EBV相关肿瘤和健康人群BALF2基因序列分析

于彩霞 赵梦鹤 肖华 王云 刘雯

［收稿日期］2022-12-24;  ［修订日期］2023-06-11

［基金项目］山东省自然科学基金资助项目（ZR2020MH302）

［第一作者］于彩霞（1996-），女，硕士研究生。

［通信作者］刘雯（1985-），女，博士，讲师。E-mail：liu.wen@hotmail.com。

［摘要］  目的

探讨BALF2基因的多态性及其分布特征与EB病毒（EBV）相关肿瘤发生发展的关系。

方法

采用巢式PCR结合DNA测序的方法，对349例EBV阳性标本进行DNA序列分析，利用Lasergene软件将其与EBV标准株B95-8序列进行比对，并生成系统发生树，对基因变异型进行分类。

结果  根据系统发生树将BALF2分为5个基因型BALF2-A、BALF2-B、BALF2-C、BALF2-D和BALF2-E。其中，BALF2-E在鼻咽癌中的检出率高于健康人群，中国南方鼻咽癌人群BALF2-E的检出率高于北方鼻咽癌人群（χ2=10.26，P<0.01）。

结论

BALF2基因存在多态性，其变异类型分布与肿瘤类型、地域有关，BALF2-E亚型与鼻咽癌发生相关。

［关键词］  疱疹病毒4型，人；多态性，单核苷酸；淋巴瘤；胃肿瘤；鼻咽癌

［中图分类号］  R373.9;R394.25

［文献标志码］  A

［文章编号］  2096-5532（2024）01-0067-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.027

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］  https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240326.1140.002;2024-03-28  17：25：55

Sequence analysis of BALF2 gene in people with EBV-associated tumors and healthy people

＼ YU Caixia， ZHAO Menghe， XIAO Hua， WANG Yun， LIU Wen

＼ （Department of Pathogenic Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the polymorphism of the BALF2 gene and its distribution characteristics and its relationship with the development and progression of Epstein-Barr virus （EBV）-associated tumors.

＼ Methods＼ DNA sequence analysis was performed on 349 EBV-positive specimens using nested PCR and DNA sequencing. Lasergene software was used for sequence alignment of them with the standard EBV strain B95-8 to derive a phylogenetic tree for classification of gene variants.

＼ Results

According to the phylogenetic tree， there were five BALF2 genotypes： BALF2-A， BALF2-B， BALF2-C， BALF2-D， and BALF2-E. The detection rate of BALF2-E was higher in people with nasopharyngeal carcinoma than in healthy people， and higher in southern people with nasopharyngeal carcinoma than in northern people with this disease in China （χ2=10.26，P<0.01）.

＼ Conclusion＼ The BALF2 gene is polymorphic， and the distribution of its variants is associated with tumor types and geographic regions. The BALF2-E variant is related to the development of nasopharyngeal carcinoma， especially in the high-incidence areas.

［Key words］＼ herpesvirus 4， human; polymorphism， single nucleotide; lymphoma; stomach neoplasms; nasopharyngeal carcinoma

EB病毒（EBV）屬于疱疹病毒科（γ疱疹病毒亚科），广泛分布于世界各地，世界上超过90%的人口是EBV携带者［1］。EBV感染与上皮恶性肿瘤密切相关，这些肿瘤包括鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻部NK/T细胞淋巴瘤［2-6］。感染早期基因BALF2在病毒DNA复制过程中高度集中于复制小体，并在裂解复制过程中大量地表达［7］。当DNAase在病毒体内与BALF2编码的分子量135 000大小DNA结合蛋白（mDBP）结合时，核酸外切酶的活性受到抑制，这可能是病毒DNA合成过程中保护DNA免受病毒DNA酶攻击的病毒自我保护机制［8］。mDBP在不同的疱疹病毒株中具有结构保守性，并且对于已知疱疹病毒例如EBV的裂解复制是绝对必需的［9］。鼻咽癌的发病率呈现明显的区域性［10］，原因尚不清楚。研究表明，不同来源的EBV毒株具有不同的基因变异，这可能在EBV感染和致病过程中起重要作用。以往对EBV潜伏期基因多态性的研究表明，病毒基因变异具有疾病特异性，如EBER变异体EB-8M在鼻咽癌中起主导作用，且其地理分布存在差异［11］。近期有研究发现，BALF2基因单核苷酸多态位点a162476g和g163364a与鼻咽癌风险高度相关［12］。为进一步研究BZLF2单核苷酸多态性（SNP）与EBV相关肿瘤发生的关系，本研究对359例中国南、北方地区的EBV相关性胃癌（EBVaGC）、淋巴瘤、鼻咽癌以及健康人群咽漱液（TW）样本进行了EBV BALF2基因的序列分析。

