纯钛表面负载无定形多聚磷酸钙涂层对成骨分化影响

单烁 周欢 陈胜男 魏子然 杨磊 于腾波

［收稿日期］2023-03-05;  ［修訂日期］2023-07-18

［基金项目］国家自然科学基金杰出青年基金（82025025）；国家自然科学基金青年科学基金（31802022）；山东省重点研发计划项目（2021SFGC0502）；河北省自然基金绿色通道项目（C2021-202003）；河北省自然基金创新研究群体项目（H2022202007）；天津市多元投入基金项目面上项目（21JCYBJC01030）；国家骨科与运动康复临床医学研究中心创新基金项目（2021-NCRC-CXJJ-Z-H-17）

［第一作者］单烁（1995-），男，硕士研究生。

［通信作者］杨磊（1982-），男，博士，教授，博士生导师。E-mail：ylei@hebut.edu.cn。于腾波（1970-），男，博士，主任医师，博士生导师。E-mail：ytb8912@hotmail.com。

［摘要］  目的

探讨纯钛表面负载无定形多聚磷酸钙（Ca-polyP）涂层对成骨分化的影响。

方法  取TA2级纯钛片，表面构建Ca-polyP涂层，采用场发射扫描电子显微镜、X射线能量色散谱仪、X射线衍射仪、傅立叶变换红外光谱仪和接触角测量仪对材料进行表征。将小鼠胚胎成骨前体细胞接种于纯钛片（对照组）以及负载Ca-polyP涂层的钛片（实验组）上进行细胞培养，采用CCK-8法测定细胞的增殖活性，通过碱性磷酸酶活性测定以及碱性磷酸酶染色评估两组钛片表面细胞的成骨分化能力。

结果  多种物理表征方法检测结果证明20链长Ca-polyP涂层成功负载在钛片表面。CCK-8检测结果显示，两组钛片均无细胞毒性，且共培养7 d时实验组钛片表面的细胞增殖活性显著高于对照组，差异具有统计学意义（F=1 375.183，P<0.001）。随着共培养时间的延长，两组钛片表面细胞的碱性磷酸酶活性均逐渐增高，共培养7 d时实验组钛片表面细胞的碱性磷酸酶活性显著高于对照组，差异具有统计学意义（F=41.141，P<0.01）。碱性磷酸酶染色后荧光倒置显微镜下观察，实验组钛片上的蓝紫色深染结节明显多于对照组。

结论  与纯钛相比，钛片表面负载Ca-polyP涂层可以显著增强小鼠胚胎成骨前体细胞的增殖和成骨分化能力。

［关键词］  钛；磷酸钙类；小鼠胚胎干细胞；成骨分化

［中图分类号］  R329.21

［文献标志码］  A

［文章编号］  2096-5532（2024）01-0006-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.014

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］  https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240307.1046.001;2024-03-09  19：18：47

Effect of pure titanium surface-loaded amorphous calcium polyphosphate coating on osteogenic differentiation

＼ SHAN Shuo， ZHOU Huan， CHEN Shengnan， WEI Ziran， YANG Lei， YU Tengbo

＼ （Department of Sports Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the effect of pure titanium surface-loaded amorphous calcium polyphosphate （Ca-polyP） coating on osteogenic differentiation.

＼ Methods＼ TA2 titanium sheets were taken， coated with Ca-polyP on the surface， and characterized by field emission scanning electron microscopy， X-ray energy dispersive spectroscopy， X-ray diffractometry， Fourier transform infrared spectroscopy， and contact angle measurement. Mouse embryo osteoblast precursor cells were inoculated on pure titanium sheets （control group） and titanium sheets loaded with Ca-polyP coating （experimental group） for cell culture. The proliferation activity of cells was measured by CCK-8 assay. The osteogenic differentiation ability of cells on the surface of titanium sheets in both groups was assessed by alkaline phosphatase activity assay and alkaline phosphatase staining.

