lncSIL通过EZH2/P21/CDK6信号通路负向调控TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞间质转化

张万方,王 琳,潘鹏涛,李文昕,康瑞丽,朱子任,陈浩勤,方新宇,张星灿,张雨昕,姜依雯,李欣妍,袁本琪

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种慢性、间质性肺病,其平均生存时间只有2～4年,被称为“类肿瘤”[1]。研究[2-3]显示IPF的主要特征是肺泡上皮细胞变异,后期肺组织异常修复等病变。肺泡上皮细胞在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的刺激下会逐渐失去上皮细胞的特性,转化为具有间充质细胞表型和特性,这一进程被称为肺泡上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[4]。研究表明EMT与IPF发病具有重要的关系。

近年的研究[5-7]表明长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)在多种细胞进程中发挥重要的调控作用,如细胞迁移、侵袭、凋亡等。lncSIL(AK004418)是突触极蛋白2(SYNPO2)基因的第4个内含子,具有抑制肌肉细胞发育的作用[8],课题组前期研究结果表明lncSIL能够抑制肺泡上皮细胞的增殖和迁移[9],并且发现lncSIL在TGF-β1诱导的EMT进程中表达降低,过表达lncSIL能够抑制间质细胞标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ, Col Ⅰ)的表达,促进肺泡上皮细胞标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的表达[10]。为了更深入地分析lncSIL在TGF-β1诱导EMT进程中的作用及其相关信号通路,本研究通过分析沉默lncSIL后相关细胞标志蛋白的表达变化,进一步验证lncSIL的作用;并通过RNA pulldown检测lncSIL的靶蛋白,通过分析过表达或沉默lncSIL后其靶蛋白组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)及其下游基因P21和CDK6的表达变化,并结合细胞周期进程的变化情况探讨lncSIL在TGF-β1诱导EMT进程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞 A549细胞株购自上海生物科学研究所细胞库,使用DMEM/F12 (含10%小牛血清)的培养液,于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养,倒置显微镜观察细胞形态。

1.1.2主要试剂 LipofectaminTM3000 转染试剂盒、TRIzol RNA 提取试剂盒、streptavidin-coupled Dynabeads(美国Invitrogen公司),DMEM/F12培养基(美国 Thermofisher公司),小牛血清(批号:CA21,中国杭州四季青生物有限公司),引物由上海生工生物工程有限公司合成,siRNA序列由广州锐博生物技术有限公司化学合成,抗体Col Ⅰ、α-SMA、EZH2、E-cad、HRP 标记二抗(美国Abcam公司),抗体P21、GAPDH(美国Santa Cruz公司),抗体CDK6 (美国BOSTER公司)。

1.1.3主要仪器 细胞培养箱(HERAcell 150 i)、核酸蛋白分析仪(Nano Drop 2000)购自美国 Thermo 公司,微孔板化学发光仪(LB960 Centro)购自德国 Berthold公司,荧光定量 PCR 仪(Light Cycler 480 II)购自瑞士 Roche公司,高速冷冻离心机(Allegra X-30R)购自美国 Beckman公司,垂直电泳仪(Power Pac HC)购自美国 Bio-Rad公司。

1.2 细胞转染将lncSIL克隆到pCMV-SPORT6载体获得重组质粒,使用Lipo3000转染试剂盒将其转染到肺泡上皮细胞A549细胞中,同时设立空载体阴性对照,转染4～6 h后加入诱导剂TGF-β1(5 μmol/L),24、48 h后收集细胞。设计并合成lncSIL 的SiRNA (CAATTGTAATAGTCAATAA)。转染后加入诱导剂TGF-β1(5 μmol/L),24、48 h后收集细胞。

1.3 实时荧光定量PCR(real time-PCR,RT-PCR)使用TRIzol试剂盒提取各组分细胞的总RNA,根据逆转录试剂盒说明书的步骤要求合成cDNA,使用荧光定量PCR试剂盒SYBR green-based PCR Master Mix对目的基因进行定量分析。按照说明书步骤进行操作,采用两步法,每组设置3个复孔,样品重复检测3次。以GADPH为内参,根据公式2-ΔΔCT进行定量分析。

1.4 Western blot使用细胞裂解缓冲液裂解细胞样品获得细胞的总蛋白,使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。100 ℃变性10 min后经过12% SDS-PAGE电泳分离,然后转移到PVDF膜上,用5%脱脂奶粉的封闭液于室温封闭1～2 h,随后加入一抗( Col Ⅰ:1 ∶1 000,α-SMA:1 ∶1 000,EZH2:1 ∶1 000,P21:1 ∶500 ,E-cad:1 ∶1 000,CDK6:1 ∶500,GAPDH:1 ∶5 000)4 ℃封闭过夜,次日加入对应的二抗室温封闭30 min,最后经ECL显色后分析结果。

1.5 RNA pulldown生物素标记lncSIL与提取的细胞的总蛋白在室温下作用1 h,然后加入链霉亲和素偶联的磁珠(streptavidin-coupled Dynabeads)室温孵育1 h,使用洗脱液洗涤,最后对上样液(input)、洗脱液(lncSIL)和磁珠(beads)进行Western blot鉴定。

1.6 统计学处理使用SPSS19.0软件对实验所有数据进行统计分析,组间差异比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默lncSIL对TGF-β1诱导EMT进程的影响在TGF-β1诱导EMT的进程中,沉默lncSIL后,E-cad表达下调,α-SMA和Col I表达上调(图1A);在未进行TGF-β1诱导的对照组细胞中,沉默lncSIL后3种标志蛋白的表达变化与诱导组一致(图1B)。说明lncSIL具有抑制EMT的作用。

