清雅型石湾玉冰烧白酒挥发性组分及感官特征分析

吴 凡，范绍辉，何国良，梁思宇，徐 岩，唐 柯*

(1.江南大学生物工程学院酿造微生物与应用酶学研究室，江苏无锡 214000；2.广东石湾酒厂集团有限公司，广东佛山 528031；3.石湾清雅型酒研究院，广东佛山 528031)

白酒是中国特有的一种蒸馏酒，在世界蒸馏酒市场具有重要地位[1]。由于原料、工艺以及陈酿等条件的差异，中国白酒的香型具有多种多样的特点。清雅型石湾玉冰烧白酒以大米为原料，经过小曲（摘取野生菌种，添加甘草、茴香、肉桂叶等中草药）糖化发酵、釜式蒸馏、山洞陈酿等酿造环节而成[2]。独有的酿造工艺构成了清雅型石湾玉冰烧“清、雅、醇、绵”的感官特点，香气清雅协调，口味怡畅，风格自成一派[2]，与传统的“白酒十二香型”具有较为明显的差异。

白酒中的挥发性香气成分仅占总量的2%，但含量和比例对白酒的香型、品质具有关键作用，在很大程度上影响消费者的选择[3]。不断尝试使用更为灵敏精确的检测手段对微量香气活性化合物进行捕捉鉴定，是现代解析白酒风格特征的关键环节，对白酒品质把控具有重要意义。近年来，气相色谱质谱联用法被广泛应用于白酒香气的鉴定，为白酒香气品质的把控提供了更为直观的数据支撑[4]。然而，白酒中包含的挥发性化合物累计报道超过2000 种，一维气相色谱质谱法的峰容量渐渐不能满足白酒更为复杂的分析要求，因此分离度更高的二维气相色谱质谱法越来越受到科研人员的关注。二维气相色谱使用两根极性不同的气相色谱柱，采用连续调制的方式，可一次性实现上千个物质的分离，具有高分辨率、高灵敏度、高峰容量等优势[5]。飞行时间质谱在扫描范围、灵敏度和分析速度方面比传统检测器性能更佳。近年来，二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOFMS）广泛应用于白酒风味的研究中，如季克良等[6]利用GC×GC-TOFMS 解析了浓香型、酱香型和清香型白酒的重要挥发性物质。随后，研究人员运用GC×GCTOFMS 陆续分析了剑南春、古井贡酒、泸州老窖等白酒的挥发性组分[7-9]。近年来，全二维气相色谱-飞行时间质谱技术也被应用到痕量物质的专一检测和对白酒等级品质特征物质的鉴定中[10-12]。此外，感官分析是香气表征另外一个重要手段。定量描述分析（quantitative descriptive analysis,QDA）是一种采用线性标尺对感官属性进行强度表征的感官实验方法，可以同时评估多种样品的感官属性强度，结果直观。由于其感官实验结果的客观性和可控性，被广泛应用于酒类的感官风味研究中[13-14]。如陆佳玲等[15]使用定量描述分析实验研究了清香型白酒在梯度稀释过程中的香气属性强度变化，解析了清香型白酒降度后风味变化规律。

目前关于清雅型石湾玉冰烧白酒风味的研究刚刚开展[2]，其香气的物质基础和整体感官特征尚不清晰。因此，本研究采用GC×GC-TOFMS 全面定性清雅型石湾玉冰烧酒中的挥发性化合物，进一步通过香气数据库明确具有香气特征的化合物，初步构建清雅型石湾白酒的风味信息库；最后结合定量描述分析法，明确清雅型石湾玉冰烧白酒的感官香气特征，为清雅型石湾白酒香气的深入研究及生产调控提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品

实验使用的样品是清雅型石湾玉冰烧洞藏9成品酒（40 %vol），由广东石湾酒厂集团有限公司提供。

1.1.2 试剂及耗材

无水乙醇（色谱纯，上海安谱科学仪器公司），二氯甲烷（色谱级，美国Sigma-Aldrich 公司），无水硫酸钠（分析纯，上海国药集团），氯化钠（分析纯，上海国药集团）。

1.1.3 仪器设备

顶空固相微萃取多功能自动进样系统（MPS2），德国Gerstel 公司；全二维气相色谱-飞行时间质谱仪（GC×GC-TOFMS，Pegasus 4D），美国LECO 公司；7890B 气相色谱仪，美国安捷伦公司；玻璃色谱柱（30 cm×1.5 cm）；DC-12 氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司；超纯水仪Mili-Q，美国密理博公司；超声波清洗仪SB-25-12D，宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平，Mettler-Toledo 公司；电热鼓风干燥箱，上海恒科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅DK-S24 型，上海森信实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 定量描述分析

