基于同等药效下2 种不同基原凤尾草的质量控制方法研究

★ 熊紫微 温泉 吴佳辉 冯育林,2 杨世林,2 钟国跃（.江西中医药大学 南昌 330004；2.创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室 南昌 330006）

凤尾草为凤尾蕨科凤尾蕨属药用植物［1］，在我国分布广泛，主要集中在我国的西南地区［2］，又名 “大叶凤尾蕨” “井边草”［3］。苗医用凤尾草最早记载于《本草拾遗》古籍中，主要功效为清热利湿、凉血止血、消肿解毒［4］，用于治疗黄疸型肝炎［5-6］，已有中成药或者方剂中使用凤尾草治疗该病。经品种整理发现，凤尾草存在 “同物异名” “异名同物” 等问题［7］，较多地区以井栏边草作为凤尾草使用［6］。经查阅相关文献，凤尾草主要有凤尾蕨Pteris creticaL.var.nervosa、井栏边草Pteris multifidaPoir.、剑叶凤尾蕨Pteris ensiformisBurm、溪边凤尾蕨Pteris excelsaGaud.及蜈蚣草Pteris vittataL.等［8］。据相关标准记载，1977 年版《中国药典》［9］、1992 年版《中华人民共和国卫生部药品标准》［10］、第3 版《台湾中药典》［11］以井栏边草为基原收入标准中，而2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》［8］以井栏边草、凤尾蕨、剑叶凤尾蕨、溪边凤尾蕨、蜈蚣草为基原收入标准中，而目前为止2020 年版《中国药典》并未将其收载。前面3 个标准基原收载单一，2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》对其基原进行了扩充，但是以上标准质量标准的完善还存明显不足，性状与鉴别描述较简单，鉴别检查项不完善，含量测定也未纳入其中。

目前大多数对于井栏边草或者其饮片的含量测定以木犀草素-7-O-葡萄糖苷为定量化合物［12］，而凤尾蕨基原研究较少。经研究发现，凤尾蕨与井栏边草均含有木犀草素-7-O-芸香糖苷与木犀草素-7-O-葡萄糖苷［13-14］，且前者具有抗关节炎与抗真菌作用［15-16］，后者具有消炎、预防心肌肥厚等功效［17-18］。所以通过描述凤尾蕨与井栏边草的植株形态与根茎叶及粉末的显微鉴别［19］、蕨素C 的薄层色谱鉴别，凤尾蕨药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分，醇溶性浸出物测定以及木犀草素-7-O-芸香糖苷与木犀草素-7-O-葡萄糖苷的含量测定，制定合理的限度，为凤尾草质量控制提供合理的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-30A 型超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；薄层色谱硅胶板（青岛海洋化工厂）；METTLER AB104-N 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；石蜡包埋机（湖北亚光医用电子技术有限公司）；组织石蜡切片机（德国莱卡公司）。

1.2 试药

甲醇、乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷、正丁醇、乙酸、乙醇（国药试剂有限公司）；甲酸（分析纯，西亚试剂有限公司）；伊红染色液（北京索莱宝生物技术有限公司）；氨基半乳糖（阿拉丁生物技术有限公司）；谷草转氨酶（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶、丙二醛、肿瘤坏死因子-α（南京建成生物工程研究所）；地塞米松（麦克林生物公司）；组织固定液（大连美仑生物科技有限公司）；木犀草素-7-O-云香糖苷（本实验室自制，经NMR 和MS 等波谱法鉴定结构，纯度≥99.1%）；木犀草素-7-O-葡萄糖苷（批号1111720-201609，纯度≥94.9%，中国食品药品检定研究院）；蕨素C（批号CFN6802，Chem Faces 公司）。

2 方法与结果

2.1 凤尾草浸膏的制备

将凤尾蕨与井栏边草干燥药材分别加10 倍量70%的乙醇溶液回流提取30 min，过滤蒸干，得到浸膏。凤尾蕨与井栏边草的浸膏得率分别为6.3%和7.0%。

2.2 体外药效实验研究

测定2 种不同基原药材粗提取物对RAW 264.7细胞的毒性。将细胞快速解冻，复苏。用适合的培养基加到适合种板的状态，接种于96 孔板中，用2 种浸膏稀释至5、2.5、1.25、0.625、0.3 125 mg/mL，培养细胞24 h 后加入10%的CCK-8 溶液测定吸光度，计算细胞存活率。最后采用Griess 法测定NO。

