Caspr敲除在蛛网膜下腔出血早期脑损伤机制的实验研究

邹炎 张冰涛 简瑶 周晓明 吴琪 陈姝娟 张鑫

【摘要】目的探讨黏连蛋白相关蛋白（Caspr）敲除对小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）后早期脑损伤（EBI）的影响及其可能的作用机制。方法采用C57BL/6小鼠及Caspr敲除（Caspr+/-）小鼠，共分为4组：SAH模型組、假手术组、Caspr+/-+SAH模型组和Caspr+/-组，采用视交叉前池注血法建立SAH模型。SAH发生24 h后进行神经功能评分和脑水肿检测。采用Western Blot和ELISA法检测Caspr、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bax、Caspase-1、白细胞介素1β（IL-1β）和IL-18的表达；采用TUNEL染色法观察SAH后神经元的凋亡。结果Caspr敲除导致Bcl-2表达下降，Bax、Caspase-1、IL-1β和IL-18表达升高，促进神经元凋亡。结论Caspr敲除通过激活神经细胞凋亡加重SAH后的EBI。

【关键词】Caspr；细胞凋亡；蛛网膜下腔出血；早期脑损伤

【中图分类号】R651【文献标志码】A【文章编号】1672-7770（2024）01-0054-05

Contactin-associated protein knockout activate early brain injury after subarachnoid hemorrhage via apoptosis ZOU Yan， ZHANG Bingtao， JIAN Yao， et al. Department of Neurosurgery， Jinling Hospital， Affiliated Hospital of Medical School， Nanjing University， Nanjing 210002， China

Corresponding author： ZHANG Xin

Abstract： ObjectiveTo explore the effect of contactin-associated protein（Caspr） knockout on early brain injury（EBI） after subarachnoid hemorrhage（SAH） in mice and its possible mechanism of action. MethodsC57BL/7 and Caspr+/- mice were randomly divided into four groups including sham group， SAH model group， Caspr+/- group and Caspr+/-+SAH group. SAH model was established by stereotactic injection of autologous blood into the optic chiasm cistern. Neurological score and brain edema was performed at 24 hours after SAH. The expressions of Caspr， B-cell lymphoma-2（Bcl-2）， Bax， Caspase-1， interleukin-1β（IL-1β） and IL-18 were detected by Western blot and ELISA. Neuronal apoptosis after SAH was observed by TUNEL staining. Result Caspr knockout decreased Bcl-2 expression， increased the expression of Bax， Caspase-1， IL-1β and IL-18， and upregulated neuronal apoptosis. ConclusionCaspr Knockout can aggravate the EBI after SAH via activating neuronal apoptosis.

Key words： Caspr; cell apoptosis; subarachnoid hemorrhage; early brain injury

基金项目：国家自然科学基金面上项目（82071328）；江苏省自然科学基金面上项目（BK20191231）；东部战区总医院院内课题项目（YYBJ2021041）

作者单位：210002 南京，南京大学医学院附属金陵医院神经外科（邹炎，张冰涛，周晓明，吴琪，陈姝娟，张鑫）；南京中医药大学金陵临床医学院（简瑶）

通信作者：张鑫

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一种高致残率、高死亡率的疾病，占脑卒中发病率的3.1%，住院期间致残、致死率的20.6%，最常见的病因是颅内动脉瘤破裂［1-3］。SAH的病理过程可分为早期脑损伤（early brain injury，EBI）和迟发性脑损伤（delay brain injury，DBI）。EBI是指SAH发生72 h内发生的一系列病理生理变化，越来越多的研究表明，EBI涉及首次出血到脑血管痉挛发生前这一段时间内脑组织的一系列病理生理改变，包括血脑屏障破坏、脑水肿、氧化应激、神经炎症、细胞凋亡等，其中最终的改变之一是神经细胞内抗凋亡因子表达下降，促凋亡因子表达上升，导致细胞凋亡水平反应性上升，进一步导致神经细胞死亡，最终影响SAH患者的预后［3-4］。因此，进一步探究调控神经细胞凋亡的机制对于减轻SAH后EBI具有重要意义。

黏连蛋白相关蛋白（contactin-associated protein，Caspr）家族包括5个成员，Caspr作为家族中最早被发现的细胞黏连蛋白，主要位于神经元郎飞结旁，与位于轴膜端的黏连蛋白1（contactin-1，CNTN1）以及NF155形成复合物，维持髓鞘与轴突间结构［5-9］。研究表明，在阿尔茨海默症小鼠中，Caspr分布在淀粉样沉淀周围，与淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）结合同时下调APP表达，同时过表达Caspr可通过抑制内源性凋亡水平升高来减轻Aβ42对于神经元的细胞毒性［10-11］。然而到目前为止，还没有研究表明Caspr表达改变对于SAH后病理生理过程的作用。本研究旨在探讨Caspr敲除对于SAH的影响以及对于细胞凋亡的关系，以期探讨Caspr在SAH后EBI中的作用。

