Treacher Collins综合征1例基因突变分析

王小雨 沈露 王凤琦 张铷 刘世国

［收稿日期］2022-12-05;  ［修订日期］2023-06-18

［基金项目］国家自然科学基金面上项目（30971586）

［第一作者］王小雨（1996-），女，硕士研究生。

［通信作者］刘世国（1973-），男，博士，主任医师，博士生导师。E-mail：liushiguo@qdu.edu.cn。

［摘要］  目的

分析1例Treacher Collins综合征（TCS）病人的遗传学改变，探讨该病例基因型-表型的关系。

方法  提取先证者及其父母外周静脉血全基因组DNA和RNA，利用全外显子测序（WES）对先证者进行突变筛查，采用Sanger测序在先证者及其父母中进行验证。

结果  先证者符合TCS的典型临床症状。基因检测分析结果显示，该病例TCOF1基因第18外显子最后一个碱基发生c.3183G>A（p.Q1061=）突变，但表型正常的父母不存在此突变，因此该突变是一个de-novo遗传的突变。RNA验证显示，先证者与健康人的TCOF1 mRNA水平存在显著差异（t=-27.488，P<0.01）。

结论  TCOF1基因c.3183G>A突变很可能是TCS的致病突变位点。本研究结果有助于了解和完善中国TCS病人的遗传学基础。

［关键词］  Treacher Collins综合征；全外显子组测序；基因，TCOF1；基因突变

［中图分类号］  R394

［文献标志码］  A

［文章编号］  2096-5532（2024）01-0043-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.028

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］  https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240326.1139.001;2024-03-28  17：27：24

Gene mutation analysis of a patient with Treacher Collins syndrome

＼ WANG Xiaoyu， SHEN Lu， WANG Fengqi， ZHANG Ru， LIU Shiguo

＼ （Department of Medical Genetics， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To analyze the genetic changes of a patient with Treacher Collins syndrome （TCS） and explore the genotype-phenotype relationship.

＼ Methods＼ The whole-genomic DNA and RNA were extracted from the peripheral venous blood of the proband and her parents. Whole-exome sequencing was used to detect the gene mutations of the proband， followed by verification with Sanger sequencing in the proband and her parents.

＼ Results＼ The proband met the typical clinical symptoms of TCS. A mutation of c.3183G>A （p.Q1061=） was detected at the last base of exon 18 of the TCOF1 gene in this case， but not in her parents with a normal phenotype， indicating a de-novo genetic mutation. The RNA validation analysis showed a significant diffe-

rence （t=-27.488，P<0.01） in the TCOF1 mRNA level between the proband and healthy controls.

＼ Conclusion＼ The c.3183-G>A mutation of the TCOF1 gene is the probable pathogenic mutation of TCS. This study is helpful for understanding and improving the genetic basis of Chinese patients with TCS.

［Key words］＼ Treacher Collins syndrome; whole exome sequencing; gene， TCOF1; mutation

Treacher Collins综合征（TCS，OMIM编号为154500）又称鸟面综合征，是一种罕见的先天性颅面部疾病，以下颌骨发育不良、眼睑裂隙向下倾斜、耳畸形以及眶周异常为主要特征［1］。TCOF1基因突变是导致TCS的重要的原因，该基因位于5q32-5q33.3，編码Treacle蛋白［2-3］。Treacle蛋白已被研究证明可以调节脑神经嵴细胞的存活和增殖，当TCOF1基因发生突变时，正常的神经嵴细胞会迁移、增加凋亡和减少增殖，这将导致第一咽弓中神经嵴细胞的数量大大减少，从而导致发育异常［4］。本研究通过全外显子测序（WES）技术和Sanger测序验证，鉴定了1例TCS病人TCOF1基因的错义突变，并探究该位点突变对TCOF1基因的表达所造成的影响。

1  资料和方法

1.1  研究對象

病人是来自山东省的1例患有TCS的女性，25岁，因有生育要求就诊。体格检查：神志清，精神可，口唇无发绀，皮肤、黏膜色泽正常，无皮疹及出血点，无吞咽及呼吸异常；面骨发育不全，颧骨发育不良，下颌后缩畸形；眉毛稀疏，睫毛内侧缺失，下眼睑双侧对称性凹陷，下眼睑裂隙向下倾斜；双侧耳明显不对称，右耳外耳畸形，自述对低频声音识别不清。病人自述既往行眶下骨及颧骨填充手术和睫毛嫁接

术。病人无兄弟姐妹，否认家族史；父母体健，无明显TCS症状。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会审核批准。