＼ Results＼ Successful loading of 20-chain-length Ca-polyP coating on titanium sheet surface was demonstrated by various physical characterization me-

thods. The results of CCK-8 assay showed that titanium sheets in both groups were non-cytotoxic， and the cell proliferation activity on the surface of titanium sheets in the experimental group was significantly higher than that in the control group after 7 days of co-culture （F=1 375.183，P<0.001）. With the extension of co-culture time， the alkaline phosphatase activity of cells on the surface of titanium sheets gradually increased in both groups， and the alkaline phosphatase activity of cells on the surface of titanium sheets in the experimental group was significantly higher than that in the control group after 7 days of co-culture （F=41.141，P<0.01）. Alkaline phosphatase staining followed by inverted fluorescence microscopy showed that there were significantly more blue-purple darkly stained nodules on titanium sheets in the experimental group than in the control group.

＼ Conclusion＼ Titanium sheets loaded with Ca-polyP coating on the surface significantly enhances the proliferation and osteogenic differentiation of mouse embryo osteoblast precursor cells compared with pure titanium sheets.

［Key words］＼ titanium; calcium phosphates; mouse embryonic stem cells; osteogenic differentiation

骨缺損是困扰人们几个世纪的难题。至今，实现更快、更好地种植体骨整合仍然是骨科领域面临的一个重要挑战。金属钛及钛合金因有优良的力学性能和生物相容性长久以来都被人们当作骨科移植的首选材料［1-3］。无机多聚磷酸盐（polyP）作为一种与骨矿物质成分相似的化合物已经引起了研究人员的注意。polyP广泛存在于多种生物体内，是一种由最多1 000个磷酸盐（Pi）单元构成的无机线性聚合物，由高能磷酸键相互连接，在人体内主要存在于成骨细胞和血小板中［4］。polyP的生物学功能多种多样，其降解产物如Pi和能量可以参与骨再生和能量代谢［5］。polyP作为一种聚阴离子，带强负电荷，可以与二价和三价金属离子等结合从而发挥不同作用。众所周知，骨骼矿化过程需要大量的无机盐和能量，所以很多研究者尝试利用polyP合成多聚磷酸钙（Ca-polyP），从而促进成骨反应。本研究制备了负载20链长无定形Ca-polyP的钛表面涂层，

探讨其对小鼠胚胎成骨前体细胞生物活性的影响，以期为构建具有优良成骨活性的种植体涂层提供新思路。

1  材料和方法

1.1  实验材料

TA2级纯钛（兴化市江浙钛制品有限公司，江苏）；20链长polyP（Sigma，美国）；二水氯化钙（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无水乙醇、丙酮及氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）；小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1（中国科学院细胞库）；MC3T3-E1成骨诱导分化培养液、MC3T3-E1细胞完全培养液（苏州海星生物科技有限公司）；碱性磷酸酶染色及活性检测试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；CCK-8试剂盒（苏州新赛美生物科技有限公司）。

1.2  实验方法

1.2.1  实验分组  将100个钛片随机分为2组，每组50个。以纯钛组作为对照组，该组预处理后的钛片记为Ti；以负载Ca-polyP组作为实验组，该组钛片记为Ca-P20-Ti。

1.2.2  纯钛的预处理  将纯钛片（10 mm×10 mm×

1 mm）分别用1 000、1 500、2 000目的砂纸逐级打磨，横竖反复交替打磨直到钛片表面光洁，去掉氧化层后呈现镜面状。然后依次用丙酮、乙醇和去离子

水分别超声清洗3 h，充分去除钛表面杂质。随后

配制5 mol/L NaOH溶液，将钛片放入其中浸泡，

捞出后用去离子水和乙醇反复超声清洗3次，以清除钛片表面油污，最后放入37 ℃烘箱中干燥备用。

1.2.3  20链长的Ca-polyP涂层负载  将20链长的polyP 1.1 g溶解于50 mL去离子水中，超声溶解均匀。随后将预处理好的若干钛片抛光面向上浸泡于溶液中12 h，形成polyP改性钛。再将2.9 g的CaCl2·2H2O溶解于30 mL去离子水中并超声溶解配制过饱和CaCl2·2H2O溶液。将浸泡有钛片的烧杯放置在搅拌器上，放入pH计电极棒，边搅拌边通过滴加1 mol/L NaOH调整pH值至10左右，随后缓慢将过饱和CaCl2·2H2O溶液滴加入浸泡钛片的烧杯中。钛片在该反应液中浸泡24 h，在此期间始终维持pH值在10左右。待反应结束后分别用乙醇和去离子水交替超声清洗3次以除去未完全反应的物质以及杂质，最后放入37 ℃烘箱烘干备用。Ti表面Ca-polyP涂层构建原理见图1。