1材料与方法

1.1实验材料及仪器TUNEL染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；mouse IL-1β、mouse IL-18 ELISA试剂盒（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bax、Caspase-1、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）；Caspr抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司）；荧光显微镜（德国卡尔蔡司股份公司）；酶标仪（美国thermo fisher公司）；Bio-Rad蛋白电泳仪、转膜仪、凝胶成像仪（美国伯乐公司）。

1.2实验动物SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量为25～30 g，购自集萃药康生物科技公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2020-0004。SPF级雄性Caspr+/-小鼠，体质量为25～30 g，由苏州大学神经科学研究所提供。将实验动物饲养于恒温室内，每12 h光暗交替，实验前自由进水进食。实验过程严格按照“国家卫生研究所实验室动物护理和使用指南”标准进行。

1.3模型建立采用Sabri的小鼠视交叉注血方法建立SAH模型［12］，术后24 h，用质量分数1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉实验小鼠，固定后开胸并迅速向左心室置入输液针，剪开右心耳，用输液器灌注生理盐水，待右心房流出液为清亮及肝脏、肺脏颜色发白后停止灌注。后迅速断头取脑，剥离脑组织，选取双侧颞叶为标本置于液氮保存。

采用相同方法造模后24 h，将实验小鼠用质量分数1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定后开胸并迅速向左心室置入输液针，剪开右心耳，用输液器灌注生理盐水，待右心房流出液为清亮及肝脏、肺脏颜色发白后停止灌注。用4%多聚甲醛20 mL灌注后断头取脑，剥离脑组织，取全脑置于4%多聚甲醛中固定。

1.4死亡率和神经功能缺失评分SAH造模完成后24 h统计各组小鼠死亡率。采用改良的Garcia评分测定神经功能缺损程度，包括六项内容：自发活动（0～3分）、前爪伸展（0～3分）、攀爬（1～3分）、身体感觉（1～3分）、胡须触碰反应（1～3分），评分越低，神经功能损伤越严重［13］。

1.5平衡木实验每组小鼠随机取6只，成功造模成功24 h后，在安静适宜的环境里，小鼠被放置于平衡木中央。实验结果的评分标准见参考文献［14］。每只小鼠测试3次，每次1 min，间隔1 min，取三次结果平均值。

1.6脑组织含水量测定每组小鼠随机取6只，成功造模成功24 h后，将完整小鼠脑组织快速取出，冲洗残留血迹并吸干水分，称量脑组织湿重（m湿重）后，用烘箱持续处理72 h，称量其干重（m干重），按照公式計算脑含水量：脑含水量（%）=（m湿重-m干重）/m湿重×100%［15］。

1.7Western Blot分析每组小鼠随机选取6只，SAH造模24 h后，取颞叶脑组织加入1 mL裂解液，超声破碎仪处理3次，每次5 s，4 ℃静置45 min，12 000 r·min-1离心10 min取上清液。采用BCA法测定各组蛋白浓度，加入5×loading buffer，95 ℃加热煮沸5 min，使用SDS-PAGE进行凝胶电泳。每孔上样量20 μg，100 V电泳2 h，300 mA转膜100 min；质量分数5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜；1∶5 000稀释二抗，室温孵育2 h，采用ECL显影液检测。

1.8TUNEL染色每组小鼠随机选取6只，成功造模24 h后，麻醉，生理盐水灌流，多聚甲醛灌注，取脑组织制作冰冻切片，层厚12 mm。PBS洗涤3次，滴加TUNEL检测液，37 ℃避光孵育1 h。PBS清洗3次，加含DAPI封片剂，显微镜下观察。

1.9ELISA检测每组动物随机选择6只，造模成功24 h后，取动脉血，按照ELISA说明书进行操作。

1.10统计学处理Graphpad Prism 9.0软件进行统计学分析，实验数据以均值±标准差（x±s）表示。均采用单因素方差分析进行比较，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1Caspr敲除加重SAH后EBI与SAH组术后24 h小鼠死亡率比较，Caspr敲除组的SAH后24 h死亡率明显增加（图1A）。而对SAH术后24 h的小鼠进行神经行为学评分，结果表明，SAH组神经行为学评分显著降低，神经损伤严重，而Caspr敲除后显著降低神经行为学评分，神经功能进一步损伤，提示了Caspr敲除加重了SAH发生后的EBI（图1B、C）。进一步检测了脑水肿的变化，发现与SAH模型组相比，Caspr敲除后进一步增加了脑含水量，提示Caspr敲除加重了脑血管屏障的破坏（图1D）。

