生物信息学分析及实验验证探索抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎炎症应答候选基因及分子机制

张冬梅,张妍楠,秦建华,欧三桃,吴蔚桦

抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)相关性血管炎是一类由ANCA导致的以小血管壁炎症和纤维素样坏死为特征的一类系统性自身免疫性疾病。ANCA相关性血管炎的核心发病机制是ANCAs导致中性粒细胞过度激活,释放炎性细胞因子、活性氧和裂解酶,从而损伤血管内皮细胞[1]。既往对ANCA相关性血管炎炎症应答机制并不完全清楚,新近兴起的基于NCBI-基因表达综合(gene expression omnibus,GEO) 数据库等资源的生信分析方法为进一步探索ANCA相关性血管炎炎症应答机制提供了可能。该研究拟综合使用GEO数据库、DAVID 6.8在线平台对ANCA相关性血管炎差异表达基因进行筛选、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和基因本体(gene ontology,GO)富集分析以及识别这些差异基因编码的蛋白质之间的相互作用及通路关系,最终筛选出ANCA相关性血管炎炎症表达候选基因,并通过miRWalk和DIANA-LncBase 数据库预测并构建内源性竞争性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)调控网络,为进一步进行验证试验提供科学基础,为治疗ANCA相关性血管炎提供新的思路和靶点。

1 材料与方法

1.1 ANCA相关性血管炎微阵列数据集采集及下载从GEO数据库中下载ANCA相关性血管炎基因表达谱。筛选条件如下:① 关键词:ANCA相关性血管炎;② 条目类型:系列(series);③ 研究类型:表达谱分析;④ 属性:组织;⑤ 物种:人类;⑥ 肾脏组织定位:肾小球。

1.2 筛选差异表达基因利用R软件(版本: 4.0.2)进行数据的预处理。使用R软件的limma软件包进行差异表达基因的筛选。将P值小于0.05且logFC(差异倍数)的绝对值大于1 作为筛选差异表达基因的条件,当同时满足上述条件是认为差异基因的表达具有统计学意义。利用ggplot2软件包制作差异表达基因的火山图。利用pheatmap软件包(版本:1.0.12) 制作前50个差异表达基因的热图。

1.3 差异基因富集分析利用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在线平台对所有差异表达基因进行GO和京都基因与基因组百科全书通路(KEGG Pathway)富集分析。设置P<0.05。利用在线绘图工具(http://www.bioinformatics.com.cn)将富集分析结果进行可视化,结果分别以柱状图及气泡图展示。

1.4 炎症应答相关差异基因的PPI网络构建通过上述富集分析,鉴别出富集在炎症应答集群中的差异表达基因。利用STRING(http://string-db.org/)来识别这些差异基因编码的蛋白质之间的相互作用及通路关系,并利用作图软件Cytoscape将结果进行可视化(版本: 3.7.1)。

1.5 预测炎症应答相关基因微小RNA(microRNA,miRNA)使用在线数据库miRWalk 3.0预测富集在炎症应答集群中的差异表达基因的miRNA。筛选出同时在TargetScan和 miRDB 数据库中存在的miRNA,建立mRNA-miRNA相互作用网络,并利用作图软件Cytoscape将结果可视化(版本: 3.7.1)。

1.6 构建炎症相关基因ceRNA网络使用DIANA-LncBase v.2数据库筛选与上述miRNA相互关联的长非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)。筛选条件如下:① miRNA与LncRNA相互作用经过免疫沉淀法证实;② LncRNA富集在肾脏;③ 评分(pr.score)>0.9。在miRNA-mRNA和lncRNA-miRNA相互作用的基础上,建立了ceRNA调控网络,利用在线绘图工具(http://www.bioinformatics.com.cn)将结果进行可视化,结果以对冲图展示。

1.7 关键基因疗效评价通过上述PPI分析及ceRNA调控网络构建,筛选出富集在炎症应答集群中的关键差异表达基因CSF1R和TNFRSF1B。通过在线绘图工具(http://www.bioinformatics.com.cn)绘制关键基因的ROC曲线。ROC曲线采用敏感性、特异性和ROC曲线下面积(area under the curve, AUC)进行解释,以此来评估关键基因区分对照组和ANCA相关性血管炎患者的效能。

