基于网络药理学六君子汤治疗胃轻瘫的机制研究

彭美萍，郭思彤，蓝 颖，刘晓霞，谭思涛

（广西医学科学院·广西壮族自治区人民医院，广西 南宁 530021）

传统中药汤剂六君子汤源于《世医得效方》，有益气健脾、燥湿化痰之功效，主要用于脾胃不和、食欲不振，或反胃腹痛腹泻、脾胃消化功能下降，即现代西医理论中所说的慢性胃炎、胃溃疡、胃轻瘫等胃肠道疾病。近年来，也有很多高质量的多中心、双盲、随机试验证实了六君子汤有助于恢复脾胃功能，减轻消化不良症状，改善胃排空情况[1]。 但是关于六君子汤发挥疗效的关键靶点与分子机制鲜有报道。与研究化学药的药理特征以单一成分对应单一靶点相比，中药具有多组分、多靶标和多途径协同作用的特点。如何阐释清楚其物质基础及作用原理一直是中药研究的一大难题，网络药理学可为中药复方作用机制研究提供崭新的思路与手段，这有助于揭示中药复方的科学内涵、发掘复杂中药的有效成分、预测作用靶点和新的适应证，为提升中医药创新研究和大数据挖掘提供理论支撑[2]。为此，本研究采用网络药理学方法，从六君子汤的物质基础出发，着眼于整体角度分析六君子汤治疗胃轻瘫的分子机制。

1 材料与方法

1.1 六君子汤相关靶点筛选

利用中医药系统药理学平台（TCMSP 数据库）[3]查找人参、半夏、白术、陈皮、茯苓、甘草六味中药的化学组成成分，根据口服利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18 这两项药代动力学参数对活性化合物及其作用的蛋白质靶点进行初筛，结合化学专业数据库[4],使用SwissADME（https://www.swissadme.ch）工具预测化合物的ADME（吸收、分布、代谢、排泄）性质并进行筛选，补充有效成分及其靶点，并参考相关文献报道补充未预测到的活性化合物的已知靶点。汇总并删除重复的靶点信息后，将化合物作用的蛋白质靶点全部在Uniprot 蛋白质数据库（https://www.uniprot.org）进行规范。转化为标准的蛋白靶点编号。

1.2 胃轻瘫相关靶点筛选

以“Gastroparesis， Dysmotility，Esophageal Dysmotility，Gastric stasis，Gastrointestinal ulceration，Gastrointestinal Dysfunction，digestive disturbance” 作 为关键词，收集OMIM 数据库（https://www.omim.org）胃轻瘫的潜在靶点信息。在DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org）中，选取与“Gastroparesis”联系密切的相关疾病“Cyclical vomiting syndrome （disorder），Abnormality of the stomach，Abnormality of the gastric mucosa，Gastric ulcer，Functional Gastrointestinal Disorders”。根据查询结果进行筛选，保留相关度较高的目标靶点作为胃轻瘫的潜在靶点，合并两个疾病数据库靶点后，删除重复值得到该疾病靶点。

1.3 六君子汤成分-胃轻瘫靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

为明晰六君子汤药物相关靶点与胃轻瘫靶点间的关联，利用Excel 提取二者有交集的靶点并通过韦恩图的方式来表达。用交集靶点通过STRING11.0 数据库（https://string-db.org）构建PPI 网络模型[5]，将生物种类设定为“Homosapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence ”（大于0.9），除此之外均为默认值，得到PPI网络模型，通过CytoScape3.7.1 中的hubba 插件对PPI 网络进行分析排序发现最佳的前20 个靶点，得到潜在的关键靶点基因，并通过分析其参与的生物学进程对其功能进行描述。

1.4 六君子汤成分-胃轻瘫靶点功能与通路的富集分析

Metascape 平台（https://metascape.org/gp/index.html）对基因拥有强大的分析功能，其覆盖面也相当广泛，整合了GO、KEGG、UniProt 和DrugBank 等多个权威的数据资源，可靠性强，通过该平台可以对提交数据进行通路富集和生物过程注释[6,7]。将六君子汤调节治疗胃轻瘫的靶点提交到Metascape 平台进行数据分析，P值设置为小于0.01，除此之外均为默认值，分析其主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析。

