外泌体提取及提高外泌体产量研究进展

杨艾，鲁卫东

外泌体是由脂质双分子层包裹，与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的多囊体小腔内，直径为 30 ～ 100 nm[1]、密度为 1.13 ～ 1.21 g/ml[2]的囊泡。外泌体通过在体内游走，与受体细胞结合，进而实现细胞交流、调控近端和远端细胞微环境等作用，内含 mRNA、DNA、蛋白质等物质[3]。外泌体来源广泛，主要从体内（血液、唾液等体液）和体外（细胞培养）分离提取[4]。但外泌体具有内在的异质性，到目前为止，在内容和大小方面还不可能产生完全同质的外泌体群体[5]，这给外泌体的提取带来了巨大困难。

目前的大多数分离技术无法将外泌体与具有相似生物物理特性的脂蛋白和非内泌体途径衍生的细胞外囊泡完全分离，导致外泌体纯度低。因此，如何有效地收集外泌体是当下一个主要问题，这对外泌体的下游分析至关重要。对于不同的目的和应用，可选择不同的分离方法，现阶段主要采用超高速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法等方法分离提取外泌体[6]。超高速离心法是目前应用最广泛的分离技术，也是外泌体提取和分离的金标准。Johnstone等[7]首次应用该方法分离网织红细胞组织培养基中的外泌体，Théry 等[8]进行了优化，但由于耗时、成本高，容易对外泌体的结构造成损伤，外泌体易聚集成块，不利于下游分析[9]，并且超高速离心法获得的沉淀中除含有外泌体外，还混有其他蛋白质和囊泡[10]。密度梯度离心法通常与超速离心结合使用以提高外泌体的纯度，主要有两种方法，其中一种是使用蔗糖作为培养基，在研究中广泛使用，但蔗糖溶液的高黏度会降低外泌体的沉积速率，导致分离时间更长[11]。聚合物沉淀的方法通常使用聚乙二醇（PEG）作为介质，PEG是通过将环氧乙烷与水或乙二醇添加而形成的，通过降低外泌体的溶解度，在离心条件下获得外泌体。聚合物沉淀法相对容易操作，分析时间短，适用于处理大剂量样品。然而，利用此方法获取的外泌体纯度和回收率相对较低，并且产生的聚合物很难去除，不利于后续的功能实验分析[6]。超滤方法通常使用具有不同分子量截止值（MWCO）的超滤膜来选择性地分离样品。然而，外泌体和超滤膜存在非特异性结合的问题，从而降低了回收率[12]。这些方法缺乏特异性，使得外泌体的分离和纯化并不理想。

外泌体缺乏安全稳定的来源也是产量低下的一个主要原因。外泌体主要是从体外的细胞培养基（如肿瘤细胞培养基、免疫细胞培养基、干细胞培养基）中分离得到的。体外细胞培养基中的外泌体含量非常有限，不利于规模化生产，限制了其临床应用。不同来源的外泌体有着不同的组成，即使是同一来源的外泌体对于受体细胞也会有多重功能，在临床上不能普适或可控[13]。这些因素直接或间接地导致了外泌体得率较低，因此亟需提高外泌体的产量来解决以上问题。本文对外泌体的形成分泌过程以及在细胞培养时对培养条件改进等方面进行综述。

1 外泌体形成过程

外泌体形成的具体过程分为 3 个阶段：第一阶段形成早期内吞体，之后成熟形成晚期内吞体，晚期内吞体向内出芽形成管腔囊泡（ILVs）；第二阶段 ILVs 发育成熟进一步形成多囊泡（MVBs）；第三阶段，大部分 MVBs 被转运至溶酶体降解，仅有小部分 MVBs 与质膜融合后以胞吐的形式将外泌体释放到胞外[14-16]。

