高血脂、糖尿病等有特殊疗效。为了明确两色金鸡菊的降血脂活性成分，本文以降血脂活性为导向，选定药材活性部位，为后期成分分离及新药开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

1.1.1 药品 两色金鸡菊样品采自新疆和田地区，由广东食品药品职业学院梁永枢副研究员鉴定为两色金鸡菊Coreopsis tinctoriaNutt.的干燥头状花序，药材标本（编号20200701）存放于广东食品药品职业学院中药学院标本室。

1.1.2 试剂与仪器 电加热提取锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；HH-S 数显恒温水浴锅（常州中捷实验仪器制造有限公司）；Z0002 电子天平（上海衡平仪器仪表厂）；大孔吸附树脂806021（沧州树脂厂）；Anke TGL80-16B 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；日立7020 全自动生化分析仪（日本日立公司）；总胆固醇（TC）测定试剂盒（日本和光纯药工业株式会社，批号AH831）；低密度脂蛋白（LDL-C）测定试剂盒（日本和光纯药工业株式会社，批号KP748）；胆固醇（瑞士罗氏公司，批号163010-01）；胆酸钠（美国sigma 公司，批号127K0122）；丙基硫氧嘧啶片（精华制药集团股份有限公司，批号100703）；辛伐他丁（默沙东中国有限公司，批号110077）；乙醇（化学纯，上海市振兴化工一厂）。

1.2 实验动物

健康雄性ICR 小鼠，体重（20±2）g，广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（粤）2013-0002，实验动物质量合格证号NO44007200014522。动物饲养于广东省中医药工程技术研究院SPF 级动物实验室，设施使用许可证号为SYXK（粤）2010-0059，自由进食。动物实验得到广东省中医药工程技术研究院动物委员会批准，所有操作均严格遵循实验动物管理的相关规定。

1.3 研究方法

1.3.1 高血脂动物模型的建立

1.3.1.1 乳剂配制 猪油80 g，胆固醇40 g 加热融化，加入胆酸钠8 g 和丙硫氧嘧啶片4 g，充分搅拌均匀，再加入吐温-80、丙二醇各80 mL 和蒸馏水至400 mL 并充分混匀，即成100 g/L 胆固醇、200 g/L猪油、20 g/L 胆酸钠和10 g/L 丙硫氧嘧啶的脂肪乳剂。4 ℃保存，使用前加热熔化［6］。

1.3.1.2 动物造模 雄性ICR 小鼠常规适应性1 周后进行实验，除正常对照组外，其余各组每天灌服乳剂0.5 mL，1 h 后口服给药，连续14 d，于第15 d 禁食12 h，眼底静脉丛采血1 mL，静置45 min，8 000 r/min离心5 min，取血清，测血清TC 和LDL-C。

1.3.2 两色金鸡菊不同溶剂的提取物对降血脂活性的影响 溶剂极性对中草药成分的提取有很大的影响，不同极性的溶剂在提取过程中所得到的化学成分类型和得率存在较大的区别［7］。本研究采用水、75%乙醇和95%乙醇3 种不同极性溶剂分别对两色金鸡菊进行提取，以获得不同类型化合物的提取物，并通过高脂饲料致小鼠高血脂模型评价各提取物的降血脂活性，确定最优的提取溶剂。

1.3.2.1 不同溶剂提取方法 取两色金鸡菊1 kg，各3 份，分别加入8 倍量水、75%乙醇和95%乙醇回流提取2 h，共提取2 次，提取液合并，减压回收溶剂，得水提物400 g、75%醇提物320 g 和95%醇提物285 g。4 ℃避光保存，备用。

1.3.2.2 不同溶剂提取物的降血脂活性考察 雄性ICR 小鼠90 只，根据血脂水平及体质量，随机均衡分为9 组，每组10 只：正常组，模型组，阳性药辛伐他丁组（10 mg/kg），两色金鸡菊各洗脱部位给药分为高剂量组（相当于生药10 g/kg）、低剂量（相当于生药5 g/kg），具体给药剂量分组为：两色金鸡菊水提物高剂量组（4 000 mg/kg）和低剂量组（2 000 mg/kg）；两色金鸡菊75%乙醇提取物高剂量组（3 200 mg/kg）和低剂量组（1 600 mg/kg）；两色金鸡菊95%乙醇提取物高剂量组（2 850 mg/kg）和低剂量组（1 425 mg/kg）。每天给药1 次，连续7 d，给药体积均为0.2 mL/10 g。

1.3.3 两色金鸡菊水提物各部位对降血脂活性的影响 通过以降血脂活性为指导对两色金鸡菊不同溶剂提取考察，确定了以水提取。但由于给药量剂量较大，不利于进一步应用开发。为了去除杂质，保留有效成分，减少给药剂量，提高其生物利用度，本实验对两色金鸡菊水提物进行了以大孔吸附树脂进行富集纯化。

1.3.3.1 两色金鸡菊水提物精制 两色金鸡菊水提物分离流程图见图1。取两色金鸡菊2.5 kg 按 “1.3.2.1” 方法得水提物1.06 kg，加水1 L 溶解，终浓度70%乙醇浓度醇沉过夜，上清减压浓缩得到浸膏（组分1）650.24 g，沉淀充分干燥得醇沉部位（组分2）364.02 g。组分1 加水1 L 溶解，经860021 大孔吸附树脂处理，柱体积4 L，12 BV 水洗脱，减压浓缩得水洗脱部位（组分3）376 g；10 BV 30%乙醇洗脱，减压浓缩得30%乙醇洗脱部位（组分4）123.33 g；8 BV 50%乙醇洗脱，减压浓缩得50%乙醇洗脱部位（组分5）28.84 g；4 BV 70%乙醇洗脱，减压浓缩得70%乙醇洗脱部位（组分6）4.98 g；4 BV 90%乙醇洗脱，减压浓缩得90%乙醇洗脱部位（组分7）2.39 g，4 ℃避光保存，备用。各分离部位得率见表1。