2 结果

2.1 六君子汤活性成分靶点的获取

初步提取的中药化学成分结果如下：人参190 种、半夏116 种、白术55 种、陈皮63 种、茯苓34 种、甘草280 种，经药物ADME 筛选后共获得白术7 种活性成分，陈皮5 种活性成分，茯苓15 种活性成分，甘草92 种活性成分，继续筛选删除无对应靶点成分。各成分初步提取的作用靶点结果如下：人参116 个、半夏97 个、陈皮66 个、茯苓23 个、甘草230 个，合并除去相同的数值后共得到靶点267个。六君子汤成分-靶点网络图的构建，核心靶点的提取，主要产生药效的活性成分的提取都可以通过CytoScape3.7.1 中的“NetworkAnalyzer”分析有效成分及靶点的网络拓扑参数得到并将结果可视化，见表1 与图1。

图1 六君子汤成分-靶点网络图

表1 六君子汤有效成分筛选结果

2.2 胃轻瘫相关靶点的获取

由OMIM 及DisGeNET 数据库根据疾病相关性进行筛选，分别获得胃轻瘫靶点1989、328 个。结合DRUGBANK 数据库补充相关靶点，合并去除相同的数值，最终得到1902 个胃轻瘫相关靶点。

2.3 六君子汤成分-胃轻瘫靶点PPI 网络的构建

将筛选的六君子汤活性成分靶点与胃轻瘫靶点取交集，绘制韦恩图，得到六君子汤成分-胃轻瘫共同靶点68 个，见图2。六君子汤靶点PPI 网络可以通过STRING11.0 平台构建，见图3。通过CytoScape3.7.1 中的hubba 插件对PPI 网络进一步分析得到潜在的关键靶点基因，见图4。分析得出AKT1 在网络中的连接度、节点介度 、紧密度分别为51、0.0552、0.7791，推测AKT1 为六君子汤治疗胃轻瘫的最主要靶点。TNF、

图2 六君子汤成分-胃轻瘫靶点韦恩图

图3 六君子汤-胃轻瘫靶点PPI 网络

图4 六君子汤-胃轻瘫靶点PPI 网络中的Module

IL-6、IL-1β、VEGFA、MAPK3、PPARG、PTGS2、CASP3、MMP9 亦为相对重要的靶点。

由于PPI 网络中蛋白与蛋白之间的关系是相互作用的，因此可视化结果多以无向图表示。PPI 复杂网络中存在部分连线密度较高的模块，其内部网络是PPI 网络的核心子网，是潜在的具有生物学意义的集合[8]。因此，为更精确地分析六君子汤治疗胃轻瘫的作用机制，在得到六君子汤PPI 网络后，要应用Metascape 数据平台中的MCODE 分析功能，通过分子复合物检测算法对相互作用关系进行分析聚类（见图4）。分别保留PPI 网络与聚类模块中排名前三的生物学进程对其进行功能描述，见表2。

表2 聚类模块评分前3

2.4 靶点功能与通路的富集分析

把六君子汤治疗胃轻瘫相关靶点通过Metascape 数据平台进行信号通路分析，并对结果可视化，见图5。由结果可见六君子汤主要参与的生物学过程（GO BP）包括对脂多糖的应答、对细胞迁移的正调控、对无机物质的反应、对损伤的应答、凋亡信号通路。参与的通路（KEGG）主要有糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、VEGF 信号通路、TNF 信号通路、麻疹等。相关靶点治疗胃轻瘫的功能（GO MF）主要富集于细胞因子活性、血红素结合、蛋白质同源二聚化活性、蛋白酶结合、磷酸酶结合等，以及细胞组分（GO CC）的富集，见图6。

图5 靶点-通路网络

图6 六君子汤主要成分潜在靶点的富集分析

3 讨论

在对六君子汤治疗胃轻瘫作用机制的网络药理学研究中对“成分-成分靶点网络”“胃轻瘫相关蛋白相互作用网络”“成分-胃轻瘫靶点蛋白相互作用网络”进行综合分析得到，六君子汤治疗胃轻瘫的10 个潜在核心靶点AKT1、TNF、IL-6、IL-1β、VEGFA、MAPK3、PPARG、PTGS2、CASP3、MMP9。