从分泌机制可知外泌体的生物发生关键步骤在第三阶段，近年来对外泌体分泌至胞外的过程，无论是 MVBs 与质膜融合，还是 MVBs 被溶酶体降解的研究，也逐渐增多。

1.1 ILVs 形成阶段

外泌体生物发生的核心成分涉及转运复合物所需的内体运输分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT），ESCRT 是一种蛋白复合物，主要作用是分选特异的组分进入 ILVs 形成外泌体的前体，ESCRT包含了四种复合体及辅助蛋白（VPS4、VTA1、ALIX 等），也有报道称外泌体的生物发生涉及 ESCRT 非依赖性途径，ESCRT 非依赖性途径通过脂质、神经酰胺等的作用辅助生成 ILVs[17]。外泌体内含物的成分主要为蛋白质、脂质和核酸，蛋白质组成部分包括与膜转运和融合的相关蛋白如Rab 家族，Rab 蛋白是类 Ras 的小 GTP 酶（GTPase）超家族中最大的分支，它们在 GTP- 和 GDP-结合状态之间交替，由鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）和 GTPase 激活蛋白（GAPs）促进，能调控囊泡转运，比如囊泡的出芽、囊泡和细胞内细胞器的运动、囊泡衔接的不同阶段，从而促进膜的融合。

Rab5:Q79L 是 Rab5 蛋白的突变体，Barbieri 等[18]报道 Rab5:Q79L 仅促进早期内吞体之间的融合。且 Wegner等[19]研究表明 Rab5:Q79L 的过度表达不利于早期内吞体转运并导致晚期内吞体扩大。同时根据 Kooijman 等[20]所研究的磷脂酶 D（PLD）将磷脂酰胆碱代谢为磷脂酸（PA），由于酰基链附近有一个非常小的带负电荷的头部基因，在膜的内部小叶中产生的 PA 可能会诱导负膜曲率，这可能有利于内腔内出芽，以及神经酰胺的锥形结构可诱导膜双层自发负弯曲，促进膜内陷[21]，局部脂质成分可重组为专门的内胚体区域，诱导膜弯曲并促使 ILVs 形成，该学者发现PA 探针富集在 Rab5:Q79L 早期内吞体的限制膜上，可以进行内体出芽并产生巨大的 MVBs。

Stenmark 等[22]还发现 Rab5:Q79L 的过度表达严重减少了合胞体蛋白（syndecan）、溶酶体相关膜蛋白 3（CD63）、突触融合蛋白（syntenin）和凋亡诱导因子 6 相互作用蛋白（ALIX）的外泌体释放。与 CD63 一样，ALIX 和 syntenin是外泌体内最常见的蛋白质。

Baietti 等[23]进一步研究了 syntenin-ALIX 是否支持晚期内吞体膜上的出芽过程。共聚焦显微镜显示用 mCherry（红色荧光蛋白）荧光标记的 syntenin 和 syndecan 胞内结构域（ICD）广泛共定位，包括它们与 ALIX 一起“聚集在”用 cerulean（cer）修饰 Rab5:Q79L 的内吞体中。充满 McHery-syntenin（指示 ILVs）的内吞体中也充满 CD63。相反，在没有伴随的 McHery-syntenin 表达的情况下，CD63主要局限于内吞体的限制膜。这些结果表明，syntenin 通过LYPX(n)L 基序直接与 ALIX 相互作用，类似于逆转录病毒蛋白，并支持内吞体膜的腔内出芽。该研究还表明syntenin 的缺失也显著降低了晚期内吞体的平均大小。这些较小的晚期内吞体意味着 syntenin 可能使 ILVs 难以形成或维持，对晚期内吞体的成熟及与膜融合也有影响。

乙酰肝素酶是一种葡萄糖醛酸酯酶，在血管形成、炎症、组织发育和肿瘤转移的过程中均起着重要作用。有学者还发现乙酰肝素酶以浓度依赖性的方式刺激 syntenin-1、syndecan 和某些其他外泌体标志蛋白（如CD63）的分泌，而外泌体 CD9、CD81 和脂筏标记蛋白（flotillin-1）不受影响。相反，内源性乙酰肝素酶含量的降低减少了含syntenin-1 的外泌体的分泌。这说明乙酰肝素酶起到了激活syndecan-syntenin-ALIX 外泌体途径的作用[24]。

ADP-核糖基化因子（ARF）是一类在真核细胞中广泛存在的高丰度 N-豆蔻酰化的单体 GTP 结合蛋白，可激活ADP-核糖基化转移酶。Ghossoub 等[25]表明小 GTPase ADP核糖基化因子 6（ARF6）缺失并没有阻断早期或循环内吞体中 CD63 的转运，而是阻断晚期内吞体隔间中的 CD63。在 ARF6 缺失的细胞中 MVBs 形态明显改变，这表明ARF6 在 MVBs 的限制膜上起作用。