参照国际标准ISO 8586—2012 对品评员进行筛选和培训。通过问卷问询和香气味觉测试，从江南大学生物工程学院学生中筛选12 位无感官缺陷，无不良嗜好，年龄在18～25 岁之间的品评员（5男，7 女）。对感官品评员进行为期一个月的感官培训，每周三次，每次时长1小时。

参考样选择：通过感官品评小组的集体讨论，选定了油质、植物、烘焙、甜香、果香、花香、米香、酸香八种感官属性词。依据实际香气特点，选择合适的香气参照样品，对感官品评员进行香气属性及强度的培训，具体香气参照样品如表1所示。

表1 香气属性的定义及参照

正式感官实验时，将15 mL 酒样倒入50 mL 品评杯中，递交给感官品评员，使用0～9 分打分标准对清雅型石湾玉冰烧白酒进行香气强度打分。

1.2.2 全二维气相色谱仪飞行时间质谱

1.2.2.1 前处理

（1）顶空固相微萃取。参考文献[16]并略作改进，将酒样酒精度加超纯水稀释至10 %（体积分数），振荡混匀。向20 mL 顶空瓶中依次加入1.5 g NaCl，5 mL 稀释后的酒样，用带有PTEE 蓝色硅胶隔垫的空心磁性金属盖密，之后采用MSP 2 进行顶空固相微萃取。50 ℃条件下样品平衡5 min，接着萃取45 min，结束后在GC 进样口解吸附5 min，进行全二维气相色谱飞行时间质谱的程序，条件不变运行平行样品3次。

（2）液液萃取。参考文献方法[17]并略作改进，向分液漏斗分别加入50 mL 酒样、200 mL 饱和食盐水以及150 mL（分三次萃取）二氯甲烷（色谱级），充分震荡5 min，取有机相。有机相中加入足量无水硫酸钠振荡除水后，放到-20 ℃冰箱中过夜，氮吹浓缩至500 μ L。

1.2.2.2 全二维气相色谱-飞行时间质谱条件[18]

二维气相色谱设置条件：进样口温度250 ℃，进样模式为1∶1 分流进样。样品以恒流模式运行，使用纯度大于99.9995%的氦气作为载气，设置氦气流速为1 mL/min。一维柱温箱升温程序：起始温度45 ℃，维持3 min 后，以4 ℃/min 升温至150 ℃，保持2 min；以6 ℃/min 升温至200 ℃；接着以10 ℃/min 升温至230 ℃并保持10 min。在整个过程中，二维烘箱的温度比一维烘箱高5 ℃，调制补偿温度为20 ℃。热脉冲时间为0.8 s，调制周期为4 s。

飞行时间质谱设置条件：无溶剂延迟。采用EI电离源，离子源电压设置为70 eV，传输线温度为240 ℃，离子源温度为230 ℃，检测器电压设置为1430 V。采集质量数范围为35～400 amu，采集频率为100 spectra/s。二维数据由LECO 公司ChromaTOF®工作站采集。

1.2.2.3 定性方法

使用仪器自带的ChromaTOF® 4.61.1.0 software（LECO Corporation）软件对采集的数据进行解析。一维保留时间偏差设置为12 s，二维保留时间偏差设置为0.2 s。自动识别信噪比大于200 的色谱峰，并自动解卷积和质谱库（NIST 2014）进行比对。从结果中选择相似度大于700 的化合物组分，删除柱流失过程中产生的化合物（含Si、金属元素），去除含卤族元素的化合物。在相同的色谱条件下，通过正构烷烃（C7—C30）来计算化合物的保留指数（retention index,RI），与前人研究中报道的进行比对，保留指数RI 相差50 以内的化合物作为定性结果。

2 结果与分析

2.1 清雅型石湾玉冰烧白酒的物质特征

由于白酒中含有的挥发性化合物超过2000种，这些物质具有不同的热稳定性、极性、溶解性、挥发性等性质，因此使用单一的前处理方式不能满足所有物质的提取[18]。为了更加系统地了解清雅型石湾玉冰烧中的挥发性化合物，本实验采用顶空相微萃取（Headspace Solid-Phase Microextraction，HS-SPME）和液液萃取（Liquid-Liquid Extraction，LLE）两种样品前处理方式，全面分析清雅型石湾玉冰烧酒中的挥发性化合物。

