白及多糖在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中的抗炎作用

张冉冉 彭旭东 赵桂秋

［收稿日期］2021-02-25;  ［修订日期］2023-11-23

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81870632）；山东省自然科学基金青年计划（ZR2019BH004）

［第一作者］张冉冉（1995-），女，硕士。

［通信作者］赵桂秋（1962-），女，博士，教授，博士生导师。E-mail：zhaoguiqiu_good@126.com。彭旭东（1988-），男，博士，副主任医师，硕士生导师。E-mail：doctorpxd@126.com。

［摘要］  目的

研究白及多糖（BSP）在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中的抗炎机制，探讨BSP对真菌性角膜炎的治疗作用。

方法  建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型，使用BSP水溶液局部滴眼处理，裂隙灯下观察感染后第1、3、5天小鼠角膜的炎症程度，反转录-聚合酶链反应法检测小鼠角膜中炎症因子和模式识别受体Dectin-1的mRNA水平，酶联免疫吸附试验和蛋白免疫印迹法检测炎症因子和Dectin-1蛋白的表达。

结果  BSP处理的小鼠角膜炎癥评分在感染后第3、5天明显低于对照组（F=6.64、11.58，P＜0.05）。16 g/L 的BSP水溶液可以降低小鼠角膜中炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α以及模式识别受体Dectin-1的mRNA和蛋白表达水平，差异均具有统计学意义（F=2.21～97.39，P＜0.05）。

结论  BSP通过下调炎症因子水平和抑制模式识别受体Dectin-1的表达在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中发挥抗炎作用。

［关键词］  白及多糖；烟曲霉菌；角膜炎；炎症；小鼠

［中图分类号］  R392.5;R772.22

［文献标志码］  A

［文章编号］  2096-5532（2024）01-0028-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.017

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］  https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240319.1459.003;2024-03-21  14：28：24

Anti-inflammatory effect of Bletilla striata polysaccharides in mice with Aspergillus fumigatus keratitis

＼ ZHANG Ranran， PENG Xudong， ZHAO Guiqiu

＼ （Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the anti-inflammatory mechanism of Bletilla striata polysaccharides （BSP） in a mouse model of Aspergillus fumigatus keratitis and the therapeutic effect of BSP on fungal keratitis.

＼ Methods＼ A mouse model of fungal keratitis （FK） was established， and BSP solution was used for local treatment as eye drops. A slit lamp was used to observe the severity of keratitis on days 1， 3， and 5 after infection; RT-PCR was used to measure the mRNA expression levels of inflammatory cytokines and the pattern recognition receptor Dectin-1 in mouse cornea， and ELISA and Western blotting were used to measure the protein expression levels inflammatory cytokines and Dectin-1.

＼ Results＼ The BSP group had a significantly lower clinical score of corneal inflammation than the control group on days 3 and 5 after infection （F=6.64，11.58，P<0.05）. BSP solution at a concentration of 16 g/L significantly reduced the mRNA and protein expression levels of the inflammatory cytokines interleukin-1β， interleukin 6， and tumor necrosis factor-α and the pattern recognition receptor Dectin-1 in mouse cornea （F=2.21-97.39，P<0.05）.

＼ Conclusion＼ BSP exerts an anti-inflammatory effect in mice with A. fumigatus keratitis by downregulating the expression levels of inflammatory cytokines and inhibiting the expression of the pattern recognition receptor Dectin-1.

［Key words］＼ Bletilla striata polysaccharide; Aspergillus fumigatus; keratitis; inflammation; mice

真菌性角膜炎（FK）是一种由致病真菌引起的、致盲率极高的感染性角膜病，农业外伤占其致病危险因素的70%～80%［1-2］。药物治疗是应对FK的主要策略，而有限的药物种类、日渐严重的耐药性等问题，使得研发抗真菌新药的需求变得愈加迫切。目前，新型抗真菌药物的研发策略主要包括改造现有临床常用药物和发现新靶点药物两个方面，从植物提取物中寻找有效抗真菌药物或增效剂也成为近年来研究的新热点［3］。白及多糖（BSP）是从中药白及中提取的一种水溶性多糖，是白及主要的活性成分［4］。中国药典中记载，白及具有收敛止血、消肿生肌、减轻炎症、促进组织再生等功能［5］。BSP含有丰富的葡甘聚糖结构，能够参与细胞内或细胞间的信号传导，具有增强免疫活性的功能［6］。有实验研究证实，BSP可以通过介导多种途径抑制组织中白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达水平［7-8］，而这些炎症因子在FK的感染过程中发挥着重要作用。Dectin-1作为一种模式识别受体（PRRs），在机体受到真菌感染时可以迅速识别病原体进而激活先天性免疫反应［9］。

PRRs表达增加可导致下游炎症因子水平升高，与FK的进展呈正相关，抑制炎症反应的过度激活可以减轻角膜组织的损伤，有助于FK的治疗［10-12］。BSP在烟曲霉菌性角膜炎中的作用尚未见报道。本研究旨在探讨BSP是否通过抑制炎症分子的表达在烟曲霉菌性角膜炎中发挥抗炎作用。