1.2 MVBs 与质膜融合阶段

ILVs 发育成熟为 MVBs 后，MVBs 与质膜融合后向胞外分泌外泌体主要依赖 Rab 家族和 SNARE 家族的协助作用。

1.2.1 Rab 家族 Rab 家族包括 Rab11、Rab35、Rab27A/B、Rab9 等，其中 Rab27 最具特征[26]。Rab27a 基因可通过其编码的蛋白参与 T 淋巴细胞、肥大细胞及造血细胞等的颗粒分运输及胞吐作用。已有研究表明在人非小细胞肺癌细胞系 A549 中转染 Rab27a 过表达载体，初步建立的 Rab27a过表达细胞系所分离出的外泌体，与对照组相比，典型的外泌体蛋白标记物被鉴定为高表达，即表明外泌体的分泌量增加。EPI64 作为 Rab27a 的 GTP 结合酶激活蛋白，在正常肺癌细胞 A549 中过表达 EPI64 会使外泌体分泌增加，但先在细胞 A549 沉默 Rab27a 后，再过表达的 EPI64 不能使外泌体增加，这说明 EPI64 参与了 Rab27a 介导的外泌体分泌[27]。在黑色素瘤细胞 B16-F10 和 SK-Mel-28 中有效地降低 Rab27a 的表达，导致外泌体分泌减少了 50%[28]，以及在乳腺癌 4T1 和 TS/A 细胞中抑制 Rab27a 的表达会导致外泌体分泌减少[29]。Ostrowski 等[30]通过人 HeLa 细胞系分析 Rab 蛋白在外泌体分泌中的作用，发现 Rab27a或 Rab27b 功能的丧失导致细胞培养上清液中分泌的外泌体数量减少，但既不改变其蛋白含量，也不改变其形态，并且 Rab27a 和 Rab27b 的沉默减少了 MVBs 与质膜的融合。

Rab35 作为 Rab GTPase 家族成员之一，广泛参与细胞内部囊泡转运及物质运输过程。Frühbeis 等[31]在原代少突胶质细胞中，对小 GTPase Rab35 进行了小干扰 RNA（siRNA）沉默，发现外泌体分泌量减少，该研究还通过纳米颗粒跟踪分析显示，谷氨酸刺激的细胞释放出更多平均大小为 95 nm 的颗粒，反映了谷氨酸能够刺激少突胶质细胞释放外泌体。Hsu 等[32]在中性粒细胞中，通过两轮 siRNA核连接敲除 Rab35 可以明显减少细胞裂解液中的 Rab35，并导致外泌体膜部分蛋白脂质蛋白（PLP）恢复显著降低，说明外泌体的分泌量显著减少。

1.2.2 SNARE 家族 可溶性 NSF 附着蛋白受体（soluble NSF-attachment protein receptor，SNARE）家族是外泌体分泌中另一个重要的调节分子，是由多种蛋白质组成的复合体。SNARE 蛋白为 Ral-1 的靶蛋白，Ral 是低分子量GTP-结合蛋白超家族的一员，参与多种细胞活动，有研究发现 Ral GTPases 参与了外泌体的分泌，该研究表明外泌体由表皮 Hyp 细胞分泌，并有助于形成一种特殊的表皮结构，即 alae，而 GTPase Ral-1 的缺失会导致 alae 缺陷，当 Ral-1 变得有限时，MVBs 和顶端质膜的融合受到阻碍，以致外泌体分泌减少。并且该研究还表明突触融合蛋白-5（SYX-5）参与 MVBs 膜和 Ral-1 下游的质膜之间的融合，Ral-1 的活性形式可以在顶端质膜水平激活或募集SYX-5，以促进 MVBs 融合。在缺乏 SYX-5 的情况下，MVBs 外膜不能再与质膜融合[33]。囊泡相关的膜蛋白 7（VAMP7）是一种 v-SNARE 蛋白，作为 SNARE 家族的一员，在 K562 细胞中，VAMP7 是包含乙酰胆碱酯酶的外泌体分泌至胞外过程的必需组分。在 MDCK 细胞中抑制VAMP7 的表达，可阻止分泌型溶酶体的释放，并抑制外泌体分泌至胞外[34-35]。