图1 沉默或过表达lncSIL后细胞中标志蛋白表达的变化

2.2 lncSIL对靶蛋白EZH2表达的影响为进一步验证EZH2是否为lncSIL的蛋白伴侣,使用lncSIL为探针,进行RNA pulldown实验,并通过Western blot证明EZH2是lncSIL的结合蛋白(图2A)。在此基础上,通过Western blot检测了在TGF-β1诱导EMT进程中沉默或过表达lncSIL后EZH2蛋白的表达变化。结果显示:TGF-β1诱导组(NC+TGF)中EZH2的表达量与对照组(NC)相比明显升高;当直接沉默lncSIL后,沉默组(Si-SIL)与对照组(NC)相比,EZH2蛋白的表达量也明显升高,并且沉默组(Si-SIL)与TGF-β1诱导组(NC+TGF)相比EZH2的表达水平相似;当TGF-β1诱导的同时沉默lncSIL后,TGF-β1诱导+沉默组(Si-SIL+TGF)与TGF-β1诱导组(NC+TGF)相比EZH2的表达量显著升高(图2B)。说明TGF-β1诱导能够促进EZH2蛋白的表达,沉默lncSIL表达也能够促进EZH2的表达,并且沉默lncSIL与TGF-β1诱导同时进行具有加成作用。

图2 沉默或过表达lncSIL对EZH2蛋白表达的影响

当直接过表达lncSIL时,过表达组(lncSIL)与对照组(NC)相比EZH2的表达量明显降低;当TGF-β1诱导的同时过表达lncSIL时,TGF-β1诱导+过表达组(lncSIL+TGF)与TGF-β1诱导组(NC+TGF)相比EZH2的表达量明显降低;过表达组(lncSIL)与TGF-β1诱导+过表达组(lncSIL+TGF)相比EZH2的表达量再次显著降低(图2C)。说明过表达lncSIL抑制EZH2的表达,并且lncSIL的抑制作用能够抵消一部分TGF-β1的诱导作用。RT-PCR的结果显示EZH2 mRNA表达变化与上述结果一致(图2D)。

2.3 lncSIL对EZH2/p21/CDK6信号通路相关蛋白表达的影响对EZH2调控的下游相关基因细胞周期抑制蛋白P21和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK6在沉默或过表达lncSIL后的表达分析结果显示,沉默lncSIL后,EZH2和CDK6表达升高,P21表达降低(图3A);过表达lncSIL时,EZH2和CDK6表达降低,P21表达升高(图3B)。以上结果说明,lncSIL主要通过抑制EZH2蛋白表达,促使P21基因表达升高,进一步抑制CDK6的表达,导致细胞周期进程受到抑制,最终抑制TGF-β1诱导的EMT进程。

图3 沉默或过表达lncSIL对EZH2/p21/CDK6信号通路相关蛋白表达的影响

2.4 lncSIL对细胞周期进程的作用使用流式细胞术对TGF-β1诱导EMT进程中沉默或过表达lncSIL后的细胞周期进程分析结果显示,过表达lncSIL时,与对照组(NC+TGF)相比,lncSIL+TGF组S期细胞数量明显降低,G1/G0期细胞数量明显升高(图4A);沉默lncSIL后,与对照组(NC+TGF)相比,Si-SIL+TGF组S期细胞数量明显升高,G1/G0期细胞数量明显降低(图4B)。结果说明lncSIL通过抑制细胞进入S期进一步抑制细胞周期进程。

图4 沉默或过表达lncSIL对细胞周期进程的影响

3 讨论

近年来lncRNA在肺纤维化进程中的作用不断被揭示出来,例如,lncRNAs uc.77和2700086A05Rik通过上调Zeb2 和Hoxa3基因的表达诱导EMT,最终导致肺纤维化[11];LncRNA MALAT1通过PI3K/AKT/mTOR/Snail途径抑制EMT进一步影响肺纤维化等[12]。根据前期研究[9-10]结果,本研究首先通过在TGF-β1诱导的EMT进程中沉默lncSIL后,检测细胞标志蛋白表达变化,结合前期实验结果进一步证明了lncSIL具有抑制TGF-β1诱导EMT进程的作用。为了深入探讨lncSIL的分子机制,本研究通过RNA pulldown验证了EZH2为lncSIL的相互作用蛋白,并发现lncSIL负向调控EZH2表达。EZH2是组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶,为多梳蛋白复合体2(polycomb repressive complex 2, PRC2)的核心成分,具有H3K27me3的能力,当其被招募到靶基因的启动子上时,通过甲基转移酶的作用,使下游靶基因通过甲基化而实现表观沉默[13]。P21是一种重要的细胞周期蛋白的抑制基因,其作用是通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶CDK6的表达[14],进一步抑制细胞周期进程。本研究结果显示lncSIL抑制EZH2的表达,促进P21的表达,说明lncSIL阻止了EZH2被招募到P21的启动子上,导致P21逃过了表观遗传沉默。P21通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶CDK6引起细胞周期由G1期向S期的转变受阻,细胞无法进入S期。综合以上结果推测:lncSIL抑制TGF-β1诱导的EMT进程中的分子机制是通过负向调控EZH2/P21/CDK6通路,抑制细胞周期进程,从而抑制肺泡上皮细胞向间质细胞转化。本研究结果将对特发性肺纤维化发生机制的探究以及寻找诊断和治疗特发性肺纤维化的靶点具有重要意义。