结果如表2 所示，采用HS-SPME 前处理，从清雅型石湾玉冰烧洞藏9 鉴定出270 种挥发性化合物，采用LLE 前处理方式，鉴定到234 种挥发性化合物。其中，有134 种化合物使用两种进样方式都可以检测到，有136 种物质仅能通过HS-SPME 进样检测到，有100 种物质仅能通过LLE 进样方式检测到。汇总两种前处理方式的定性结果，最终从清雅型石湾玉冰烧洞藏9 中鉴定出370 种挥发性化合物，使用多种前处理方式相结合可以更加全面地得到清雅型石湾玉冰烧白酒的潜在香气化合物。从检测结果上看，萜类、含氮类化合物以及芳香族化合物三类化合物对于某一类前处理方式的偏好明显。萜类化合物偏好HS-SPME 前处理方式，这可能与此类物质浓度低且不适用本研究中使用的萃取溶剂有关；含氮类化合物是一类在酒精饮料中含量低、香气影响大的化合物，在检测中仅有2 种含氮化合物是由HS-SPME 进样获得，其他13 种均由LLE 进样检测得到，这说明含氮类化合物更适用于有机溶剂萃取进样方法；芳香族化合物是一类含有苯环的香气物质，是香气研究中一类重要的化合物，共有15 种芳香族化合物是由HS-SPME 进样获取的，这可能和LLE选择的溶剂极性以及萃取过程中香气物质损失过大有关。

表2 HS-SPME和LLE定性挥发性化合物分类表

并不是所有挥发性化合物都具有香气特征，食品研究更加关注具有香气特征的香气化合物，因此通过检索文献与Flavornet、Flavor DB 等香气数据库进行比对[19]，最终从已经鉴定到的370 种挥发性化合物中筛选出245 种具有香气特征的化合物。其中包含酯类化合物68种，醇类化合物41种，醛类化合物34 种，酮类化合物17 种，酸类化合物12 种，醚类化合物2 种，萜类化合物（包括萜烯类，萜类衍生物）26 种，呋喃类化合物（呋喃类等）11 种，含氮类化合物（吡嗪类等）6 种，含硫类化合物4 种，酚类化合物4 种，内酯类化合物6 种、芳香族化合物9 种和其他类化合物5种（图1）。

图1 清雅型石湾玉冰烧白酒潜在香气化合物分类图

将潜在香气化合物根据其化合物结构和香气属性进行分类，绘制清雅型石湾玉冰烧的香气化合物分类图（图2）。由图2 可知，筛选出的香气化合物根据香气属性大致可以分成果香、花香、植物香、油脂香、烘焙香、香料等，清雅型石湾玉冰烧白酒的整体香气风格是由多种香气属性的化合物构成的。

图2 清雅型石湾玉冰烧白酒香气化合物分类及部分化合物结构图

在这245 种化合物中，酯类、醇类、醛酮类化合物的种类占比最多，这一结果与其他香型白酒的研究结果相同[20]。在以往的白酒香气研究中[21]，酯类物质对于整体香气轮廓具有重要的贡献。从清雅型石湾玉冰烧中检测到的酯类香气化合物的数量最多，其中半数为乙酯类物质，香气属性上多呈现愉悦的水果、花卉、甜等香气，极有可能对清雅型石湾玉冰烧白酒的整体香气具有重要影响。另外，检测到二元酸二乙酯类物质10 种，其中辛二酸二乙酯、庚二酸二乙酯、壬二酸二乙酯是国家标准《豉香型白酒》规定例行检验的指标之一[22]。醇类化合物数量在清雅型石湾玉冰烧白酒中也较多，且多数为饱和脂肪醇，常为酒体贡献花香、果香等风味，另外检测到烯醇类物质12 种，表现为青草、油脂、花卉等香气。醛类化合物中检测出不饱和烯醛14 种，这些烯醛的香气表现为青草、坚果、油脂等，可能是构成清雅型石湾玉冰烧白酒中油质香气的重要组分。Fan 等[23]发现反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、反-2-癸烯醛、反-2-十一烯醛和反-2,4-癸二烯醛是传统豉香型白酒中具有油脂风味的关键香气物质。在清雅型石湾玉冰烧白酒中，酸类物质的数量有17 种，且往往呈现汗臭、酸臭、奶酪等不愉悦的香气，但是这些酸却是酒精饮料中不可或缺的协调成分和呈味物质。呋喃类化合物具有低阈值、香气独特的香气特点，是许多天然食品的重要香气特征物质。在清雅型石湾玉冰烧白酒中检测到了较多的呋喃类化合物，表现为焦糖、坚果等香气特点。其中苯丙呋喃、2(5H)-呋喃酮被研究证明具有抗菌杀菌及抗炎抗癌等生理功效[24-25]。吡嗪类物质是白酒中一类具有强烈坚果、焦香、烘焙气味的香气化合物，同时具有多种生理健康功效。例如，检测到的2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪[26-27]均被研究证明具有抗氧化性，2,3,5,6-四甲基吡嗪也是一种具有药用功效的中药生物碱，其生理功效备受医学界关注[28]。检测到的内酯类化合物共11 种，主要表现为奶油、果香、坚果等浓烈的愉悦香气。从清雅型石湾玉冰烧白酒中还检测到了大量的萜类化合物，其香气贡献以草本、木质、花香为主。清雅型玉冰烧白酒在制曲过程中加入了甘草、茴香、肉桂叶等多种中草药，在先前的研究中，何张兰等[29]通过对肉桂叶原料的挥发性香气化合物进行分析，发现其中含有多种萜类化合物。因此清雅型石湾玉冰烧白酒中检测到的大量萜类化合物可能部分来源于酒曲中加入的中草药。萜类化合物的阈值低、香气愉悦且强度大，对清雅型石湾玉冰烧酒的整体香气特征也具有重要影响。除了香气贡献外，许多萜类物质也被证明具有多种生理功效，如4-萜烯醇、茴香脑、β-桉叶油醇等萜类化合物具有镇痛、抗菌、抗氧化[30-31]等生理效果。

