基于响应面法优化白背牛尾菜中薯蓣皂苷元的提取工艺研究

★ 郭强 赵灼滨 陈荷莹 刘毅 金晨 黄慧莲（江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

白背牛尾菜Smilax nipponicaMiq.来自于百合科菝葜属，作为牛尾菜的变种植物，又名金刚豆藤、草菝葜等，药性平，味甘、苦，具有祛痰、止咳等功效［1］。经国内外文献研究发现，牛尾菜中含有丰富的皂苷类成分，其中以薯蓣皂苷为主，其具有抗炎、抗痛风、抗高尿酸血症、利尿等作用［2-7］。作为白背牛尾菜中主成分薯蓣皂苷的苷元，薯蓣皂苷元广泛应用于临床药理中，具有明显的抗高血脂、抗肿瘤、抗氧化以及抗炎等作用，对于结肠癌［8］、肝癌［9-10］等均具有显著的治疗效果。文献表明，薯蓣皂苷元通过调节功能蛋白，可以抑制肿瘤细胞的增殖等行为诱导细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用［11］。有研究通过正交设计的方法对牛尾菜的提取工艺进行考察［12］，本实验在单因素考察的基础上运用了响应面的设计和分析方法考察薯蓣皂苷元提取以及酸水解相关工艺参数，优化后使薯蓣皂苷元的得率提高，可以为白背牛尾菜中薯蓣皂苷元的制备提供参考。

1 材料与仪器

白背牛尾菜的根部采于南昌市湾里区梅岭，由江西中医药大学胡生福老师鉴定为百合科菝葜属白背牛尾菜Smilax nipponicaMiq.。白背牛尾菜标本保存于江西中医药大学现代制剂教育部重点实验室，编号为20200301。乙醇、石油醚等所有试剂均为分析纯，购于西陇化工股份有限公司；薯蓣皂苷元（批号YJ-111539，购于中国食品药品检定研究院）；1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。

2 方法与结果

2.1 白背牛尾菜中薯蓣皂苷元含量测定

2.1.1 色谱检测条件 色谱柱：Agilent Zorbax-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；进样量：10 μL；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；流动相为乙腈∶水（9∶1）。上述色谱条件下薯蓣皂苷元对照品和样品色谱图见图1。

图1 薯蓣皂苷元对照品和供试品HPLC色谱图

2.1.2 标准曲线的绘制 精密称定薯蓣皂苷元20 mg，置于10 mL 容量瓶中，甲醇溶解并定容。分别用甲醇精密稀释至浓度为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL 的对照品溶液。以X表示薯蓣皂苷元浓度，Y表示峰面积，甲醇作为空白溶液，计算得回归方程为：Y=69 917X-196.34（R2=0.999 8）。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒重过3 号筛的白背牛尾菜粉末2.0 g，置于250 mL 圆底烧瓶中。按照相应提取条件回流提取，提取液冷却后抽滤，取滤液，加入1.5 mol/L 浓硫酸与60 mL石油醚（60～90℃）于95 ℃条件下加热回流4.5 h，水解，取石油醚层，蒸干，用5 mL 甲醇定容，得到薯蓣皂苷元粗取液。

2.1.4 精密度试验 取0.5 mg/mL 的对照品溶液，用上述 “2.1.1” 色谱条件连续进样6 次，得峰面积的RSD值，检查仪器的精密度是否良好。峰面积分别为3 295、3 298、3 314、3 288、3 286、3 293，RSD为0.3%，结果显示该实验使用仪器的精密度良好。

2.1.5 重复性试验 按 “2.1.1” 与 “2.1.3” 项下供试品溶液分析条件和制备方法分别进样测定，记录峰面积，，以6 次峰面积的RSD评价方法的重复性。含量分别为0.50、0.50、0.51、0.52、0.51、0.50 mg/g，经计算，RSD为1.6%，显示该方法的重复性较好。