1.8 关键差异基因的验证经检索本院LIS系统及病理诊断系统,纳入2013年1月-2022年3月在西南医科大学附属医院就诊的患者,其中ANCA相关性血管炎15例,微小病变型肾病3例,IgA肾病15例,所有患者均按照肾活检诊断要求行HE、PAS、Masson染色及电镜诊断。在光镜下重新阅片,评估间质炎症细胞浸润程度,对照组为HE染色光镜下观察无明显炎症细胞浸润者纳入研究:微小病变性肾病3例,IgA肾病6例,实验组为15例ANCA相关性血管炎。以上病例均为初诊,取材时未行糖皮质激素及免疫抑制剂治疗。选择合适的切片进行免疫组织化学染色,烤片 1 h 后依次进行脱蜡、水化,使用 3%H2O2抑制内源性过氧化物酶,用枸橼酸钠缓冲液在微波炉中进行抗原修复,5%牛血清白蛋白(BSA)常温封闭 1 h,弃去封闭液后加入一抗稀释液,切片置于湿盒中放-4 ℃冰箱过夜。次日使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后继续予以二抗稀释液孵育,室温孵育30 min后用PBS清洗,加入二氨基联苯胺(DAB)显色,显微镜下观察效果,苏木精复染细胞核,脱水透明后中性树脂封片,通风处晾干于明场显微镜下观察拍摄。同时将ANCA组的平均光密度值(mean optical density,MOD)值与临床炎症指标(包括白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白)做Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 ANCA相关性血管炎差异基因的筛选结果基于上述筛选条件,收集并下载了数据集GSE108109。该数据集平台为GPL19983,其中包括6个对照组标本和15个ANCA相关性血管炎标本。通过R语言对数据集GSE108109进行标准化预处理(图1A)。利用R软件的limma软件包,总共得到差异表达基因(DEGs)846个,其中 444个基因表达明显上调,402个基因表达明显下调。火山图展示了差异基因的表达水平(图1B)。前10个差异显著的上调基因是FCER1G、CYBB、UCP2、LYZ、C1QC、FSCN1、ECM1、NCKAP1L、C3AR1。前10个差异显著的下调基因是GSTA2、ALB、AFM、GLYATL1、SLC12A3、CTP4A11、SLC16A12、ATP6V0D2、CALB1、EGF(图1C)。使用pheatmap软件包绘制了前50个差异表达基因的热图(图2),每一行代表一个独立的基因;每一列代表一个独立的样本。层次聚类分析表明,根据mRNA表达的不同模式可以将对照组和ANCA相关性血管炎患者进行区分。

图1 ANCA相关性血管炎差异表达基因

图2 ANCA相关血管炎前50个差异表达基因热图

2.2 差异基因富集分析利用DAVID在线分析工具对ANCA相关性血管炎数据集(GSE108109)中差异表达基因进行KEGG富集分析,其结果见图3A。KEGG分析显示差异表达基因主要富集在补体途径、抗坏血酸和藻酸盐代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢、蛋白质消化和吸收、细胞色素P450对异种物质的代谢、癌症中的蛋白聚糖、耶尔森菌感染、戊糖和葡萄糖醛酸转化、色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、破骨细胞分化、金黄色葡萄球菌感染、丁酸盐代谢、药物-细胞色素P450代谢、百日咳、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径等。同时,对所有差异表达基因的细胞组成、生物过程和分子功能进行了富集分析,结果见图3B,发现其主要富集于炎症反应、血管生成、细胞迁移的正调节、细胞形状调节、外源代谢过程、血红素结合、跨膜转运蛋白活性、蛋白质结合等。

图3 ANCA相关性血管炎差异表达基因富集分析

2.3 炎症应答相关差异基因的PPI网络构建通过GO富集分析,共得到37个富集在炎症应答生物学过程的差异表达基因。利用STRING(http://string-db.org/)构建炎症应答差异基因表达产物的PPI网络。去除孤立的节点,并利用Cytoscape软件可视化,结果如图4所示。该网络包含了34个关键基因,分别是CSF1R、HDAC5、SEMA7A、NRROS、CSF1、C5AR1、PTGER3、ITGB2、TNFRSF11B、FPR3、TNF、RELA、PIK3CG、KNG1、RELB、C3、PYCARD、CD97、C3AR1、CCR1、LYN、TGFB1、ANXA1、CD180、CYBB、FOS、TNFRSF1B、LYZ、HCK、BMP2、VNN1、AXL、NOX4、TLR7。这些差异表达基因可能是调控炎症反应及参与炎症应答的关键候选基因。

图4 炎症应答相关差异表达基因PPI相互作用网络

2.4 miRNA及ceRNA网络构建共有19个miRNA(如hsa-miR-22-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-92a-3p和hsa-miR-331-3p)、2个下调基因(PTGER3和FOS)、7个上调基因(TNFRSF1B、CSF1R、ADGRE5、HDAC5、CD180、AXL和SEMA7A) 在mRNA-miRNA相互作用网络中(图5)。通过DIANA-LncBase v.2数据库筛选并构建ceRNA调控网络,该网络包含12个miRNA(如hsa-miR-22-3p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-331-3p)、5个上调差异表达基因(ADGRE5、AXL、CSF1R、HDAC5和TNFRSF1B),同时包括了19个lncRNA(如KCNQ1OT1、XIST、NEAT1、CASC7和MALAT1等)。值得注意的是,这许多相互作用的调控轴中包括KCNQ1OT1-hsa-miR-125a-5p-TNFRSF1B (图6)。