1  材料与方法

1.1  实验动物与菌种

8周龄SPF级C57BL/6雌鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司，均经过严格的生产许可和检疫。所有实验动物的操作严格按照中国科学技术部制定的实验动物人道待遇指导与美国眼科和视觉研究协会（ARVO）制定的动物使用原则和标准进行。实验用烟曲霉菌由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供（NO3.0772）。

1.2  实验方法

1.2.1  烟曲霉菌菌丝的制备  将复温的烟曲霉菌标准菌株接种于Sabouroud琼脂固体培养基，28 ℃恒温箱内孵育。待长出少量菌丝后，用无菌接种环刮取孢子及菌丝接种于300 mL灭菌Sabouroud培养液中，用纱布严密包扎瓶口，37 ℃、120 r/min摇床培养5～6 d。收集菌丝研磨成均匀混悬液，4 ℃、4 500 r/min离心10 min，弃上清，用灭菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤3次后离心，弃上清，加入不含胎牛血清的DMEM混匀，得到有活性的烟曲霉菌菌丝，然后用细胞计数板计数并调整其终浓度为1×1010 CFU/L，－20 ℃冷冻保存。

1.2.2  FK小鼠模型的建立  给予C57BL/6小鼠80 g/L水合氯醛腹腔内麻醉，显微镜下用无菌手术刀片刮除小鼠右眼角膜中央直径约2 mm的上皮，缺损区涂抹5 μL烟曲霉菌菌丝，覆盖角膜接触镜，用5-0缝线缝合上下眼睑。小鼠左眼为空白对照。24 h后拆线观察建模情况，最终纳入72只建模成功且均一的小鼠，随机分为BSP治疗组和PBS对照组（每组36只），分别使用16 g/L的BSP水溶液和PBS每日3次局部滴眼处理。分别于第1、3、5天在裂隙灯下观察小鼠角膜炎症程度并拍照记录，取各组小鼠角膜进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及蛋白免疫印迹（Western blot）实验。小鼠角膜炎症评分及分级参考WU等［13］的研究。

1.2.3  RT-PCR实验  取小鼠的角膜组织，加入800 μL的RNA iso plus试剂（TaKaRa，中国大连）提取总mRNA，提取方法参考朱玉楠等［14］的研究。使用核酸浓度分析仪（NanoDrop ND-1000，赛默飞世尔，美国）检测mRNA的含量以及纯度（R值>1.6）。根据逆转录试剂盒（TaKaRa，中国大连）的说明合成cDNA。取cDNA模板液2 μL，依次加入DEPC水7 μL、SYBR 10 μL（TaKaRa，中國大连）及内参或目的引物1 μL（TaKaRa，中国大连）制成PCR反应液。设置扩增程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃降温30 s，重复40个循环；95 ℃退火延伸15 s；60 ℃降温30 s；95 ℃溶解15 s。

反应结束后根据循环数计算各目的基因的相对表达量。所需小鼠引物序列见表1。

1.2.4  ELISA实验  取小鼠角膜组织，置于495 μL

PBS中，加入5 μL蛋白酶抑制剂，充分研磨后于4 ℃、以5 000 r/min离心10 min，取上清液待测。采用鼠IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒（San-

Diego，CA，USA）检测各组角膜中炎症因子蛋白的表达水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5  Western blot实验  小鼠角膜蛋白的提取方

试剂盒（Elabscience，中国武汉）测定各组小鼠角膜的蛋白浓度并计算上样量。待测蛋白使用100 g/L丙烯酰胺SDS-PAGE电泳分离并转移到PVDF膜上，以PBST洗涤液摇洗（50 r/min×5 min）3次，加入Western专用封闭液（beyotime，中国北京）室温封闭2 h。加入兔抗鼠Dectin-1一抗或者兔抗鼠GAPDH一抗（稀释比均为1∶1 000，Elabscience，中国武汉）4 ℃孵育过夜。PBST洗涤液摇洗（50 r/min×5 min）3次后将膜与山羊抗兔二抗（稀释比例为1∶5 000，Elabscience，中国武汉）共同室温孵育1 h，用ECL发光液（A液∶B液=1∶1，beyotime，中国北京）浸泡10 s后显影拍照，用Image J软件定量分析各组蛋白条带的灰度值。

1.3  统计学处理

使用Graphpad Prism7.0 软件进行统计学分析和处理。各项实验均独立重复3次，所得计量资料结果以±s表示。炎症评分比较采用重复测量设计的方差分析，有两个影响因素的多组数据之间比较采用析因设计方差分析，单个影响因素的多组数据之间比较采用SPSS-单因素方差分析（One-wayANOVA）。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2  结  果