1.2.4  材料的表征  以下材料表征实验均每组取3个干燥样品。从烘箱中取干燥样品固定在样品台上，喷金30 s后在加速电压为10 kV的条件下采用场发射扫描电子显微镜（Hitachi S-4800，Japan）观察样品表面形貌的微观结构。取出干燥样品，采用X射线能谱仪（EDS，Genesis XM2，EDAX，America）分析样品表面涂层的化学成分以及含量。取出干燥样品，放入X射线衍射仪（XRD，Miniflex 600）中，利用X射线在晶体物质中的衍射效应进行物质结构分析。取出干燥样品，使用傅立叶变换红外光谱仪（FTIR，Nicolet iS20）对样品进行分析。将两组钛片分别置于样品台上，在距离样品表面约5 cm处滴加10 μL去离子水，应用接触角测量仪进行钛片表面水接触角测量。

1.2.5  MC3T3-E1细胞的培养  细胞置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中，用MC3T3-E1细胞专用的完全培养液进行培养。培养过程中2 d更换一次培养液，培养数天后待细胞贴壁融合面积达T25培养瓶底面积的80%～90%时，弃培养液，加入PBS清洗培养瓶3次。加入1 mL胰蛋白酶消化2 min后再加入5 mL的细胞培养液终止消化，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入新鲜培养

液10 mL重悬，吹打均匀，细胞计数后选择适当的

密度进行细胞传代或冻存。

1.2.6  CCK-8法测定细胞增殖  每组设3个平行样，每个平行样重复3个孔。将制备好的样品浸泡在体积分数0.75乙醇中30 min，并用紫外线照射钛片正反两面进行消毒灭菌处理，处理完成后用无菌镊将所有钛片转移到24孔板中。取对数生长期的MC3T3-E1细胞，用PBS漂洗后消化细胞，以每孔104个细胞的密度将细胞悬液接种到24孔板中。培养1、3、7 d后，每孔加入40 μL的CCK-8溶液，避光孵育2 h，使用酶标仪测量450 nm波长下的吸光度值。

1.2.7  碱性磷酸酶定量分析  按前述方法将样品灭菌并放置于24孔板内，取对数生长期的MC3T3-E1细胞，消化后以每孔104个细胞的密度接种于24孔板中样品的表面，每2 d更换一次培养液。7 d后将MC3T3-E1完全培养液更换为MC3T3-E1细胞专用成骨诱导培养液继续诱导培养。在培养4 d和7 d后，将样品取出，用PBS漂洗3遍，将样品转移到新的24孔板中，用RIPA裂解液裂解细胞30 s，并用移液枪反复吹打，将裂解后的溶液转移到1.5 mL的EP管中，在4 ℃下以1 000 r/min离心10 min。用碱性磷酸酶活性测定试剂盒对离心后的样品进行定量检测，使用酶标仪在405 nm波长下测定吸光度值。

1.2.8  碱性磷酸酶染色  按前述方法将样品灭菌并放置于24孔板中，取MC3T3-E1细胞悬液以每孔104个细胞的密度滴加到钛片上，在24孔板中共培养7 d后将培养液更换为MC3T3-E1细胞专用成骨诱导培养液继续诱导培养7 d。7 d后进行碱性磷酸酶染色，以PBS洗涤钛片3次，多聚甲醛固定30 min，再用PBS洗涤3次，向每孔中加入1 mL碱性磷酸酶染色溶液，在室温下避光孵育30 min。用PBS洗涤3次，在倒置荧光显微镜（尼康，日本）下观察并拍照。

1.3  统计学分析

采用SPSS Statistics v.26软件（SPSS， Chicago， IL）进行统计学分析。本实验所得数据均符合正态分布，以±s形式表示，应用两独立样本t检验及两因素重复测量方差分析进行统计检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2  结  果