图5 miRNA-mRNA预测网络图

图6 lncRNA-miRNA-基因调控对冲图

2.5 关键炎症应答基因的筛查及疗效评价用Cytoscape中的cytohubba插件筛选关键炎症应答基因。利用MCC算法筛选出富集在炎症应答集群中的关键差异表达基因,结果如表1所示。在PUBMED在线网站上搜索与ANCA相关性血管报道较少的基因作为新的候选炎症应答差异表达基因,最终筛选出CSF1R和TNFRSF1B这两个基因。通过在线绘图工具(http://www.bioinformatics.com.cn)绘制两个关键基因的ROC曲线,计算曲线下面积。两个差异基因CSF1R和TNFRSF1B的曲线下面积均大于0.9(图7)。说明这两个基因的表达模式可以将对照组和ANCA相关性血管炎患者区分开来。

表1 MCC方法筛选关键炎症应答差异表达基因

图7 CSF1R和TNFRSF1B的ROC曲线

2.6 关键差异表达基因的验证通过免疫组化染色检测关键炎症应答基因在ANCA相关性血管炎患者肾脏组织中的表达,与上述生物信息学分析结果一致,相比于对照组,CSF1R和TNFRSF1B 在ANCA相关性血管炎患者中均显著表达,见图 8A、8B。计算各组关键基因的平均光密度值,ANCA相关性血管炎组CSF1R平均光密度值为0.063 6±0.020 0,TNFRSF1B 平均光密度值为0.051 6±0.025 7,IgA肾病组CSF1R平均光密度值为0.037 9±0.006 3,TNFRSF1B 平均光密度值为0.024 5±0.005 5,微小病变组CSF1R平均光密度值为0.027 7±0.007 8,TNFRSF1B 平均光密度值为0.023 4±0.007 6,ANCA相关性血管炎组的两个关键基因的平均光密度值均较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见图8C。同时将ANCA组患者的MOD值与临床炎症指标(包括白细胞计数、中性粒细胞计数、C反应蛋白)做Pearson相关性分析,发现CSF1R组的表达量与中性粒细胞计数含量呈正相关(r=0.587,P<0.05),TNFRSF1B组的表达量和血清C反应蛋白含量呈正相关(r=0.646,P<0.05),见图9。

图8 对照组与ANCA组肾组织的 IHC 染色结果图 ×400

图9 ANCA组CSF1R、TNFRSF1B的MOD与炎症指标的相关性分析

3 讨论

ANCA相关性血管炎是一类由抗中性粒细胞胞质抗体介导的慢性自身免疫性疾病。近来研究证实ANCA可通过免疫系统过度激活、释放炎性细胞因子溶解酶等机制致病[2]。AAV的发生和多种免疫细胞相关,目前已经有针对B细胞、T细胞和补体[3-4]的新型药物,除此之外,针对中性粒细胞、单核-巨噬细胞及其相关衍生因子也是当下治疗的研究热点之一[5]。

本研究通过分析 GSE108109 芯片数据集,筛选出 846个差异表达基因,其中 444个基因表达上调,402个基因表达下调。在KEGG信号通路分析中,发现差异基因主要富集在补体和凝血级联反应、金黄色葡萄球菌感染、氨基酸代谢等信号通路。在GO生物功能分析中,发现许多参与炎症调控的重要差异表达基因,包括CSF1R、HDAC5、SEMA7A、NRROS、CSF1、C5AR1、PTGER3、ITGB2、TNFRSF11B、FPR3、TNF、RELA、PIK3CG、KNG1、RELB、C3、PYCARD、CD97、C3AR1、CCR1、LYN、TGFB1、ANXA1、CD180、CYBB、FOS、TNFRSF1B、 VNN1、AXL、NOX4、TLR7。因此本研究进一步构建了这些炎症调控相关差异基因的ceRNA调控互作网络,通过MCC算法筛选出富集在炎症应答集群中的关键差异表达基因CSF1R和TNFRSF1B,并发现了包括KCNQ1OT1-hsa-miR-125a-5p-TNFRSF1B在内的多条调控轴。同时在ANCA相关性血管炎患者肾脏组织上对两个关键基因的表达进行验证,其与生信分析结果一致,证实了CSF1R和TNFRSF1B在ANCA相关性血管炎患者肾脏中的表达较对照组均显著升高。