2.1  BSP对小鼠烟曲霉菌性角膜炎病变程度及临床评分的影响

感染后第1天BSP治疗组小鼠角膜轻度水肿，伴有较小面积灰白色溃疡灶，与PBS对照组无明显差异；感染后第3天小鼠角膜溃疡面积及混浊程度均增加，BSP组角膜病变程度轻于对照组；感染后第5天BSP组小鼠角膜水肿减轻，溃疡面积明显减小，而对照组小鼠角膜病变程度较前变化不大，角膜不均匀混浊，且有部分角膜出现后弹力层膨隆（图1A）。临床评分结果显示，烟曲霉菌感染后第1天BSP治疗组与PBS对照组评分无明显差异（F=0.09，P>0.05）；第3天时PBS对照组临床评分明显升高，BSP治疗组小鼠角膜临床评分略有升高且显著低于对照组，差异具有统计学意义（F=6.64，P＜0.01）；第5天时PBS对照组临床评分较前变化不大，而BSP治疗组小鼠角膜临床评分呈降低趋势且明显低于对照组，差异有统计学意义（F=11.58，P＜0.05）（图1B）。

2.2  BSP对烟曲霉菌性角膜炎小鼠炎症相关分子mRNA表达的影响

RT-PCR结果表明，随着时间的进展，小鼠角膜的炎症因子表达水平呈下降趋势，但使用BSP处理可以显著抑制炎症因子的表达水平（表2）。BSP治疗组角膜中IL-1β、IL-6以及Dectin-1的mRNA水平在第3天和第5天明显低于对照组，差异有统计学意义（F=2.21～10.56，P＜0.05）；BSP治疗组TNF-α mRNA水平在第3天明显低于对照组（F=3.82，P＜0.01），第5天两组比较差异无显著意义（F=0.18，P＞0.05）。

2.3  BSP对烟曲霉菌性角膜炎小鼠炎症相关分子蛋白表达的影响

ELISA结果显示，感染后第3天，BSP治疗组

小鼠角膜中的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白

水平明显低于PBS对照组，差异有统计学意义（F=19.02～97.39，P＜0.01）。Western blot结果显示，感染后第3天，BSP治疗组小鼠角膜中Dectin-1的蛋白表达水平与对照组相比明显降低，差异有统计学意义（F=54.76，P＜0.01）。见表3。

各指标3组间比较，F=19.02～97.39，P＜0.01。与正常组比较，*P＜0.01；与PBS对照组比较，#P＜0.01。

3  讨  论

BSP作为中药白及的主要活性成分，具有抗炎、促凝、抗氧化等多种生物学活性［16-18］。黎笑兰等［7］的研究显示，BSP通过抑制TLR4/NF-κB信号通路降低溃疡性结肠炎大鼠血清中促炎因子IL-1β和TNF-α的表达水平，起到保护结肠组织的作用。ZHANG等［8］研究表明，BSP可以抑制MAPK/NF-κB信号通路的激活，降低大鼠胃黏膜组织中炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-18的表达。YUE等［19］和LUO等［20］也证实，在体外BSP可以降低炎症因子IL-6和TNF-α的表达从而减轻组织炎症损伤程度。抑制真菌生长和控制炎症反應是临床上治疗FK的主要方法［21］。已有研究表明，BSP具有抑菌和抗炎的双重作用［6］。本研究结果表明，小鼠角膜炎的病程进展受时间和用药的双重影响，感染第3天时角膜炎症程度达到高峰，BSP可明显减轻小鼠角膜炎症的严重程度；第5天时，对照组小鼠角膜的临床评分较前变化不大，部分角膜出现后弹力层膨出等情况，而BSP治疗组角膜临床评分较前减轻，这提示在FK病程早期使用BSP干预可以减少角膜不可逆损害的发生。进一步研究表明，使用BSP治疗可以显著抑制小鼠角膜中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平，在裂隙灯下表现为角膜水肿减轻、溃疡面积减小。

先天性免疫反应是机体识别和抵抗病原体感染的第一道防线［22-23］，当真菌病原微生物入侵角膜时，机体的免疫系统通过多种PRRs特异性识别并结合病原体相关分子模式快速激活先天性免疫反应，通过分泌炎症因子及募集免疫细胞，进而清除病原体［24-28］。然而，角膜持续、过度的炎症反应会加重FK的进展，严重时可导致角膜溃疡穿孔从而损害视功能［10，29-30］。Dectin-1是一种C型凝集素受体，它可以识别真菌细胞壁中的β-葡聚糖结构进而激活机体先天性免疫应答反应［31］，通过触发炎症信号转导通路促进IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的表达［32-33］，这些炎症因子的过度表达会引起角膜组织的损伤，导致角膜水肿，加重溃疡，在FK中适当控制Dectin-1的表达可以起到炎症保护作用［12，34］。本文研究结果显示，在小鼠角膜感染烟曲霉菌的第3天，角膜中炎症分子Dectin-1、IL-1β、IL-6以及TNF-α的mRNA水平达到最高，与我们前期研究结果一致［35］。而BSP可显著抑制烟曲霉菌感染小鼠角膜中这些分子的表达，避免了过度炎症反应对角膜组织造成损伤，通过抗炎机制在烟曲霉菌性角膜炎的治疗中起到保护作用。

综上所述，BSP通过下调炎症因子水平和抑制PRRs Dectin-1的表达在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中发挥抗炎作用，有望成为治疗FK的新型药物。

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（本文編辑  刘宁）