2.2Caspr敲除对于SAH后凋亡相关蛋白表达的影响之前的研究表明，细胞凋亡在SAH后EBI的病理生理机制中起到了重要作用，而Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax之间的平衡被认为是维系细胞存活或者诱导死亡的关键。如图2所示，与对照组相比，SAH组Bcl-2表达下降，Bax表达升高，进一步促进Caspase-1表达升高，Caspr敲除后，Bcl-2表达进一步下降，Bax进一步升高，Caspase-1表达进一步升高，证实SAH发生后细胞凋亡水平增加，而Caspr敲除进一步加重了细胞凋亡。

2.3Caspr敲除上调SAH后IL-1β和IL-18的表达与对照组相比，SAH组IL-1β和IL-18蛋白水平显著增加，而Caspr敲除组IL-1β和IL-18蛋白水平进一步增加（图3A-C）。ELISA检测小鼠动脉血IL-1β和IL-18得到类似结果（图3D、E）。

2.4Caspr敲除促进SAH后神经元凋亡细胞凋亡是SAH后EBI的主要表现，因此本研究采用TUNEL染色的方法检测Caspr敲除后神经元细胞凋亡水平的改变。与对照组相比，SAH组TUNEL阳性细胞数目增加，而Caspr敲除后TUNEL阳性细胞数目明显增加（图4）。上述结果表明，Caspr敲除明显促进了神经元细胞凋亡的发生。

3讨论

EBI目前被认为是导致SAH患者死亡和影响预后的主要原因。EBI的病理机制涉及神经炎症、细胞自噬、氧化应激等多個方面，而细胞凋亡在EBI中起到了重要作用［16-18］。在SAH后，内源性凋亡途径与脑损伤和神经功能障碍密切相关。在SAH后的细胞凋亡中，Bcl-2/Bax平衡的失调受到广泛关注［19］。维持Bcl-2/Bax平衡在SAH急性期具有促进神经元存活的作用，对于改善SAH发生后的死亡和不良预后具有重要的作用。

Caspr作为黏连蛋白相关蛋白家族中最早被发现的细胞黏连蛋白，主要位于神经元郎飞结旁，通过与CNTN1以及NF155形成复合物，维持髓鞘与轴突间结构，进而分割郎飞结区的电压门控钠通道（Nav1.6）与近结区的电压门控钾通道（Kv1.1/1.2/1.4/1.6），保证神经冲动的跳跃式传导［20］。最近的研究表明，Caspr在阿尔茨海默症的病理过程中具有神经保护作用。Caspr过表达可以通过抑制淀粉样斑块形成来减缓阿尔茨海默症的病理进展。同时，在体外实验中，Caspr过表达可通过抗凋亡作用，减轻Aβ42对于神经元的毒性作用。然而，Caspr在SAH中是否具有类似的保护作用仍有待进一步阐明。本研究为了验证Caspr对SAH后EBI的作用，首先对神经功能评分和脑水肿进行检测。结果发现对照组小鼠SAH发生后神经功能评分下降，发生明显脑水肿，而Caspr敲除小鼠发生SAH后的脑含水量更高，神经行为学评分更低，神经功能与对照组相比受损更加明显，说明Caspr敲除小鼠SAH后EBI更加明显。为了进一步探究Caspr敲除后加重SAH后EBI的作用机制，本研究对Bcl-2、Bax、Caspase-1、IL-1β和IL-18表达量进行了测定，结果提示与对照组小鼠相比，Caspr敲除小鼠发生SAH后脑组织中Bcl-2表达降低，Bax、Caspase-1蛋白表达增加；而脑组织和血中的IL-1β和IL-18表达进一步增加；同时采用了Tunel染色的方式，可以观察到SAH后对照组小鼠神经元发生了凋亡，而Caspr敲除小鼠神经元凋亡更加明显，提示Caspr敲除后加重SAH导致的神经元凋亡。

综上所述，Caspr敲除后可促进SAH后的细胞凋亡，进一步加重SAH后的EBI。Caspr可能是SAH后EBI的关键靶点，维持或者升高Caspr表达水平可能为改善SAH后的EBI提供一种有效的治疗策略。本研究也存在一定的局限性，首先只对神经凋亡和相关炎症因子表达进行了研究，仍需要进一步研究证实Caspr导致细胞凋亡发生的具体信号通路调控机制。其次，本研究发现Caspr敲除导致脑含水量显著上升，提示Caspr参与了血脑屏障调控，但是具体机制仍需要进一步研究。同时虽然本研究证实了Caspr敲除促进了SAH后EBI，但是过表达Caspr是否可以减轻SAH后的EBI，甚至进一步改善神经功能，仍需要进一步研究证实。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

［参 考  文  献］

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（收稿2023-05-02修回2023-05-27）