AKT1 即蛋白激酶B，可通过一系列下游底物的丝氨酸或苏氨酸磷酸化的介导参与调控细胞的代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等各种进程。AKT 调控的通路是人类癌症中最常见的激活信号通路。一半以上的人类肿瘤含有过度活化的AKT[9-10]。VEGFA 即血管内皮生长因子A，是调节脂肪组织中血管生成的关键因子。VEGFA 可诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞凋亡，诱导血管通透性的改变[11]，也会造成血管系统功能紊乱，生成高密度和高通透性的微血管促进肿瘤扩张。肿瘤组织血管生成主要依赖于VEGFA 的应答。

KEGG 通路富集分析显示，六君子汤治疗胃轻瘫所调控的核心靶点主要参与AGE-RAGE 信号通路、VEGF信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化。GO 富集分析显示，六君子汤所调控的核心靶点显著富集对脂多糖的应答、对细胞迁移的正调控、对无机物的应答等生物过程。通过对关键通路及靶点的综合分析，发现PI3KAKT 通路作为子网络在上述多个关键通路中都有很高的参与度，该途径是AKT 激活的关键节点。PI3K-AKT 信号通路被不同种类的细胞刺激或遭遇毒性损伤而激活，参与调节细胞促进生长和分裂，创建代谢反应、辅助繁殖等基本功能[12]。当酪氨酸激酶（RTK）或G 蛋白偶联受体（GPCR）与生长因子结合，会分别激活PI3K 的两个异源二聚体，催化细胞膜上PIP2 转化为PIP3，生成物PIP3 又成为下游通路的第二信使帮助激活AKT，进而通过磷酸化下游底物参与凋亡、蛋白质合成、代谢和细胞周期来控制关键的细胞过程[13]。而且该通路为关键通路AGE-RAGE 信号通路的下游，通过PI3K-AKT 通路调节NF-κB 的表达可以对TNF、IL-6、IL-1β 等炎症因子产生双向调节的作用。

通过复杂网络分析药理特性的研究对于准确识别中药成分的复杂机制具有重要意义。KEGG 通路富集分析表明靶点PTGS2 参与如花生四烯酸、TNF、NF-κB 和VEGF信号通路等炎症途径。PTGS2作为一种炎症介质，是一种限速酶，可催化花生四烯酸产生前列腺素，发挥促炎症作用并破坏内环境稳态，从而促进白细胞分泌并加重炎症反应[14]。许多炎症性疾病的发病机制与花生四烯酸代谢途径相关。PTGS2 是前列腺素的诱导酶，不仅参与炎症反应前列腺素的生物合成，而且是该途径的关键酶，这可以作为后续验证PTGS2 作为关键蛋白的有力基础。

研究结果表明六君子汤作为一个复方中药制剂含有多种有效成分可以通过多个靶点干预疾病的进程，而同一靶点可在不同的生物学过程及信号通路发挥作用，体现了六君子汤多通路、多靶点联合作用的复杂性。本文借助网络药理思维，构建六君子汤的“组分-靶点-疾病途径”关联网络并预测其潜在的作用机制。使六君子汤治疗胃轻瘫更好地应用于临床，为后续评价六君子汤临床疗效指标的挖掘提供了重要线索，也为深入研究六君子汤可能存在的作用机制提供了新的思路和技术手段。但由于网络药理学方法仅仅是单纯的数据分析，有自身的局限性，加上中药复方制剂成分较多，在熬制时可能会产生复杂的化学反应，所以熬制后六君子汤的化学成分变化以及活性成分在体内的代谢物并不在本次研究分析范围内。本研究主要利用数据库提取数据分析，结合生物信息学，对六君子汤做了初步的功能和调控作用的注释和预测，后续将在此数据挖掘的基础上进一步对六君子汤的有效活性成分进行更深入的筛选与通过动物实验进行验证，从而进一步明晰六君子汤的主要调控靶点。