1.2  研究方法

1.2.1  外周血DNA、RNA提取  采集病人及其父母外周静脉血2～3 mL，同时采集来自山东的健康对照者200例外周静脉血各3 mL。分别使用DNA、RNA提取试剂盒（天根，中国）提取外周血基因组DNA、RNA。外周血白细胞RNA提取后使用Trizol（Takara，日本）裂解，逆转录试剂（诺唯赞，中国）逆转录RNA（RNA含量为1 μg）获得cDNA。

1.2.2  WES  使用超声波打断仪（Covris-S220）将所获得的DNA在TE缓冲液里片段化、纯化后，选择350～450 bp大小的DNA片段和包含适配序列的DNA片段作为DNA文库。获取样本的DNA文库后，通过生物素标记探针（80～120 mer）将目的基因富集。采用Illumina NextSeq 500（Illumina，美国）检测人类全外显子组中 20 099 个基因的外显子区域及周围内含子区域（20 bp），平均测序深度127.55×。使用BWA（bwa-0.7.10）对数据进行预处理，再与人基因组数据库hg19（GRCh37）进行比对，去除低质量reads和假阳性SNP后进行生物信息学分析。最终的结果应用美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南评估，并应用SIFT等软件对致病性进行预测。

1.2.3  Sanger测序验证  对病人及其父母的DNA经WES分析得到的可疑的致病性基因突变进行Sanger测序验证。在突变位点周围约500 bp进行PCR扩增，上下游引物使用Oligo 7.60软件设计。引物及其序列见表1。

对PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，

得到的条带应单一且明亮。

将检测合格的PCR

产物在ABI3730XL测序仪（Applied Biosystems）上进行测序，并与NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的标准序列进行比对，确定突变位点。

1.2.4  RNA验证  在可疑致病基因的突变位点附近前后两个外显子上设计引物进行实时荧光定量PCR（qPCR），以探究是否存在mRNA的异常。使用引物TCOF1-F2、TCOF1-R2对病人及健康对照的cDNA进行qPCR扩增，反应体系共20 μL，内含：2×qPCR Master Mix（诺唯赞，中国）10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板5.0 μL，ddH2O 4.2 μL。反应条件严格按照说明书执行。

1.3  统计学处理

使用SPSS（R26.0.0.0）软件进行统计分析。计量资料以±s表示，两组数据比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有显著性。

2  结  果

2.1  遗传学分析

WES分析显示，先证者携带有一个错义突变（c.3183G>A，p.Q1061=，NM_001135243.1），该突变位于TCOF1基因的第18外显子，即该基因编码cDNA的第3 183位从鸟嘌呤（G）变成腺嘌呤（A）。该位点的突变并没有造成编码的谷氨酰胺（Gln）发生改变，但是可能会影响RNA剪切而致病。Sanger验证显示，先证者父母在该位点没有发生突变，而且先证者的父母也没有出现TCS的临床表现（图1），说明这个突变是de-novo遗传，即不是由父母遗传所致。该突变在200例健康对照者中均未检出。

2.2  生物信息学分析

TCOF1基因错义突变c.3183G>A为第18外显子的最后一个碱基发生突变，SpliceAI预测该变异被用作拼接供体的概率增加了0.89。相同碱基位置的c.3183G>T变异为HGMD已收录的变异，该变异可导致外显子18跳过，从而导致终止子提前出现，影响蛋白的功能［5］。根据ACMG指南将该突变评为临床意义未明（PS4_Supporting+PM2_Supporting）。该变异在HGMD数据库中报道为DM（Disease causing mutation），在InterVar数据库中报道为Uncertain，但是在Clinvar数据库中没有被报道。查询gnomAD数据库显示，该突变在正常人群中的突变频率为0。

2.3  RNA分析

qPCR结果显示，与健康对照者相比，TCS病人（先证者）TCOF1 mRNA表达量明显下降，差异有统计学意义（t=-27.488，P<0.01）。见图2。

3  讨  论

本研究通过对1例中国TCS病人进行WES以及Sanger测序验证，发现了一个致病基因错义突变：TCOF1（c.3183G>A），并对病人的RNA进行了定量分析。该突变不会引起氨基酸发生改变，但是可能会影响剪切。剪切异常导致外显子序列的丢失，使qPCR的引物无法识别扩增检测，最终结果显示mRNA的表达量发生变化。本文病人的父母均未存在该位点的变异，也没有出现TCS的相关表型，因此认为该变异是de-novo遗传。该病最早于1846年被THOMSON所描述，随后在1900年被英国的眼科医生TREACHER COLLINS命名［6］。BOWMAN等［7］曾经在2012年报道过1例携带c.3183G>A杂合突变的TCS病人，遗憾的是他们没有进行RNA验证。HORIUCHI等［5］在2005年报道了1例携带该变异相同碱基位置的c.3183G>T病人，RNA鉴定显示该变异造成了外显子18的跳跃，导致终止密码子提前出现，影响蛋白的功能。

