年龄对儿童髓母细胞瘤预后的影响及其肿瘤微环境分析

董文艳 黄进 吴硕雄

【摘要】目的分析不同年龄段髓母细胞瘤患者生存率，探讨肿瘤微环境中免疫细胞浸润对预后的影响及其与年龄的相关性，并筛选年龄相关免疫调节分子。方法对公共数据库中的队列进行研究，使用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，根据年龄不同，利用MCPcounter对免疫细胞绝对丰度进行量化，同时筛选年龄相关免疫调节分子，寻找影响低龄髓母细胞瘤预后的危险因素。结果髓母细胞瘤患者的生存率随年龄的减少而降低，0～3岁的婴幼儿期髓母细胞瘤患者生存率在队列所有病例中最低。婴幼儿期患儿肿瘤微环境中的效应免疫细胞CD8+T细胞、细胞毒性淋巴细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞显著低于其他年龄段患儿，肿瘤相关纤维母细胞、单核细胞、内皮细胞显著高于其他年龄段患儿。CXCR4的高表达与效应免疫细胞浸润呈负相关，与肿瘤相关细胞呈正相关，这些免疫细胞与髓母细胞瘤预后密切相关。结论低龄引起髓母细胞瘤不良预后与CXCR4高表达介导的肿瘤微环境重塑密切相关。

【关键词】儿童髓母细胞瘤；肿瘤微环境；CXCR4；免疫治疗；GEO

【中图分类号】R739.41【文献标志码】A【文章编号】1672-7770（2024）01-0065-07

Prognosis and tumor microenvironment analysis of pediatric medulloblastoma based on different ages DONG Wenyan， HUANG Jin， WU Shuoxiong. Department of Anesthesiology， Wuxi Childrens Hospital Affiliated to Jiangnan University， Wuxi 214023， China

Corresponding author： WU Shuoxiong

Abstract： ObjectiveTo analyze the prognosis of patients with medulloblastoma at different ages， and to explore the influence of immune cell infiltration on prognosis and the correlation with age， and screen age-related immune regulatory molecules. MethodsIn the study， cohorts from public database were studied through informatic analysis， Kaplan-meier curves were used for survival analysis， and MCPcounter was used to quantify the absolute abundance of immune cells in different ages. Meanwhile， age-related different expression genes were screened， and the effects of different expression genes on immune cell infiltration were analyzed. ResultsThe survival rate of patients aged 0-3 years was the lowest among all patients in the cohort. The number of CD8+T cells， cytotoxic lymphocytes， neutrophils and B lineage in the tumor microenvironment of infants were significantly lower than other age groups， while the number of tumor-associated fibroblasts， monocyte lineage and endothelial cells were significantly higher than other age groups. The expression of CXCR4 was negatively correlated with the infiltration of effector immune cells and positively correlated with tumor-associated cells， which were closely related to the prognosis of medulloblastoma. ConclusionThe poor prognosis of infants medulloblastoma is closely related to the remodeling of tumor microenvironment mediated by CXCR4 expression.

Key words： pediatric medulloblastoma; tumor microenvironment; CXCR4; immunotherapy; GEO

基金项目：无锡市卫生健康委青年科研项目（Q202133）

作者单位：214023 无锡，江南大学附属儿童医院麻醉科（董文艳，吴硕雄）；南京醫科大学附属无锡人民医院神经外科（黄进）

通信作者：吴硕雄

髓母细胞瘤是一种常见于儿童、恶性程度最高的中枢神经系统肿瘤，在所有儿童胚胎性肿瘤中占比约为65.8%，其中0～14岁儿童的发病率约为0.5例/10万［1］。虽然在日益先进的医疗条件下，进行最大限度的手术切除和术后系统的放化疗使髓母细胞瘤患儿生存率明显提升，但在多种因素影响下，仍然有患儿出现复发甚至死亡。因此，对髓母细胞瘤预后的干预研究仍尤为重要。

髓母细胞瘤在细胞形态上类似胚胎期髓母细胞，具有侵袭性强、易转移等特征，在本质上属多基因病变，这些基因及信号通路的交互作用调节细胞癌变的启动、侵袭转移、复发、生存与死亡［2-3］。效应免疫细胞是机体识别和清除癌变细胞的核心组成，在抑制肿瘤生长、转移、复发中发挥重要作用。本研究基于高通量基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）中髓母细胞瘤的样本，分析不同年龄段患儿肿瘤微环境中免疫细胞浸润情况，并进一步筛选影响免疫浸润的相关分子，旨在通过促进抗肿瘤免疫提高患儿生存率的探索。