CSF1R是由CSF1R基因编码的一种细胞表面蛋白,通过与配体CSF1和IL-34结合,参与调节巨噬细胞稳态,在先天免疫和炎症中扮演重要角色。CSF1R最主要配体是CSF1,在肿瘤、炎症等病理状态下,机体CSF1的水平显著上升,募集巨噬细胞向炎症部位移动,控制组织的稳态和修复[6-7]。募集巨噬细胞后,局部的CSF1显著增多以促进巨噬细胞成熟[8]。Lenzo et al[9]认为在稳态条件下和某些炎症反应中,CSF1R信号在相对较晚的阶段控制巨噬细胞谱系的发展。越来越多的研究证实在ANCA相关性血管炎中存在众多与巨噬细胞极化相关的标志物。对AAV患者的体外和组织学研究显示,CD206和CD163的表达显著增加,这些标志物与选择性激活的巨噬细胞(M2)相关[10]。活化的巨噬细胞可能释放多种炎症细胞因子,包括IL-6、IL-8等[11-12],从而调节ANCA相关性血管炎的炎症反应。本研究中GO分析证实CSF1R富集在炎症调节生物作用中,同时ROC曲线证实CSF1R的差异表达可以将正常人和AAV患者进行区分。在后续的实验中观察到,在ANCA相关性血管炎肾活检标本中,CSF1R的表达量较对照组明显升高。因此推测CSF1/CSF1R通路很可能通过调控巨噬细胞产生的级联反应,从而促进炎症的发生,故运用CSF1R抑制剂可能成为ANCA相关性血管炎潜在的治疗策略。

TNFRSF1B是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的成员之一,又称肿瘤坏死因子受体2(TNFR2),是TNF-α的主要受体之一,参与组织再生的调控。由于TNF-α的促炎作用,抗TNF-α的药物被用于治疗炎症和自身免疫性疾病。然而,抗肿瘤坏死因子药物仍具有局限性,可能是因为其通过两种不同的TNF受体(TNFR1和TNFR2)实现多效性生物学功能。TNFR1主要介导TNF促凋亡和促炎功能,而TNFR2激活后募集TRAF2、cIAP1/cIAP2[13]、HOIP[14]形成TNFR2信号复合物(SC),有利于免疫调节和组织再生。TNFR2在体内外可促进调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的分化和功能,提示TNFR2是一个关键的免疫调节因子。因此,选择靶向TNFR2而不靶向TNF-α更为重要。研究表明TNF-TNFR2信号通路可抑制Th2和Th17的极化缓解气道过敏炎症[15],反之,TNF/TNFR2信号通路受损可增强Th2和Th17极化,加重过敏性气道炎症[16]。 许多T细胞和ANCA相关血管炎关系密切[17-18]。在活动性ANCA相关血管炎中,Th17相关的CCL20表达升高,而Th2相关的CCL22血浆趋化因子表达降低[19],这两种细胞因子均涉及免疫调节和炎症过程。结合本研究结果分析,TNFR2在ANCA相关性血管炎患者中表达显著升高,其相关通路信号激活,可能促进炎症的进展。因此,TNFR2抑制剂可能会改善ANCA相关性血管炎的炎症反应,成为 ANCA相关性血管炎治疗的新选择。

本研究还进一步构建了炎症相关基因ceRNA网络。其中值得注意的是KCNQ1OT1-hsa-miR-125a-5p-TNFRSF1B调控轴。lncRNA KCNQ1OT1具有调节炎症的作用,可通过miR-381-3p/ETS2轴调控ARDS小鼠的炎症反应[20],也可通过IκBa抑制内膜增生血管平滑肌细胞的炎症和增殖[21]。miR-125a-5p参与调节巨噬细胞的激活和炎症反应[22],通过miR-125a-5p/TRAF6/TAK1轴促进巨噬细胞M2极化,可改善脂多糖(LPS)诱导的炎症[23]。已有研究[24]证实过表达miR-125a-5p可抑制TNFRSF1B,促进破骨细胞分化。因此,根据ceRNA调控网络推测在ANCA相关性血管炎中,TNFRSF1B可能受到KCNQ1OT1-hsa-miR-125a-5p-TNFRSF1B轴的调节,这需要进一步研究证实。

综上所述,本研究通过生物信息学分析揭示了 ANCA相关性血管炎中炎症应答候选基因及可能的分子机制。筛选出CSF1R和TNFRSF1B这两个参与炎症调节的关键基因,并通过不同的数据库构建出严密的ceRNA调控网络,同时进一步证实了CSF1R和TNFRSF1B在ANCA相关性血管炎患者肾脏组织中表达明显升高。这些结果将有助于阐明ANCA相关性血管炎发生、发展的炎症相关分子机制,并为ANCA相关性血管炎的治疗提供全新的潜在的靶点。