表1 两色金鸡菊水提物及各组分得率 %

图1 两色金鸡菊水提物纯化流程图

1.3.3.2 两色金鸡菊水提物精制部位的降血脂活性考察 雄性ICR 小鼠190 只，根据血脂水平及体质量，随机均衡分为19 组，每组10 只：正常组、模型组、阳性药辛伐他丁组（10 mg/kg）及两色金鸡菊各洗脱部位给药组，给药组又分为高剂量组（相当于生药10 g/kg）、低剂量组（相当于生药5 g/kg）。具体给药剂量分组为：水提物高剂量组（4 200 mg/kg）和低剂量组（2 100 mg/kg）；组分1 高剂量组（2 600 mg/kg）和低剂量组（1 300 mg/kg）；组分2高剂量组（1 500 mg/kg）和低剂量组（750 mg/kg）；组分3 高剂量组（1 500 mg/kg）和低剂量组（750 mg/kg）；组分4 高剂量组（540 mg/kg）和低剂量组（270 mg/kg）；组分5 高剂量组（150 mg/kg）和低剂量组（75 mg/kg）；组分6 高剂量组（20 mg/kg）和低剂量组（10 mg/kg）；组分7 高剂量组（10 mg/kg）和低剂量组（5 mg/kg）。每天给药1 次，连续7 d，给药体积均为0.2 mL/10 g。

1.4 统计学方法

用SPSS 20.0 统计软件进行分析。计量资料以（±s）表示，均首先用levene 法进行方差齐性检验，若方差齐，则多组间用单因素方差分析，2 组间用两样本t检验。若参数检验的假设不合理，则多组间用Kruskal-Wallis 检验，2 组间用Wilcoxon 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。数据统计后用Prism 6.0 作图软件进行图标制作。

2 结果

2.1 不同溶剂的提取物对降血脂活性的影响

通过给予高脂饲料14 d，模型组与正常组比较，TC 和LDL-C 均显著提高，表明造模成功。当给予两色金鸡菊各溶剂提取物后，与模型组比较，两色金鸡菊水提物和95%乙醇提取物在低剂量下均能显著性降低高血脂小鼠血清中TC 和LDL-C 含量；且两色金鸡菊水提物在高剂量下能显著降低高血脂小鼠血清中TC 和LDL-C 含量，但95%乙醇提取物无显著改善效果。两色金鸡菊的民间使用习惯也有每天喝2 杯两色金鸡菊茶用于控制糖尿病的传统［8-9］。根据药效结果结合民间使用习惯，确定两色金鸡菊的提取溶剂为水。见图2。

图2 两色金鸡菊不同溶剂提取物对高脂饲料致小鼠高血脂模型的影响

2.2 水提物精制部位的降血脂活性考察结果

通过给予高脂饲料14 d，模型组与正常组比较，TC 和LDL-C 均显著提高，表明造模成功。当给予两色金鸡菊水提物及各纯化部位后，与模型组比较，在低剂量下水提物，醇沉沉淀部位和30%洗脱部位，可显著降低血清TC 含量；水提物可显著降低LDL-C 含量。在高剂量下水提物和组分4均可显著降低血清TC 和LDL-C 含量，其他部位均无显著改善，且组分2 在高剂量给药下该组动物全部因腹泻死亡，无法获得相关血脂指标。根据给药剂量以及动物存活率综合分析，确定两色金鸡菊大孔30%洗脱部位为活性部位（组分4）。见图3。

图3 两色金鸡菊水提物各部位对小鼠高脂模型TC和LDL-C的影响

3 结论

高脂血症是机体脂质代谢紊乱的临床表现之一，同时也是冠心病、动脉粥样硬化等疾病的病理基础，我国有数目庞大的高血脂人群［10-12］。临床上主要以TG，TC，LDL-C 和HDL-C 为代表性成分。研究表明，TG 在脂蛋白调控以及相关脂质代谢中扮演着关键角色，血液中TG 和TC 浓度的升高会增加冠状动脉疾病的发病机率［13］。同时血液中LDL-C 浓度的升高使血液变稠并导致动脉粥样硬化的风险增加［14］。大量研究表明HDL-C 具有抵抗冠状动脉粥样硬化，HDL-C 浓度每升高0.025 mmol/L，可以将患病风险降低2%～4%［15-17］。

本研究运用相似相溶原理，对两色金鸡菊分别以水、75%乙醇、95%乙醇进行提取，并将各提取物作用于高脂饲料致小鼠高血脂模型考察其降血脂活性。结果表明两色金鸡菊水提物在低、高剂量对小鼠高血脂模型均表现出良好的改善作用。综合药效结果及民间用药习惯，确定优选提取溶剂为水。同时，结合降血脂药效活性筛选活性部位。结果表明当给予两色金鸡菊及各纯化部位后，与模型组比较，醇沉沉淀部位和大孔吸附树脂30%乙醇洗脱部位均表现出显著的降血脂活性。但醇沉部位高剂量下动物全部死亡，表明其有较大毒性。根据给药剂量以及动物存活率综合分析，确定两色金鸡菊大孔吸附树脂30%乙醇洗脱部位为活性部位。