2.3 体内药效实验研究

2.3.1 动物分组及给药 将72 只ICR 小鼠在新环境中喂养1 周后，随机分为9 组：空白对照组、模型组、阳性药组、凤尾蕨与井栏边草总提物高剂量组（10 g/kg）、中剂量组（5 g/kg）、低剂量组（2.5 g/kg），每组8 只。采用灌胃方式给药，空白对照组、模型组和阳性药组则灌胃等体积的生理盐水，给药频率为每天1 次，共7 d。阳性药组腹腔注射地塞米松（6 mg/kg）。2 h 后，除对照组腹腔注射等体积的生理盐水外，其余各组小鼠均采用腹腔注射LPS（50 μg/kg）和D-gal（400 mg/kg）诱导小鼠急性肝损伤。禁食不禁水6 h 后，收集血液和肝脏，一部分肝脏放入组织固定液中，其余肝脏置于低温保存。

2.3.2 血清生化指标检测 血液采集结束后，提取血清，用于检测肾脏中重要酶指标ALT、AST，炎症指标TNF-α、IL-6，氧化应激指标SOD 和MDA。

2.3.3 肝脏组织病理学检测 取肝组织相同部位用组织固定液固定后进行修块，流水冲洗24 h，用乙醇进行脱水30 min，二甲苯透明10 min，石蜡包埋后切片、烤片、脱蜡水化，经HE 染色后脱水透明，烘干后封片，最后观察情况。

2.4 药效实验结果

2.4.1 不同基原凤尾草粗提物对细胞存活率及LPS 诱导的RAW 264.7 细胞释放NO 含量的影响 凤尾蕨与井栏边草在药物浓度为0.625 mg/mL 时，既能够保证细胞接近100%的存活率，又能够显著降低NO 的释放，说明凤尾蕨与井栏边草均有抗炎的作用。见图1。

图1 2种基原药材对细胞存活率及NO释放量的影响

2.4.2 体内实验炎症氧化应激指标影响 通过检测血清指标ALT、AST、IL-6、TNF-α，发现凤尾蕨与井栏边草10 g/kg 时，能够显著降低血清中ALT 与AST 的活力，显著降低炎症因子IL-6 和TNF-α的水平。检测肝脏中氧化应激指标SOD 与MDA 时发现，均能显著降低MDA的含量，提高SOD酶活性。见图2。

图2 2种基原药材对生化指标的影响

2.4.3 不同给药组别对肝组织病理学影响 通过观察肝脏病理切片，正常组肝细胞胞浆完整，肝索清晰；模型组纹路不清晰，组织间隙充血，粘连，细胞浸润比较严重。给予凤尾蕨、井栏边草和阳性药地塞米松后，肝细胞坏死面积明显减轻。见图3。

图3 肝组织病理切片

2.5 质量控制方法研究

16 批凤尾草全草药材，经江西中医药大学钟国跃教授鉴定为凤尾蕨科凤尾蕨属植物凤尾蕨Pteris creticaL.var.nervosa 与 井 栏 边 草Pteris multifidaPoir.，样品采集信息见表1。

表1 凤尾草全草样品采集信息

2.5.1 性状 凤尾蕨植株高50～70 cm。根茎短而直立或斜升，粗约1 cm，先端被黑褐色鳞片。叶片卵圆形，长25～30 cm，宽15～20 cm，一回羽状；先端渐尖并有锐锯齿，基部阔楔形。主脉下面强度隆起，禾秆色，光滑。侧脉两面均明显，稀疏，斜展，单一或从基部分叉。叶干后纸质，绿色或灰绿色。

井栏边草植株高30～45 cm。根茎较短，直立，叶片紧密呈簇状生长，叶片卵状长圆形，一回羽状叶，叶边缘比较柔软但不整齐，并且呈锯齿状，顶部叶片为三瓣，垂直向下延伸。主脉两面均隆起，颜色呈淡棕色。叶片干后形如草的质地，颜色为暗绿色。见图4。

图4 原植物及其干燥植株药材、粉末图

2.5.2 显微鉴别

2.5.2.1 制片方法 将植物组织进行修剪，温水浴煮泡发1 h，用固定液FAA 固定［20］。

2.5.2.2 凤尾草根横截面 根横切面呈类圆形，细胞排列紧密，呈类梯形。表皮为一列薄壁细胞，基本组织中有4 个分体中柱，周韧型，基本对称。维管束木质化、木栓化和角质化细胞被番红染液染红，在偏光镜下显红色［21］。

2.5.2.3 凤尾蕨茎横截面 茎横切面呈蝴蝶形，内部有2 个似海马细胞的分体呈 “八” 字形排列，从边缘往里部，细胞交错排列，往里面有木质细胞，在显微镜下显橙红色。

2.5.2.4 凤尾蕨叶脉及叶横截面 中脉上部凹陷，呈两山峰状，下部凸出。表皮为一列薄壁细胞，被角质层，内侧均有3～5 层厚壁细胞。维管束呈类三角形，周韧型。管胞1～2 层，呈淡红色，在偏光镜下呈亮红色。见图5。