1.3 MVBs 被溶酶体降解阶段

尽管 MVBs 形成后会分为两个阶段，但多数的 MVBs会与溶酶体融合被降解，这是导致外泌体产量低下的关键原因，因此阻断或减少溶酶体降解 MVBs，增加 MVBs 与质膜的融合率使其更多地向胞外释放外泌体，成为提高外泌体产量的有效途径。

沉默调节蛋白 1（SIRT1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性的脱乙酰化酶，在细胞代谢、氧化应激等方面作用显著。Latifkar 等[36]发现敲除 SIRT1 导致外泌体数量增加了 3 倍以上。SIRT1 的缺失增加了乳腺癌细胞中 MVBs的大小，这是由于溶酶体功能失调造成，SIRT1 缺失使质子泵功能不良，溶酶体无法维持降解内容物时的低 pH 值，因此溶酶体中降解的 MVBs 会与质膜融合向细胞外释放外泌体。该研究表明浸润性乳腺癌细胞中 SIRT1 的缺失限制了溶酶体酸化并使 MVBs 重新导向与细胞表面融合，从而增加了外泌体的分泌。

Ca2+也与溶酶体降解有关，溶酶体胞外分泌受突出结合蛋白 VII（synaptotagmin VII）调控，它是位于溶酶体上的Ca2+结合蛋白 synaptotagmin 家族的成员。Synaptotagmins在其胞质区域包含两个 Ca2+域，它们可以结合磷脂响应Ca2+，是 SNARE 复合物的组成部分。有多项研究表明胞质 Ca2+水平的升高会刺激外泌体分泌，Ca2+调节的溶酶体胞吐是一个普遍存在的过程[37-39]。IP3（三磷酸肌醇）作为参与 G 蛋白偶联受体介导的信号转导的第二信使，可以促使胞库释放 Ca2+，增加胞质 Ca2+的浓度，Ca2+通过 IP3敏感的 Ca2+通道部分促进 MVBs 的产生[40]。莫能菌素（MON）是一种膜渗透性钠离子载体，作用于酸性的胞内细胞器，如内核体和溶酶体。MON 能诱导 Ca2+的产生。钙依赖机制参与了 MON 刺激外泌体释放，因其通过改变囊泡膜上的质子梯度作用于酸性室，导致 Ca2+向胞质内移动，故 MON 不仅促使大量 MVBs 的产生，而且还增加了外泌体的分泌。氯喹作为常用的抗疟疾药也能增加外泌体的分泌，其增加外泌体分泌有两个原因，一是通过增加细胞内Ca2+的浓度，刺激外泌体的释放[41]；二是氯喹具有弱碱性，通过中和溶酶体 pH 可阻断溶酶体降解[42]。Xu 等[43]将氯喹与乳腺癌细胞 MDA-MB-231、SUM159PT 共孵育 40 ～48 h，收集外泌体进行 Western blot 实验，发现氯喹具有刺激外泌体分泌的作用。巴弗洛霉素 A 也是可以改变液泡腔室 pH 值的药物，Alvarez-Erviti 等[44]表明用巴弗洛霉素 A或 V1Vo-ATPase（膜蛋白复合物）抑制剂处理细胞时，外泌体的释放水平提高，该研究表明 MVBs 是进入溶酶体降解途径还是发生质膜融合是由囊泡内的 pH 环境决定的。