2.2 清雅型石湾玉冰烧的感官特征

2.2.1 感官数据有效性检测

采用R 语言对感官小组进行的QDA 实验结果进行可靠性和有效性检测（表3）。表3 中，灰色区域的数值表示该项内容具有显著差异性（P＜0.05）。样品之间不同属性之间均具有显著差异，即感官品评员能够很好的区别出不同样品之间相同属性的强度差异。除了酸香和烘焙香气外，品评员和样品x 品评员对其他属性的香气强度评价并无明显差异，这说明感官品评员在香气属性强度上具有较为一致的评价，对同一样品香气属性强弱的感知也基本相同。重复，样品x 重复和品评员x 重复中均未出现显著差异值，这说明感官实验结果数据具有很好的重复性。因此，以上结果可以判断感官实验结果数据可靠且有效。

表3 R语言检验感官数据的有效性

在前期的描述词选择中，出现频率最高的8 个词作为正式感官实验的描述词，分别为油质、植物、花香、烘焙、果香、甜香、酸香和米香。根据感官品评员对样品各香气属性的打分，绘制出清雅型石湾玉冰烧白酒的香气轮廓图（图3）。通过全二维气相色谱-飞行时间质谱的鉴定结果发现，清雅型石湾玉冰烧酒中含31 种具有香气属性的醛类化合物。QDA 实验结果中，油质属性香气得分最高，结合全二维气相色谱-飞行时间质谱定性出的物质结果发现，多种醛类化合物可能是造成其油质类香气的重要物质，烯醛类化合物在豉香型白酒研究中被证明在脂肪类香气上具有重要作用[23]。植物香气和花香也是清雅型石湾玉冰烧白酒香气轮廓的重要组成，造成这一类香气的化合物包括醇类、饱和脂肪醛类、萜类化合物。在前期分析中可发现，清雅型石湾玉冰烧白酒中含有较多的萜类化合物，此类化合物的阈值低、香气强度大，可能是构成其植物香气的重要组分。烘焙香气在清雅型石湾玉冰烧白酒整体香气中也占了较为重要的一部分。在化合物定性过程中发现的较多呋喃类、吡嗪类化合物在食品中常常表现为烘焙、坚果等香气，这对酒体中烘焙香味具有重要影响。在前期检测出的多种类化合物中均存在甜味属性，因此，构成清雅型石湾玉冰烧中甜味感官的化合物类型暂时无法确定。由于清雅型石湾玉冰烧白酒的主要原料是大米和糯米，因此清雅型石湾玉冰烧白酒中与经典米香型白酒具有相同的米香香气。目前针对米香型白酒的米香构成仍未有准确定论，研究人员猜测是由乙酸苯乙酯、苯乙醇等具有蜂蜜香气的香气化合物形成。酯类物质是构成果香的代表性物质，在多种香型白酒的研究中，酯类都被认为是造成果香感官的主要化合物。二维检测中，酯类物质是清雅型石湾玉冰烧酒中鉴定出的种类最多的物质。但是在QDA 实验的结果中发现，果香属性虽存在，但是强度较低，因此可以推测，清雅型石湾玉冰烧白酒中的酯类物质浓度可能较低，造成了香气构成中果香属性强度较低的结果。

图3 清雅型石湾玉冰烧白酒感官评价雷达图

3 结论

采用全二维气相色谱-飞行时间质谱技术，从清雅型石湾玉冰烧白酒中检测到了370 种挥发性化合物，进一步确定了245 种具有香气属性的化合物，初步构建了清雅型石湾玉冰烧酒的香气信息库。筛选出具有香气属性的挥发性化合物数量最多的是酯类，其次是醇类、醛类、萜类以及酮类化合物。结合QDA 实验，确定了清雅型石湾玉冰烧白酒的整体香气轮廓主要由油质香、植物香、花香、烘焙香、甜香、米香、酸香构成，而这些属性的产生也与检测出的化合物的种类数量和香气属性特点大致相符。通过对清雅型石湾玉冰烧白酒化合物的分析和重要感官属性的确定，为今后深入研究清雅型石湾白酒香气提供了更多数据支持。