1  材料与方法

1.1  样本和DNA提取

本研究共有349例EBV陽性标本BALF2基因测序成功，其中50例EBVaGC、77例鼻咽癌、55例淋巴瘤以及47例健康人群TW样本来自青岛大学附属医院；另一部分样本包括EBVaGC 4例、鼻咽癌50例、淋巴瘤20例以及46例健康人群TW样本来自中国南方鼻咽癌流行区，主要由广东省中山大学第一、第三附属医院提供。根据样本的区域来源和肿瘤类型对标本进行分组并命名：北部EBV相关胃癌（NG），北部淋巴瘤（NL），北部鼻咽癌（NN），北部健康人群TW样本（NT）；南部EBV相关胃癌（SG），南部淋巴瘤（SL），南部鼻咽癌（SN），南部健康人群TW样本（ST）。本研究经青岛大学医学院医学伦理委员会批准，所有参与者均知情同意。本研究中EBV阳性相关肿瘤标本均经EBV编码的小RNA 1（EBER-1）原位杂交鉴定，肿瘤细胞中出现EBER-1阳性信号为EBV阳性样本［13］。

采用传统的苯酚-氯仿方法和蛋白酶K消化方法从新鲜肿瘤组织（胃癌组织）和TW样品中提取DNA。使用QIAamp DNA FFPE组织提取试剂盒（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）从石蜡包埋肿瘤组织（鼻咽癌和淋巴瘤组织）中提取DNA。将提取的DNA -20 ℃保存直至实验完成。

1.2  聚合酶链式反应（PCR）扩增

采用巢式PCR法扩增BALF2的特定区域，该区域由两部分组成：第一部分是核苷酸162145-162562，用于扩增的引物是BALF2-1～BALF2-8；第二部分是核苷酸163111-163508，用于扩增的引物是BALF2-5～BALF2-4。引物及其序列见表1。第一次PCR的总体积为10 μL，其中包括：DNA提取物2 μL（100 μg/L），上游引物和下游引物各0.5 μL，1×Accurate Taq Master Mix（Accurate Biotechnology，AG11019）5 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、 55 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，循环35次；最后72 ℃延伸2 min。取第一次扩增产物2 μL为模板，进行第二次PCR，总体积为20 μL，其中包括：DNA提取物2 μL（100 mg/L），上游引物和下游引物各1 μL，1×Accurate Taq Master Mix（Accurate Biotechnology，AG11019）10 μL。第二次扩增条件与第一次扩增条件相同。每次PCR均设置EBV阳性细胞B95-8为阳性对照，EBV阴性细胞Jurkat为阴性对照，以及空白对照。取PCR扩增产物3 μL进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果。经过两轮PCR扩增，最终产物大小分别为418 bp和398 bp。使用Lasergene软件将其剪接成816 bp的片段。

1.3  PCR产物的序列分析

取上述PCR产物25 μL送往北京华大基因生物工程技术服务有限公司进行全长测序。获得序列信息后，用Chromas软件查看峰图，Lasergene软件中的Clastal W对基因序列与EBV标准株B95-8序列进行对比分析，并绘制系统发生树［14］，对基因变异型进行分类。

1.4  统计学分析

使用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，数据间比较应用χ2检验和Fisher精确检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结  果

2.1  BALF2基因序列变异分析

对349例EBV阳性样本进行BALF2测序及多态性分析显示，所有标本的测序峰图中同一核苷酸位点均未发现双峰，均为单一BALF2序列。与B95-8参考序列相比较，在349例样本中鉴定出43个代表性核苷酸序列（图1）。根据系统发生树，将其分为5种亚型BALF2-A、BALF2-B、BALF2-C、BALF2-D和BALF2-E。见图2。

本文33例样本的核苷酸序列与标准株B95-8的核苷酸序列一致，其中包括2例NT、26例ST、4例SN和1例SL。ST4中发现一个氨基酸突变（S647R），SN35中发现一个同义突变（g162246a）。96例样本（18例NT、25例NG、28例NN、19例NL、3例ST、2例SN、1例SL）中只有一个同义突变（g162273a）。以上这些与B95-8标准株具有相同BALF2氨基酸序列或者散在突变的分离株被称为BALF2-A。

本文97例样本中同时有4个共有同义突变c163293t、t163377c、a163458g、a163482c，包括18例NT、20例NG、12例NN、20例NL、7例ST、1例SG、5例SN以及14例SL，上述分离株被归类为BALF2-B。

本文在7例样本中同时发现了两个同义突变a163458g、a163482c，其中5例鼻咽癌存在一个共有同义突变c163464t，其中1例来自中国南方，4例来自中国北方。这7个样本被认为是BALF2-C型。

另外，在18例样本中发现了11个散在无规律突变，包括g162215t、g162237c、c162464t、a162476g、g162507a、c163287t、c163293t、g163364a、t163377c、g163404t、c163464t，其中的3个突变位点g162215t、a162476g以及g163364a具有氨基酸的改变，包括V317M，I613V和V700L，其余突变位点是同义突变。这18个样本序列被命名为BALF2-D。

在89例标本中检测到同时存在的3个同义突变t163377c、a163458g、a163482c，NT 3例、NG 2例、NN 30例、NL 9例、ST 5例、SG 3例、SN 34例、SL 3例。其中78例样本存在另外3个同义突变c163287t、g163404t、c163422a，根据系统发生树，将它们统一分类到同一簇中并将其称为BALF2-E。