2.1.6 稳定性试验 按 “2.1.3” 项下供试品溶液制备方法，制备后，分别室温下静置0、2、4、6、12、24、48 h 后再按照 “2.1.1” 项下分析条件进样测定，记录峰面积，并计算RSD。峰面积分别为2 630、2 540、2 576、2 572、2 652、2 660、2 658，RSD为1.9%，表明该制备方法的稳定性良好。

2.1.7 加样回收率实验 精密称取6 份干燥至恒重的过3 号筛的白背牛尾菜粉末2 g，分别精密加入相当于样品80%、100%、120%对照品的含量，每类做3 份，按 “2.1.3” 项下供试品溶液制备方法制备，按上述 “2.1.1” 项下分析条件进样，计算加样回收率。其平均回收率为98.61%，RSD为1.4%。见表1。

表1 加样回收率

2.2 白背牛尾菜中薯蓣皂苷元酸水解工艺参数优化

以白背牛尾菜中的薯蓣皂苷元得率为考察指标，分别进行单因素考察，分析酸浓度、酸水解时间及酸水解温度对薯蓣皂苷元得率的影响。

2.2.1 酸浓度的考察 精密称取2.0 g 过3 号筛的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分别置于250 mL 圆底烧瓶中，料液比1∶23，乙醇浓度70 %，提取30 min，提取温度为90℃，分别用0.7、0.9 、1.1、1.5、2.0 mol/L 浓硫酸水解提取物。得率随着酸浓度的升高而升高，在1.5 mol/L 时达到峰值，而后随浓度的升高而降低，由此可得酸浓度为1.5 mol/L 时得率最高。见图2。

图2 各因素对于薯蓣皂苷元得率的影响

2.2.2 酸水解时间的考察 精密称取2.0 g 过3 号筛的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分别置于250 mL圆底烧瓶中，料液比1∶23，乙醇浓度70 %，提取30 min，提取温度为90℃，用1.5 mol/L 浓硫酸水解提取物。水解时间分别为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h。得率随着水解时间的增加而逐渐增加，在4.5 h 时达到峰值，在4.5 h 后得率随时间的增加而逐渐降低，由此可知水解时间为4.5 h 时薯蓣皂苷元的得率最高。见图2。

2.2.3 酸水解温度的考察 精密称取2.0 g 过3 号筛的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分别置于250 mL圆底烧瓶中，料液比1∶23，乙醇浓度70%，提取30 min，提取温度为90 ℃，用1.5 mol/L 浓硫酸水解提取物。设定薯蓣皂苷的水解时间为2 h，水解温度分别设置为50、70、90、110、130 ℃。薯蓣皂苷元的得率随着酸水解时水解温度的升高而逐渐升高，在90 ℃时达到峰值，90 ℃后随酸水解温度的升高而逐渐降低，由此可得酸水解薯蓣皂苷时水解温度为90 ℃时得率最高。见图2。

2.2.4 薯蓣皂苷元酸水解工艺响应面实验 采用软件Design Expert 8.0 中的Box-Behnken 中心组合试验设计原理及响应面分析法运用此前得到的最佳酸水解参数对薯蓣皂苷元的酸水解工艺进行优选。以酸浓度（A）、水解温度（B）、水解时间（C）作为自变量，以皂苷元的得率作为响应值，设计3 因素3 水平试验表，用代码值-1、0、1 表示。实验方案设计见表2。

表2 响应面的因素水平设计

2.2.5 模型的建立及其显著性检验 应用Designer Expert 8.0 软件进行响应面分析，将薯蓣皂苷元的得率设置为响应值，设计实验及结果见表3，通过二阶多项式进行回归，所得回归模拟方程如下：甾体皂苷元得率=1.63-0.22A+0.18B- 3.436×10-3C+0.049AB-0.14AC+0.039BC-0.21A2- 0.12B2-0.15C2，模型方差分析见表4。根据F值可知3 种因素影响次序为：A＞B＞C，实验模型的P和F的值均小于0.001，说明实验模型中的二项式符合实际提取情况，较好地反映了料液比的作用达到极显著水平，酸浓度、水解温度、水解时间、酸浓度和水解时间的交互作用具有高显著水平。