2.1  材料的表征

2.1.1  表面微形貌分析  场发射扫描电子显微镜观察可見，Ti的表面相对光滑，可见抛光产生的细小纹理，无其他物质沉积；在负载20链长无定形Ca-polyP后，钛片表面可见均匀分布的Ca-polyP沉积物，呈现颗粒状突起，实现Ca-polyP在钛片表面自组装与生长（图2）。

2.1.2  表面元素分析  EDS分析结果显示，Ti的表面不含磷和钙元素，而对Ca-P20-Ti表面颗粒突起进行EDS扫描则证明钙和磷元素已成功负载到钛片表面（图3A）。EDS图谱显示了扫描位置以及各元素的分布情况（图3B）。

2.1.3  材料表面的XRD分析  Ca-polyP涂层粉末的图谱呈馒头峰，并没有尖锐峰出现，表明本实验所合成的Ca-polyP涂层为非结晶态。Ca-P20-Ti与Ti的图谱基本一致，主峰可与钛标准谱线（PDF#44-1294）对应。见图4。

2.1.4  材料的FTIR分析  将样品放入FTIR中进行分析，如图5所示，可在Ca-P20-Ti中见到polyP的特征吸收峰。polyP中P-O-P键的非对称伸缩振动吸收峰vas（P-O-P），以及反映P-O-P键的对称伸缩振动吸收峰vs（P-O-P）分别在885.32 cm-1处和736.44 cm-1处出现；同时，（PO3）2-的非对称伸缩振动吸收峰vas（PO3）2-在1 087.54 cm-1处出现。这与先前其他的研究结果一致［6］。结合前面所述的EDS以及XRD结果，证明Ca-P20-Ti表面所沉积的为Ca-polyP。

2.1.5  材料的亲疏水性分析  接触角测量仪测量结果显示，Ti接触角为84.387°±0.678°，Ca-P20-Ti接触角为32.220°±0.898°，Ca-P20-Ti的亲水性明显大于Ti（t=80.268，P<0.05）。

2.2  钛片表面细胞增殖能力

在两组钛片表面接种细胞共培养7 d，细胞表现出持续的增殖趋势，两组的吸光度值均逐渐增大。两因素重复测量方差分析显示，组别和时间存在交

互作用（F=471.085，P<0.001）。简单效应分析结

果显示：培养1 d时，两组钛片表面细胞的增殖程度

差异无显著性（F=0.056，P=0.815）；培养3、7 d时，实验组钛片表面的细胞增殖活性显著高于对照组（F=76.200、1 375.183，P<0.001）。证明該涂层

具有良好的生物相容性，能促进MC3T3-E1细胞的

增殖。见图6。

2.3  细胞成骨分化能力

2.3.1  两组钛片表面碱性磷酸酶定量分析  两组

钛片表面MC3T3-E1细胞分泌的碱性磷酸酶的量随着时间延长呈持续增长的趋势。两因素重复测量方差分析显示，组别和时间存在交互作用（F=21.881，P=0.003）。简单效应分析结果显示，培养4、7 d时，实验组钛片表面细胞的碱性磷酸酶活性均显著高于对照组（F=19.053、41.141，P<0.01）。见图7。

2.3.2  两组钛片表面碱性磷酸酶染色  如图8所示，Ca-P20-Ti表面被染成蓝紫色的细胞数量较Ti更多。结合碱性磷酸酶活性检测结果，证明经Ca-polyP修饰的钛表面更能促进MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。

注：标尺=10 μm。

3  讨  论

金属钛仍是目前骨科移植物常用的材料，广泛应用于各种人工关节以及钢板、螺钉等。但因属于惰性金属，所以其骨整合能力较差，可延长骨科移植术后的康复时间。因此许多研究都采用物理、化学和生物等方法对钛表面进行结构微处理或者负载各种涂层，以增强钛基材料的成骨能力［7-11］。

polyP是一种带负电荷的直链生物聚合物，由多个磷酸基团通过高能磷酸键连接在一起［12］。很多研究证实，polyP在体内被碱性磷酸酶水解后，会释放出大量能量和Pi，并运输到细胞外环境中参与骨骼矿化过程以及合成代谢反应［5］。polyP是一种聚阴离子聚合物，可以与金属阳离子相结合。受此启发，很多研究者已经尝试合成Ca-polyP。与结晶态Ca-polyP相比，无定形Ca-polyP更适用于人体生理环境，人工合成的Ca-polyP被认为与人体中天然存在的Ca-polyP具有相似的生理功能［13］。研究表明，这些具有促成骨作用且富含能量特性的物质可以显著促进细胞增殖、成骨分化以及骨组织中新生血管的形成［14］。