图5 凤尾蕨根茎叶横截面显微图

2.5.2.5 凤尾蕨显微粉末鉴别 粉末呈淡黄绿色。叶表皮细胞波浪弯曲状。孢子囊柄长短不一，为4～6 个细胞，一般为2 列。呈近椭圆形，基部略窄，孢子呈三角形，呈棕红色光芒。管胞可见网状或梯状纹孔。根状茎鳞叶细胞为棕色薄壁细胞，长多边形。见图6。

图6 凤尾蕨粉末显微鉴别图

2.5.2.6 井栏边草根横截面 井栏边草根部横截面细胞排列紧密，外围细胞较厚，在显微镜下显橙红色。内部有几层薄壁细胞，呈无色透明状。整个横截面呈圆形，有4 个小型弧状的分体，内部分布着薄壁细胞，且大小不一。

2.5.2.7 井栏边草茎叶横截面 茎横切面呈蝴蝶形，内部有2 个似海马细胞的分体呈 “V” 字形排列，从边缘往里部，细胞交错排列，往里面有木质细胞，在显微镜下显橙红色。见图7。

图7 井栏边草根茎叶横截面显微图

2.5.2.8 井栏边草粉末显微鉴别 粉末呈淡暗绿色。孢子呈三角形［22］；管胞可见网状或梯状纹孔；根状茎鳞叶细胞为棕色薄壁细胞，长多边形。见图8。

图8 井栏边草粉末显微鉴别图

2.5.3 薄层色谱鉴别 取本品粉末2 g，加入甲醇30 mL，超声15 min，冷却，滤过，补重蒸干，加入纯水复溶，用二氯乙烷萃取至无色，取下层萃取液蒸干复溶，作为供试品溶液。吸取供试品溶液，对照药材溶液，对照品溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷∶正丁醇∶乙酸（16∶1∶1）为展开剂，展开。置紫外光灯254 nm 下检视检。结果表明，上述条件能够较好地将各斑点分离，显色较清晰。见图9。

图9 16批凤尾草薄层色谱鉴别图（254 nm）

2.5.4 水分、总灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物测定 按照2020 年版《中国药典》一部附录方法测定了16 批凤尾蕨药材水分、总灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物。见表2。

表2 凤尾蕨水分、灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物测定结果 %

2.5.5 含量测定

2.5.5.1 色谱条件和系统适用性试验 使用Cosmosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液（17∶83）为流动相，流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长348 nm，进样量10 μL，对照品溶液和供试品溶液的HPLC 色谱见图10。

图10 对照品溶液和供试品溶液的HPLC色谱

2.5.5.2 供试品溶液的制备 取凤尾蕨药材粉末（过4 号筛）约0.5 g，精密称定，加入70%甲醇20 mL，称定质量，超声45 min，冷却，称重，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，得续滤液作为供试品溶液。

2.5.5.3 对照品溶液的制备 取对照品适量，精密称定，加入甲醇配制成含木犀草素-7-O-芸香糖苷浓度为0.060 1 mg/g 与木犀草素-7-O-葡萄糖苷浓度为0.014 1 mg/g 的对照品溶液。

2.5.5.4 线性关系考察 精密称取木犀草素-7-O-芸香糖苷与木犀草素-7-O- 葡萄糖苷对照品，加甲醇将木犀草素-7-O-芸香糖苷配制成1、4、8、16、64、256 μg/mL 浓度，将木犀草素-7-O-葡萄糖苷配制成1.7、7.1、14.1、28.2、56.5、113 μg/mL 浓度对照品溶液，进样10 μL，按上述色谱条件测定，以峰面积值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程，相关系数与范围见表3。

表3 凤尾蕨中2种指标性成分线性关系考察结果

2.5.5.5 精密度试验 取 “2.5.5.3” 项对照品溶液，按 “2.5.5.1” 项下色谱条件于同1 d 内连续进样测定6 次，记录峰面积。结果显示，木犀草素-7-O-芸香糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷峰面积的RSD分别为0.17%和0.23%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5.5.6 重复性试验 取同一批药材6 份，按 “2.5.5.2” 项下供试品溶液制备方法和 “2.5.5.1” 项HPLC 测定方法进行分析，记录2 种成分的峰面积，代入标准曲线计算样品中各成分的含量。结果显示，木犀草素-7-O-芸香糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷含量的RSD分别为1.97%和3.57%（n=6），表明方法重复性良好。