表3 响应面试验设计及结果

表4 回归方程各项方差分析

2.2.6 响应面分析因素之间的相互作用 薯蓣皂苷在酸水解时，硫酸浓度和酸水解温度的交互作用对薯蓣皂苷元提取率的影响。经三维图分析可得，当酸浓度固定不变时，薯蓣皂苷元的得率随着酸水解薯蓣皂苷时水解温度的升高先增加后逐渐降低，在水解温度和酸浓度处于中间水平时得率达到最大值。当水解时间固定不变时，在薯蓣皂苷元的得率随水解时间的增加而先升后降，在水解时间和水解温度处于中间水平时薯蓣皂苷元的得率达到最高值。当水解时间固定不变时，薯蓣皂苷元的得率随着酸浓度的增大先升高后逐渐降低，当酸浓度固定不变时，得率随着水解时间的增加先升后降，得率在酸浓度和水解时间处于中间水平时达到最高值。见图3。

图3 各因素交互作用对得率的影响

2.2.7 最佳工艺的确定 结合Designer Expert 8.0，综合分析与薯蓣皂苷元得率有关的各种因素，分析认为最优的回流提取工艺为酸浓度为1.27 mol/L，水解温度为95 ℃，水解时间为4.5 h，采用上述最优工艺条件进行验证，重复实验6 次，薯蓣皂苷元平均得率为1.64 mg/g，RSD为0.25%，说明响应面优化所得工艺可靠。见表5。

表5 验证参数

2.3 白背牛尾菜甾体皂苷元提取工艺的优化

以酸水解白背牛尾菜中薯蓣皂苷后得到的薯蓣皂苷元的得率为考察指标，进行单因素考察，分别研究提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度对薯蓣皂苷元类成分得率的影响。

2.3.1 提取温度的考察 精密称取2.0 g 过3 号筛的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分别置于250 mL圆底烧瓶中，料液比1∶20，乙醇浓度70 % ，提取30 min，提取温度分别为35、50、65、80、95、110 ℃。平行试验3 份，经水解后，取平均值。薯蓣皂苷元的得率随着乙醇提取时的温度升高而增大，在90 ℃时达到最高值随后趋于平稳。由此可得，提取温度为90 ℃时得率最高。见图4。

图4 各因素对于薯蓣皂苷元得率的影响

2.3.2 提取时间的考察 精密称取2.0 g 过3 号筛的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分别置于250 mL圆底烧瓶中，料液比设置为1∶20，70 %浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，提取温度为恒温90 ℃提取，提取时间分别为30、60、90、120、150、180 min。平行试验3 份，经水解后，取平均值。结果表明得率随时间的增长而增大，于90 min 达到最大值而后得率降低。说明时间为90 min 时得率最高。

2.3.3 料液比的选取 精密称取2.0 g 过3 号筛的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分别置于 250 mL 圆底烧瓶中，固定提取时间30 min，提取温度90 ℃，乙醇浓度70%，料液比依次1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40 恒温提取。平行试验3 份，经水解后，取平均值。结果表明得率随着料液比的增加而增加，在1∶20 之后的薯蓣皂苷元得率趋于相对平稳，说明料液比参数为1∶20 时得率最高。见图4。

2.3.4 乙醇浓度的考察 精密称取2.0 g 过3 号筛的同一批白背牛尾菜粉末6 份，分别置于250 mL圆底烧瓶中，料液比为1∶20，在提取温度在90 ℃的条件下恒温提取，提取时间为30 min，乙醇浓度设置为40%、50%、60%、70%、80%、90%。平行3 份，经水解后，取平均值。结果表明随着乙醇浓度增大，皂苷元的含量增多，在乙醇浓度为80%的时候得率最高，随之降低。说明乙醇浓度为80%时，提取皂苷元最合适。见图4。