1资料与方法

1.1一般资料GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库是由美国国立生物技术信息中心创建的基因表达数据库，收录了世界各国研究机构提交的基因表达数据，包括基因芯片，高通量测序数据。本研究使用数据集GSE85217是一项由加拿大多伦多儿童医院发起的多中心研究，测序平台为Affimetrix Human Gene 1.1 ST Array，数据集包含763例年龄段在0～57岁的原发性髓母细胞瘤患者。本研究根据儿童髓母细胞瘤诊疗规范的划分选择0～18岁年龄段患者作为儿童进行后续分析，并定义0～3岁患儿为婴幼儿期组，4～10岁患儿为学龄期组，10～17岁患儿为青春期组，大于18岁患儿为成年期组。下载数据集临床资料信息后，剔除年龄性别不详的病例后，共计有效病例716例。根据分组，对年龄、性别、分子亚型、病理亚型和转移情况进行汇总和统计。预后采用Kaplan-Meier生存分析，绘图和统计使用Grsaphpad Prism8。

1.2基因集富集分析和差异表达基因筛选基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）是一种基于表达矩阵来对基因进行富集的方法，其结果反映某预定义基因集在两组间的表达变化趋势。本研究根据程序的要求准备表达矩阵、表型数据、功能基因集（h.all.v7.5.symbols.gmt）文件，利用GSEA_4.1.0软件对上述文件进行分析。以NES（校正富集分数）值>1和NOM P-value<0.05为标准对富集通路进行筛选分析。

患者基因表达数据预处理在R语言环境中分析，通过Affy package（v1.44.0）处理探针数据，基于稳健的多阵列平均算法对数据进行标准化处理，转化得到基因表达谱的矩阵数据。本研究中，两组间差异表达基因筛选使用GEO2R进行分析，以|Log2FoldChange|>1且adj.P<0.05为标准定义为差异表达基因。差异表达基因火山图使用ggplot package绘制。

1.3免疫细胞浸润MCPcounter是一个可以利用转录组数据量化8个免疫细胞和2个基质细胞绝对丰度的工具。本研究髓母细胞瘤患儿肿瘤微环境中免疫细胞浸润情况采用MCPcounter进行分析。

1.4统计学分析统计分析使用软件SPSS 23和Graphpad Prism8，其中三组间临床资料比较采用χ2检验，生存分析采用对数秩检验，免疫细胞浸润分析采用t检验，相关性分析采用Pearson相关性分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1儿童髓母细胞瘤患者临床资料716例有效病例中，0～17岁的儿童患者共计617例，根据年龄分组，有93例婴幼儿期患儿，平均年龄为1.71岁，占有效病例的13.0%；学龄期患儿345例，平均年龄6.2岁，占有效病例的48.2%；青春期患儿179例，平均年龄12.49岁，占有效病例的25.0%。资料汇总显示，男性患儿比例高于女性患儿，前者约为后者的2倍，但三组间性别比例没有差异。在分型上，三组患儿的分子亚型分布具有统计学差异，其中婴幼儿期SHH型比例最高，学龄期和青春期患儿Group4型比例最高；由于存在病理类型和转移情况不明的病例，本研究没有对两个指标在三组间是否存在差异进行统计分析（表1）。

2.2低龄是儿童髓母细胞瘤的临床不良预后因素年龄是影响肿瘤预后的重要因素，本研究随后对三组患儿及成年期患者的生存进行分析，结果显示，髓母细胞瘤术后生存率随年龄的减少而降低，婴幼儿期患儿长期生存率显著低于青春期和成年期，学龄期患儿长期生存率则显著低于成年期（图1A）。

本研究对婴幼儿期和青春期患儿的测序结果进行基因集富集分析发现，多个信号通路于婴幼儿期髓母细胞瘤富集，其中PI3K信号通路（NES=1.49，P<0.05）和KRAS信号通路活性（图1B，NES=1.49，P<0.05）显著高于青春期患儿，提示PI3K和KRAS信号通路的异常活化参与对髓母细胞瘤术后长期生存的影响。

2.3低龄伴随儿童髓母细胞瘤不良预后与抗肿瘤免疫低下有关上述结果显示，低龄是儿童髓母细胞瘤的不良预后因素。低龄影响患儿对放化疗的依从性和耐受性，同时也是影响机体免疫功能的重要因素。此外，PI3K异常活化亦可导致免疫功能受损和失调，从而影响疾病的转归［4］。因此，本研究不同年龄段髓母细胞瘤患儿免疫浸润情况显示，婴幼儿期患儿CD8+T细胞显著低于学龄期患儿，细胞毒性淋巴细胞、中性粒细胞、B细胞显著低于学龄期和青春期患儿，单核系细胞、内皮细胞、纤维母细胞则显著高于学龄期和青春期患儿（图2）；提示低龄髓母细胞瘤患儿抗肿瘤免疫力较弱，促血管生成能力强于学龄期和青春期患儿。