2.5.5.7 稳定性试验 取同一供试品溶液按上述色谱条件分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样测定，木犀草素-7-O-芸香糖苷峰面积平均值的RSD为2.29%，木犀草素-7-O-葡萄糖苷峰面积平均值的RSD为4.68%，结果表明供试品溶液中木犀草素-7-O-芸香糖苷和木犀草素-7-O-葡萄糖苷均稳定。

2.5.5.8 色谱柱耐用性 取同一供试品溶液按上述色谱条件分别用Global Chromatography C18、依利特Hypersil ODS 和Cosmosil C18色 谱 值 进 样 分 析，木犀草素-7-O-芸香糖苷的RSD为4.41%，木犀草素-7-O-葡萄糖苷的RSD为5.00%。

2.5.5.9 回收率试验 精密称取已知含量同一批凤尾蕨样品6 份各0.5 g，精密称定，再加入适量的木犀草素-7-O-芸香糖苷与木犀草素-7-O-葡萄糖苷对照品，木犀草素-7-O-芸香糖苷加样回收率为100.49%～107.20%，平均加样回收率为104.02%，RSD为2.75%；木犀草素-7-O-葡萄糖苷的回收率为90.52%～95.10%，平均加样回收率为92.49%，RSD为1.92%。见表4。

表4 凤尾草样品2种指标性成分含量测定结果 mg/g

2.6 样品含量测定

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，16 批凤尾蕨中木犀草素-7-O-芸香糖苷的含量为0.078 2～8.867 3 mg/g，木犀草素-7-O-葡萄糖苷的含量为0.112 2～2.997 1 mg/g。

3 讨论

本研究采用LPS/D-gal诱导ICR小鼠急性肝炎，肝损伤指标ALT、AST、TNF-α、IL-6、MDA 水平显著升高，SOD 水平显著降低。凤尾蕨与井栏边草在给药量均为10 g/kg 时，能够显著降低AST、ALT、TNF-α、IL-6 的水平，井栏边草抵御氧化应激的效果比凤尾蕨效果好，井栏边草能够显著提高SOD 的活性。凤尾蕨与井栏边草均能够显著降低MDA 含量，起到保护肝组织，减轻氧化应激。实验结果表明，2 种基原凤尾草均可通过降低相关炎症因子水平，发挥保肝作用［23］。本研究确定了凤尾蕨提取物对急性肝炎的保护和治疗作用，为凤尾草治肝损伤提供科学理论依据。

在薄层色谱鉴别中，经过多次试验，对展开剂三氯甲烷、甲醇、正丁醇、乙酸进行条件摸索，最终选用硅胶GF254薄板。三氯甲烷∶正丁醇∶乙酸（16∶1∶1）为展开剂条件，同时进行方法学考察，分别考察温度25 ℃和湿度34%、温度19 ℃和湿度52%、温度4 ℃和湿度75%的3 种不同展开环境，结果表明该鉴别方法耐用性良好，色谱图Rf值适中，且分离度好。在对含量测定方法的提取方法、提取溶媒、提取时间、流动相系统的实验考察中，得出最佳的含量测定方法为70%的甲醇超声提取45 min，乙腈-0.1%甲酸进行洗脱最佳。各峰的保留时间适中，实验重复性较好，有利于含量测定。

根据16 批样品的测定结果，结合2020 年版《中国药典》中同类药材标准［24］，取均值上浮20%为10.9%，综合分析确定凤尾草水分不得高于10.9%，16 批次样品全部合格，合格率为100%，建议规定凤尾草水分测定不得超过10.9%；总灰分均值为12.5%，取均值上浮20%为15.0%，16 批次样品中14 批合格，合格率为87.5%；酸不溶性灰分平均值为8.1%，取均值上浮20%为9.8%。16 批次样品中13 批合格，合格率为81.3%，建议规定凤尾草总灰分不得超过15.0%，酸不溶灰分不超过10.0%；醇溶性浸出率均值为20.4%，取均值下浮20%为16.3%，16 批次样品全部合格，合格率为100%，建议规定凤尾草醇溶性浸出物不得少于16.3%，凤尾草样品中木犀草素-7-O-葡萄糖苷含量的平均值为0.13%，取平均值下浮80%，合格批次16 批，合格率为81.3%。木犀草素-7-O-葡萄糖苷平均值为0.10%，取平均值下浮60%，确定含量限度值为0.04%，合格批次16 批，合格率为81.3%。建议规定凤尾草中木犀草素-7-O-芸香糖苷（C27H30O15）不得少于0.06%，木犀草苷（C21H20O11）不得少于0.04%。

通过定量犀草素-7-O-芸香糖苷，合理规范药材，并发现其具有治疗急性肝损伤的作用。在薄层色谱研究中，使用蕨类植物特征性成分蕨素C 与对照药材进行定性鉴别，为后期对药材假伪的判定提供依据。