2.3.5 白背牛尾菜中薯蓣皂苷元提取工艺Box-Behnken 响应面曲面实验 通过单因素实验，采用软件 Design Expert 8.0 中的 Box-Behnken 中心组合试验设计原理及响应面分析法对薯蓣皂苷元的提取工艺进行优选。乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）作为自变量，以总皂苷元的得率作为响应值，设计3 因素3 水平试验表，用代码值-1、0、1 表示。响应面的因素水平设计见表6。

表6 响应面的因素水平设计

2.3.6 模型的建立及其显著性检验 应用Designer Expert 8.0 软件进行响应面分析，以薯蓣皂苷元的得率为响应值，响应面实验结果见表7。通过二阶多项式进行回归，所得回归模拟方程如下：甾体皂苷元得率=1.53+0.081A-0.016B+ 0.071C-0.058AB-5.957×10-3AC-0.063BC+0.030A2-0.13B2-0.058C2。根据F值可知3 种因素影响次序为：C＞A＞B，实验模型的P和F的值均小于0.001，说明实验模型中的二项式符合实际提取情况，较清晰地反映了料液比的作用达到极显著水平，乙醇浓度与提取时间、提取时间与料液比、乙醇浓度和提取时间的交互作用具有高显著水平。

表7 响应面试验设计及结果

表8 回归方程各项方差分析

2.3.7 响应面分析因素之间的相互作用 当乙醇浓度为任一固定值时，薯蓣皂苷元的得率随着白背牛尾菜的提取时间的增加先增加后缓慢降低。在提取时的乙醇浓度和时间均处于较低水平时薯蓣皂苷元的得率达到最低值。在提取时间处于中等水平，乙醇浓度处于中间水平时得率达到最高值。药材粉末进行提取时，相应的料液比和不同的乙醇浓度的交互作用对薯蓣皂苷元最终得率有影响。当乙醇浓度为定值时，水解后得到的薯蓣皂苷元的得率随料液比的增大而升高后逐渐降低，在乙醇浓度和料液比的参数处于中间水平时薯蓣皂苷元的得率达到最高值，在乙醇浓度和料液比的参数均处于较低水平时薯蓣皂苷元的得率达到最低值。当料液比固定不变时，得率随着提取时间的增加先升高后降低，当提取时间固定不变时，得率随着料液比的增大先升高后降低，得率在料液比和提取时间处于中间水平时达到最高值，在料液比和提取时间处于较低水平时达到最低值。见图5。

图5 各因素交互作用对得率的影响

2.3.8 最佳提取工艺的确定 结合Designer Expert 8.0，综合分析与薯蓣皂苷得率有关的各种因素，认为最优的回流提取工艺参数为提取时间为80 min，料液比的参数为1∶23，提取溶剂为81 %乙醇溶液，薯蓣皂苷元得率的预测值为1.70 mg/g。采用上述最优工艺条件进行验证，重复实验6 次，得到薯蓣皂苷元平均得率为1.71 mg/g，与理论值相差不大，说明响应面优化所得提取工艺可靠。见表9。

表9 验证实验

3 讨论

本实验首次采用响应面法对于白背牛尾菜中薯蓣皂苷元的提取以及酸水解进行较为全面的考察，通过对提取时间、料液比、乙醇浓度、酸浓度、水解温度、水解时间这6 种因素分别进行单因素实验。运用响应面法研究对于酸水解和提取薯蓣皂苷元的最佳工艺条件：以81%乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1∶23，提取80 min，酸浓度为1.27 mol/L，于95 ℃下水解4.5 h 的相应条件下，从白背牛尾菜中提取的薯蓣皂苷元的得率为1.71 mg/g。目前，国内外对于白背牛尾菜的研究较少，可为其中薯蓣皂苷元的制备提供参考。