2.4CXCR4是介导低龄髓母细胞瘤免疫逃逸的关键年龄相关分子上述研究显示，低龄确诊髓母细胞瘤患儿肿瘤微环境中效应免疫細胞显著低于其他年龄段患儿。为了探究婴幼儿期患儿免疫低下的原因，本研究随后对三组患儿的基因表达进行筛选。结果显示，婴幼儿期和学龄期患儿相比，有175个基因表达升高，91个基因表达降低；婴幼儿期和青春期患儿相比，有203个基因表达升高，114个基因表达降低；学龄期与青春期患儿间没有差异表达基因（图3A）。上述实验结果提示，PI3K通路影响髓母细胞瘤的生存预期，同时调节机体免疫应答。因此，本研究将PI3K通路的核心基因与年龄差异表达基因进行合并，结果发现，CXCR4和PRKCB可能是介导低龄髓母细胞瘤不良预后的年龄相关分子（图3B）。此外，本研究发现与青春期患儿相比，CXCR4的配体CXCL12在婴幼儿期的表达亦显著升高（图3A）。

随后，本研究分析CXCR4对免疫细胞浸润的影响，如图3C所示，CXCR4的高表达与细胞毒性淋巴细胞呈强负相关，与纤维母细胞呈强正相关（|r|>0.5）；与CD8+T细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞呈弱负相关，与内皮细胞呈弱正相关（0<|r|<0.3）；与单核系细胞呈中等程度正相关（0.3<|r|<0.5），与自然杀伤细胞没有相关性。结果显示，CXCR4对儿童髓母细胞瘤免疫细胞浸润的影响与低龄髓母细胞瘤患儿肿瘤微环境结果一致。〖FL）〗〖KH-*1D〗

2.5基于CXCR4为靶点的临床药物治疗探索CXCR4的高表达介导低龄髓母细胞瘤患儿的抗肿瘤免疫低下和不良预后。目前，已有多种CXCR4小分子抑制剂获批上市或正在进行临床试验，这些抑制剂在肿瘤治疗中发挥重要作用（表2）。多项研究显示，多靶点的联合应用可显著增强免疫治疗的效果［5］。为此，本研究继续探索CXCR4与其他免疫治疗靶点的相关性；选择GD2、TIM3、PD-L1/PD-1、IDO1和CTLA4为研究对象，如图4所示，儿童髓母细胞瘤中CXCR4与TIM3的表达呈中等程度正相关（0.3<|r|<0.5），与GD2、PD-L1、IDO1的表达成弱正相关，与PD-1的表达呈弱负相关（0<|r|<0.3），与CTLA4的表达没有相关性，表明CXCR4抑制剂和TIM3单克隆抗体联合应用具有更强的协同效应。

3讨论

髓母细胞瘤是儿童最常见神经系统恶性肿瘤，在世界卫生组织神经系统肿瘤分级中被定义为恶性程度最高的Ⅳ级，总体中位生存期约为66个月，其中0～14岁患儿5年存活率约63.9%［1］。在年龄和性别分布上，髓母细胞瘤中位发病年龄在5～7岁，男性发病率（约60%）大于女性［6］。本研究参考的研究队列中，男性患儿占比约65.5%，男女比例约为2∶1，以4～10岁患儿发病率最高，约占所有病例的48.2%，与文献报道一致。髓母细胞瘤根据分子表型的不同被分为WNT、SHH、group 3和group 4四个亚型，其中WNT型预后较好，兒童5年生存率为95%，而group 3型在所有分子亚型中预后最差并极易转移［7］。本研究的分析提示，不同年龄段髓母细胞瘤的分子亚型存在显著差异，婴幼儿期以SHH型为主，占比63.4%，而学龄期和青春期以group 4型为主，占50%以上。

影响髓母细胞瘤的预后因素有很多，包括年龄、残余病灶大小、Chang氏分期、病理类型和分子亚型等。年龄是影响髓母细胞瘤预后的重要因素，对于小于3岁的患儿，需同时满足残余灶<1.5 cm2，Chang氏分期M0，病理类型为促结缔组织增生型或广泛小结节型才被归为标危组，否则均为高危组［8］。Kohler等对神经系统肿瘤的统计亦显示，0～1岁婴儿髓母细胞瘤患者5年生存率约为33%，显著低于1～4岁幼儿患者（47%）和5～14岁儿童患者（67%），提示确诊年龄与预后密切相关［9］。 本研究根据年龄分组对患儿生存率进行分析，发现婴幼儿期患儿在4个年龄段中预后最差，显著低于成年期患者和青春期患儿。肿瘤在本质上属多基因病变，分子生物学和遗传学的快速发展使人们开始关注髓母细胞瘤相关的基因和信号通路改变，包括与患者预后的关系。研究显示，NOTCH信号通路的转录因子ATOH1可促进SHH型髓母细胞瘤的软脑膜播散和转移［10］。而在group 3和group 4型髓母细胞瘤中，WIP1的过表达促进肿瘤细胞的侵袭［11］。此外，肿瘤微环境中的基质细胞及其分泌的因子也是髓母细胞瘤转移的因素之一［12-13］。因此，本研究随后分析低龄相关的不良预后是否与基因水平的变化相关。结果显示，相比于青春期，PI3K和KRAS两个信号通路的核心分子在婴幼儿期患儿中显著富集。KRAS信号通路在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程中起着重要调控作用，KRAS可以通过转录因子Gli的激活促进胰腺癌的发生，亦可通过KRAS/YY1/ZNF322/Shh转录轴增强新生血管的形成［14-15］。PI3K信号通路在多种肿瘤发生中发挥关键作用，目前共有5种针对PI3K的小分子抑制剂被批准临床使用，这些抑制剂通过阻断PI3K信号通路的活化可抑制髓母细胞瘤的增殖、耐药及迁移［16］。