为了将polyP和Ca2+共同固定到钛片上制备Ca-polyP涂层，本研究首先用polyP溶液浸泡钛片，使polyP中的Pi与钛片表面形成稳定的共价键连接，随后在pH=10的环境中加入过饱和CaCl2·2H2O溶液。经polyP改性的钛片表面带有极强的负电荷，对钙离子具有很高的亲和力。因此，溶液中的Ca2+会随着反应时间延长而逐步取代polyP中的Na+形成稳定的Ca-polyP，完成原位生长形成稳定涂层。在扫描电镜下可见Ti表面光滑呈抛光样貌，而负载Ca-polyP后可以观察到钛片表面有颗粒状突起。在EDS中可以观察到，与Ti不同的是，Ca-P20-Ti表面颗粒主要以钙、磷、氧元素为主，说明是Ca2+与polyP之间结合形成了化学键连接。刮取钛片表面涂层进行XRD分析，可见图谱呈非晶态馒头峰状，证明钛片表面为无定形态物质，这与有关研究结果一致［15］。Ca-P20-Ti与Ti的XRD图谱基本一致，与钛的标准谱线对应。这可能是因为Ca-polyP的图谱为较宽的非晶态峰，无新的结晶态物质产生。FTIR分析可见polyP的标志性吸收峰，分别在885.32、736.44及1 087.54 cm-1处出现。这与先前Ca-polyP的FTIR分析研究结果一致［6］，证明钛片表面负载物质为Ca-polyP。以上材料表征证明了Ca-polyP成功地负载到钛片表面。

在细胞增殖实验中，两组细胞随着时间延长均表现出持续增殖的趋势，但在培养7 d时，Ca-P20-Ti表面的细胞数量远远超过Ti。这可能是因为钛

片表面的Ca-polyP浸泡在培养液中可以释放大量

的Ca2+、Pi以及能量，为细胞生长提供了更良好的生长环境。同时，改性钛片表面本身的亲水性也可能与细胞的增殖相关［16］。碱性磷酸酶活性的高低是评价MC3T3-E1细胞早期成骨分化水平的一个重要指标，代表了成骨能力。本文结果显示，两组钛片的碱性磷酸酶活性均随时间延长而增加，培养7 d 时Ca-P20-Ti的碱性磷酸酶活性显著高于Ti；碱性磷酸酶染色也观察到，与Ti相比，Ca-P20-Ti有更多的蓝紫色结节，这与碱性磷酸酶活性测定的结果是一致的。说明Ca-P20-Ti对MC3T3-E1细胞早期成骨分化的促进作用十分显著。有证据表明，这不仅是因为Ca-polyP在成骨过程中提供了原料和能量，还可能因为参与了依赖成纤维细胞生长因子介导的细胞信号传导通路从而调节了细胞增殖和骨骼矿化［17］。

综上，本研究选用20链长的polyP与CaCl2·2H2O作为原料，利用电荷吸引的原理，用极其简单的制备方法，在室温下即可使Ca-polyP在钛表面原位生长形成涂层，提升了纯钛的成骨能力。尽管20链长Ca-polyP涂层表现出不错的生物学活性，但未来在骨科领域中应用仍有不小的困难。Ca-polyP材料目前还不能大规模制备，且研究中使用的前体反应物也仅为食品级，尚不能满足医药标准。微生物体内积累的大量polyP储备为规模生物合成制备提供了新的前景。目前已有使用酿酒酵母合成食品级polyP的报道。未来仍需要缩小从实验室制备到商业化生产之间的差距。目前20链长Ca-polyP涂层的骨整合能力验证仅停留在体外研究，未来仍需进行体内研究验证其功能及稳定性。

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（本文編辑  马伟平）