2.2  中国南方和北方样本中BALF2变异型分布

不同地区EBVaGC病人、鼻咽癌病人、淋巴瘤病人和TW中5种不同BALF2基因型的频率见表2。NG、NN、NL和NT中BALF2-E的频率分别为4.00%、38.96%、16.36%和6.38%，SG、SN、SL和ST中BALF2-E的频率分别为75.00%、68.00%、15.00%和10.87%，SN病人的BALF2-E检出率高于NN病人（χ2=10.26，P<0.01）。

BALF2-A在NN和NL中的频率分别为37.66%

和40.00%，在SN和SL中的频率分别为14.00%和10.00%。NN组BALF2-A的检出率高于SN组（χ2=8.357，P<0.01），NL组高于SL组（χ2=6.066，P<0.05）。NT和SL病人的BALF2-B检出率明显高于ST和NL病人，差异有统计学意义（χ2=6.301、6.696，P<0.01），提示淋巴瘤和健康人

群中BALF2-B检出在北方和南方地区有显著差异。

2.3  BALF2在恶性肿瘤和健康人群中的变异型分布比较

BALF2基因型在中国南北部地区EBVaGC、鼻咽癌、淋巴瘤和健康对照中的分布比较显示，NN与健康对照中BALF2-E分布差异有显著性（χ2=15.860，P<0.001），而淋巴瘤、EBVaGC与健康人群中BALF2-E的分布差异无显著性（P＞0.05），来自南方的样本显示出相同的变异模式。对淋巴瘤、EBVaGC、鼻咽癌和健康人群进行统计学分析发现，在我国南方健康人群BALF2-A的检出率高于淋巴瘤、鼻咽癌（χ2=17.016、26.533，P<0.01）。中国北方地区健康人群BALF2-B检出率明显高于鼻咽癌（χ2=26.533，P<0.01）。南方地区健康对照组BALF2-B的检出率低于淋巴瘤（χ2=19.283，P<0.01）。在中国北方，鼻咽癌BALF2-C检出率高于EBVaGC（χ2=15.860，P<0.01）。见表2。

3  讨  论

对于BALF2基因，以往文献显示其a162476g

和c163464t位点突变见于80.00%以上的鼻咽癌样本［12］。本实验对淋巴瘤和EBVaGC分析结果未发

现a162476g和g163364a突变与其发生发展有关。

此外，本研究还发现了V341I、V344I和Y619N氨基酸变异，但变异只存在于少数样本中。3个多态性位点g162273a、a163458g和a163482c均未在既往研究中发现。在193例样本中检测到a163458g和a163482c的联合突变，这两个同义突变同时存在于BALF2-B、BALF2-C和BALF2-E中。因此，推测BALF2蛋白的第277位和第285位氨基酸可能具有一定的相关性。还需要进一步研究。

有研究表明，EBV编码的LMP1基因变异与EBVaGC、淋巴瘤和鼻咽癌的发生有关。然而，也有研究发现鼻咽癌病人与正常人群中EBV编码的LMP1基因检出率差异无统计学意义，但存在区域相关性。因此，EBV编码基因变异是仅存在区域差异还是参与EBV相关肿瘤的发生仍存在争议。本研究结果显示，BALF2的基因型在中国南北部地区的分布是不同的，南方地区鼻咽癌BALF2-E检出率高于北方地区；在中国南方样本中，EBV相关肿瘤和健康对照组的BALF2基因型差异也有显著性；SN病人BALF2-E检出率显著高于健康对照。推测BALF2-E可能是鼻咽癌的危险因素，尤其与南方鼻咽癌相关。本文由于南方EBVaGC样本数量较少，为了保证实验结果的准确性，没有对其进一步分析，这是本实验的一个缺陷。然而，本研究结果仍可为BALF2基因多态性的区域性分布提供一些實验依据。

鼻咽癌等EBV相关肿瘤的发生与EBV感染密切相关，但华南地区鼻咽癌的发病率明显高于华北地区，这可能受到环境等多种因素的影响［15］。本文研究结果显示，中国NN中BALF2-E基因型检出率显著高于健康对照组，南方地区鼻咽癌病人中该基因型的检出率也显著高于北方地区鼻咽癌病人。因此，BALF2基因型分布特征可能与环境、饮食因素一起导致南方地区鼻咽癌的高发病率。然而，由于本研究仅限于BALF2基因多态性分析，需要进一步研究其生物学功能和相关信号通路，以阐明BALF2基因在鼻咽癌发生发展中的作用。

综上所述，BALF2在我国南北方EBV阳性肿瘤样本和EBV阳性TW样本中分为5种基因型，BALF2基因多态性分布具有地区特异性。南北方地区鼻咽癌组织中BALF2-E的检出率明显高于健康对照组，这可能与EBV相关肿瘤的发生有关。

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（本文編辑  黄建乡）