PI3K信号通路不仅影响肿瘤细胞，而且参与免疫细胞的成熟、活化和迁移。研究显示，PI3K的异常活化降低CD8+T细胞的浸润，上调抑制性细胞因子如IL-10、TGFβ等的表达，增强调节性T细胞、2型巨噬细胞等抑制性免疫细胞的浸润和纤维母细胞介导的肿瘤进程［17-18］。鉴于PI3K在低龄髓母细胞瘤患儿中的影响及其与免疫微环境的相互作用，本研究对儿童髓母细胞瘤免疫浸润进行研究。结果发现，婴幼儿抗肿瘤免疫显著降低，表现在CD8+T细胞、细胞毒性淋巴细胞、中性粒细胞、B细胞都显著降低；而CD8+T细胞、细胞毒性淋巴细胞等介导的免疫应答是清除肿瘤细胞的首要因素，其功能障碍和衰竭均有利于肿瘤免疫逃逸［19］。此外，研究结果提示婴幼儿期患儿单核系细胞、内皮细胞、纤维母细胞较学龄期和青春期患儿显著升高。单核细胞可发育成巨噬细胞，并极化为促炎的1型巨噬细胞或抗炎的2型巨噬细胞，但2型巨噬细胞和肿瘤相关纤维母细胞通过自身及其分泌的抑制性细胞因子形成免疫屏障，进一步抵抗细胞毒性淋巴细胞的抗肿瘤效应［20］。

免疫细胞发挥功能受包括免疫检查点在内的多种分子调控，免疫检查点是维持免疫稳态的重要分子，但肿瘤细胞通过异常表达的共抑制分子及其相关配体，抑制免疫细胞的激活，从而逃避免疫攻击［21］。通过以上结果得知，低龄髓母细胞瘤伴随临床不良预后，同时低龄患儿抗肿瘤免疫显著降低。为寻求低龄患儿抗肿瘤免疫低下的原因，本研究分析各组患儿髓母细胞瘤基因表达情况，并筛选与PI3K信号通路相关的差异表达基因；结果显示，CXCR4和PRKCB是PI3K信号通路相关的年龄差异表达基因。同时，本研究发现，CXCR4的表达与效应免疫细胞CD8+T细胞、细胞毒性淋巴细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞呈负相关，而与纤维母细胞、内皮细胞和单核系细胞呈正相关，结果与低龄髓母细胞瘤免疫浸润表型一致。CXCR4是趋化因子CXCL12的特异性受体，两者结合促进肿瘤的生长和迁移［22］。此外，CXCL12/CXCR4促进肿瘤血管生成和诱导抑制性免疫反应。研究显示，CXCL12/CXCR4阻碍CD8+T细胞的分化，促使巨噬细胞向2型极化，并通过其他作用帮助肿瘤逃避免疫监视［23］。

CXCR4高表達的促癌作用，让人们意识到其作为肿瘤免疫治疗靶点的可能，目前，有多项CXCR4小分子抑制剂和单克隆抗体被批准上市或正在进行临床试验［24］。多项研究表明，多免疫靶点的抑制可显著增强抗肿瘤功效［25］。因此，本研究从免疫靶点间的相关性着手，探讨可能的双靶点协同作用；结果显示，CXCR4与TIM3在表达水平正相关，与PD-1/PD-L1等靶点相关性较弱或没有相关性，提示CXCR4抑制剂和TIM3单抗的联合使用可协同逆转髓母细胞瘤的抑制性免疫表型。

本研究基于儿童髓母细胞瘤的生物信息学分析表明，低龄是临床预后的不良因素之一，这可能与CXCR4介导的效应免疫细胞浸润降低有关；同时，本研究给出联合双靶点免疫治疗的可行方案，以期提高儿童髓母细胞瘤的长期生存率。

利益冲突： 所有作者均声明不存在利益冲突。

［参 考  文  献］

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（收稿2022-09-04修回2022-10-21）