除了以上关于外泌体分泌的生物发展三阶段，与外泌体结构相似的脂质体，同样也可促进外泌体的分泌。Emam等[45]受 Elsabahy 和 Wooley[46]报道的纳米材料可以诱导多种细胞产生细胞因子的启发，结合脂质体作为纳米材料，以一种物理化学依赖的方式与细胞表面相互作用，从而刺激细胞产生外泌体。研究显示脂质体与细胞共培养可提高外泌体产量。该研究采用薄膜水合法制备了多种脂质体，并将不同浓度的脂质体制剂与 4 种癌细胞进行共培养，所有被试癌细胞系均能以依赖于细胞类型和时间的方式分泌外泌体，共培养 48 h 后，B16BL6 癌细胞株表现出最高的外泌体产量。随着中性或阳离子修饰的空白脂质体（NL 或 CL）磷脂浓度的增加，所有细胞株的外泌体分泌量均增加。在相同的实验条件下，阳离子修饰的空白脂质体（CL1）比中性空白脂质体（NL）表现出更强的外泌体分泌刺激活性，而中性空白脂质体的聚乙二醇化会抑制外泌体的分泌。表明外泌体分泌受脂质体的刺激/抑制作用取决于其剂量、表面电荷、膜流动性和 PEG 修饰，以及癌细胞的类型和活力。虽然该研究对脂质体刺激外泌体分泌的潜在机制尚不明确，但可能也与细胞内 Ca2+水平的变化或引起细胞膜去极化有关。Ca2+对外泌体的影响并不是单方面，往往也是结合 Rab 家族及 SNARE 家族共同起到作用。

2 细胞培养过程

外泌体主要从细胞培养基中提取得到，所以培养基条件以及对细胞的预处理与外泌体产量也有直接关联。

2.1 细胞接种密度

外泌体由活体细胞分泌得到，当活细胞数量越多时，分泌的外泌体也越多，但 Patel 等[47]研究表明外泌体的产生取决于细胞接种密度，而不是细胞传代。高密度接种细胞容易出现生长抑制，而通过以低密度接种干细胞且仅使用低传代，并且提高收集频次可以提高总产量。

2.2 三维培养

MSCs 的三维培养主要通过细胞间聚集或细胞与生物材料间的黏附实现。Kim 等[48]采用悬滴法（3D-HD）和聚甲基丙烯酸 2-羟基乙酯（poly-HEMA）涂层法（3D-PH），将 3D 球体中骨髓间充质干细胞（MSCs）产生外泌体的效率与不同条件下单层培养的效率进行比较，结果显示以上所述的两种 3D 培养类型，MSCs 产生的外泌体明显多于在传统单层培养（2D）中获得的外泌体。研究者认为这种现象是由细胞变为非黏附的圆形形态引起的。且该研究同样表明无论是 3D 培养还是 2D 培养，当增加细胞培养密度时，外泌体产量会减少。

2.3 缺氧和缺血

缺氧是指将细胞培养在 1% ～ 5% O2的微环境中。King等[49]发现暴露在缺氧（1% O2）条件下，乳腺癌细胞分泌的外泌体比正常对照组高 1.41 倍。而暴露在 0.1% 的 O2条件下的乳腺癌细胞，与正常组相比，要高出 2 倍。研究者认为乳腺癌细胞外泌体的分泌量与缺氧程度成正比。

缺血预处理是指在短时间内剥夺特定器官或组织的血液供应，然后再进行一段时间的再灌注恢复过程，通过内源性保护途径减轻再灌注对缺血组织的损伤。Davidson 等[50]表明缺血预处理后，人脐静脉内皮细胞和离体灌注大鼠心脏的外泌体分泌量均较正常对照组高出约 3 倍，通过 NTA观察到外泌体的大小并未有明显变化。

3 展望

外泌体从最初被认为是细胞产生的“废物”到随着广泛的深入研究，其各种生物功能正在不断地被探索挖掘。目前外泌体在多种器官及组织损伤修复中有巨大潜力，在皮肤再生抗衰老、肿瘤治疗、药物载体等多方面，外泌体都发挥着至关重要的作用，展现出良好的临床转化应用前景。虽然目前外泌体领域发展迅速，但仍存在着许多障碍：①现有分离方法大多数都不规范，更像是对所分离的体系进行浓缩，且操作方法均耗时耗力，不可扩展；②外泌体的形成及分泌至胞外的机制尚未有统一定论，这对于想要精准定位于外泌体分泌作用靶点存在一定的阻碍；③细胞培养过程中外泌体产量有限，最佳的接种密度和培养基条件仍需不断探索，这些都是推动外泌体广泛应用的挑战。若想要增加外泌体的医学应用，提高产量是至关重要的一步，产量的高效增加将会支持外泌体相关分析及其作为药物载体应用的基础研究的扩展。随着研究人员对外泌体得率的探索，提高外泌体产量的方法一定会不断地被开发，进而推进外泌体的临床应用。