TCS是一種罕见的先天性颅面部疾病，疾病的严重程度因人而异，但是总体上表现为面部骨骼发育不良、外耳或中耳畸形、眼睑裂隙、眼皮缺损、睫毛缺损、腭裂和牙齿发育不良等［8］。此外，病人通常会因为耳畸形而导致单侧及双侧传导性听力损失，也有可能会因为面部骨骼（包括上颌骨和下颌骨）的发育不良而导致进食困难和呼吸困难，包括阻塞性睡眠呼吸暂停等。临床症状严重的病人在出生后可能会因危及生命的呼吸道损害而必须进行手术治疗，甚至会导致胎儿死于围产期呼吸窘迫等。

TCS的发病率约为1/50 000，其中40%的病例是家族性遗传所致，其余60%的病例是因为基因的新发突变［9］。既往有研究显示，TCS具有遗传异质性，该疾病有4种亚型，即TCS1（OMIM606847）、TCS2（OMIM613715）、TCS3（OMIM248390）以及TCS4（OMIM610060），其发生分别由基因TCOF1、POLR1D、POLR1C、POLR1B突变所致，其中发生频率最高的是TCOF1，通过常染色体显性遗传模式遗传，占所有病例的86%［10］。

TCOF1基因位于5q32-33.3，以往人们认为完整的TCOF1基因总共有26个外显子，但是有研究发现了两个新的外显子：外显子6A和外显子16A，分别位于之前的外显子6和外显子7之间、外显子16和外显子17之间。

TCOF1编码一种富含丝氨酸、丙氨酸的蛋白，称为Treacle蛋白。Treacle蛋白是一种由1 488个氨基酸组成的高度磷酸化的核仁蛋白，分子量为152 000，结构域包括核输出信号结构域、核定位信号结构域以及包含大量蛋白激酶CK2和蛋白激酶C（PKC）的磷酸化基序［11］。Treacle蛋白广泛存在于人体大部分组织和器官，在胚胎发育的各个时期均有表达。既往研究表明，TCOF1基因在小鼠胚胎发育过程中的E8.5～9.5时期，即小鼠颅面部发育的关键时期表达量最高［12］。

神经嵴细胞的增殖和迁移调节胎儿的颅面骨骼和软骨的发育，而神经嵴细胞迁移的异常与核糖体生物合成不足密切相关。Treacle蛋白在rRNA的转录、核糖体的生物发生和修饰、细胞增殖分裂及防止氧化应激诱导的细胞凋亡中发挥重要作用［13］。此外，有研究表明抑制Treacle蛋白可刺激高度增殖的神经嵴细胞的高水平凋亡，因此早期胎儿的颅面发育异常以及TCS的典型头面部畸形可能与这些细胞数量减少有关［14］。本文病人的TCOF1基因发生了错义突变c.3183G>A，导致病人该基因的相对表达量低于健康对照者，可能会影响Treacle蛋白的表达，并且进一步影响神经嵴细胞的增殖与凋亡。然而本研究并未进行功能学验证，因此只能认为错义突变c.3183G>A是先证者TCS的高度可疑致病突变。

迄今为止，关于TCS的治疗尚未有明确的方案，只能通过早期干预治疗来缓解病人的呼吸、进食和听力等问题。既往研究中，有人提出可以通过抑制p53的功能来减少神经上皮细胞的凋亡［15］。另有研究表明，由于Treacle蛋白在处理氧化应激诱导的神经上皮细胞DNA损伤中发挥重要作用，因此母体给予抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可以部分挽救TCOF1+/-小鼠以及TCOF1 MOs处理的斑马鱼的面部表型，甚至可以阻止TCS发病［1］。然而，目前还没有任何明确治疗机制可以应用于人类TCS的治疗上。

畸形的面部外观导致TCS病人往往会出现审美或者心理问题，从而给病人的生活带来严重的负面影响。除此之外，由于一些TCS病人症状较轻，在临床上与Goldenhar综合征（OMIM：164210）、Miller综合征（OMIM：263750）以及Nagar综合征（OMIM：154400）有相似的表型，因此根据表型进行鉴别诊断的难度加大［16］。因此，基因诊断成为了TCS诊断金标准。随着技术的发展，二代测序技术具有准确度高以及性价比高等特点，在单基因病的检测诊断中发挥了重大作用，可为TCS明确诊断提供帮助。

综上所述，本研究结果证明了TCOF1基因突变位点c.3183G>A具有潜在致病性，丰富了TCS的基因型-表型关系谱，为产前筛查和遗传咨询提供了理论依据，有助于疾病的早期分子诊断和治疗，为 TCS的进一步研究奠定了基础。本研究也存在一定的局限性，没有讨论TCS致病机制，需要进一步进行功能学研究。

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（本文編辑  黄建乡）