葡萄籽原花青素调控Nrf2/HO-1通路减弱多柔比星诱导的心脏毒性

吴敏 瞿怡倩 黄苏敏

摘要 目的：观察葡萄籽原花青素对多柔比星（DOX）诱导的心脏毒性以及核因子E2相关基因（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）通路的作用。方法：通过DOX构建小鼠急性心脏毒性模型，本实验分为对照组（正常小鼠）、葡萄籽原花青素组、DOX组、DOX＋葡萄籽原花青素组、DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组。超声心动图检查小鼠心功能；苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠心肌病理改变；原位末端标记测定法（TUNEL）检测小鼠心肌细胞凋亡情况；酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平；试剂盒检测心肌组织中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；蛋白质免疫印迹法（Western Blot）测定Nrf2/HO-1通路蛋白表达水平。结果：与对照组比较，DOX组小鼠心肌损伤加重，左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD），血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平及心肌组织ROS、MDA及心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05），射血分数（EF）、短轴缩短分数（FS）、心肌组织SOD、Nrf2、HO-1蛋白水平降低（P＜0.05）；葡萄籽原花青素组小鼠心肌损伤，LVESD、LVEDD、EF、FS水平，血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平，心肌组织ROS、MDA、SOD、Nrf2、HO-1蛋白，心肌细胞凋亡率差异均无统计学意义（P＞0.05）。与DOX组比较，DOX＋葡萄籽原花青组小鼠心肌损伤减轻，LVESD、LVEDD降低，血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平降低，心肌组织ROS、MDA、心肌细胞凋亡率降低（P＜0.05），EF、FS及心肌组织SOD、Nrf2、HO-1蛋白水平升高（P＜0.05）；与DOX＋葡萄籽原花青素组比较，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组小鼠心肌损伤加重，LVESD、LVEDD及血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平、心肌组织ROS、MDA、心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05），EF、FS、心肌组织SOD、Nrf2、HO-1蛋白水平降低（P＜0.05）。结论：葡萄籽原花青素可能通过激活Nrf2/HO-1通路，对DOX诱导的心脏毒性小鼠发挥保护作用。

关键词 葡萄籽原花青素；核因子E2相关基因；血红素加氧酶1；多柔比星；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.03.011

Grape Seed Proanthocyanidins Attenuates Doxorubicin-induced Cardiotoxicity by Regulating Nrf2/HO-1 Pathway

WU Min，QU Yiqian，HUANG Sumin

Nankai Traditional Chinese Medicine Hospital， Tianjin 300102， China， E-mail： 975350882@qq.com

Abstract Objective：To observe grape seed proanthocyanidins could alleviate doxorubicin（DOX）-induced cardiotoxicity and the role of nuclear factor E2-related gene（Nrf2）/heme oxygenase-1（HO-1） pathway on it.Methods：The mice model with acute cardiotoxicity was established by DOX，and the experiment was divided into the control group（normal mice），grape seed proanthocyanidin group，DOX group，DOX＋grape seed proanthocyanidin group，DOX＋grape seed proanthocyanidin＋ML385 group.Echocardiography was used to detect cardiac function in mice;hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological changes of myocardial cells in mice;the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） assay was used to detect the apoptosis of cardiomyocytes;enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to measure serum creatine kinase isoenzyme（CK-MB），interleukin-6（IL-6），and interleukin-1β（IL-1β） levels;The kit was used to detect reactive oxygen species（ROS），malondialdehyde（MDA），and superoxide dismutase（SOD） levels in myocardial tissue;Western Blot was used to determine the expression levels of Nrf2/HO-1 pathway proteins.Results： Compared with the control group，the myocardial injury of the mice in the DOX group aggravated;the left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end-systolic diameter（LVESD），serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，myocardial cell apoptosis rate increased（P＜0.05）;ejection fraction（EF），fractional shortening（FS），myocardial tissue SOD，Nrf2，and HO-1 protein levels decreased（P＜0.05）.In the seed proanthocyanidin group，the difference in myocardial injury，LVESD，LVEDD，EF，FS，serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，SOD，Nrf2，HO-1 protein，and cardiomyocyte apoptosis rate was not statistically significant（P＞0.05）.Compared with the DOX group，the myocardial injury of the mice in the DOX＋grape seed proanthocyanidin group alleviated;LVESD，LVEDD，serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，and myocardial cell apoptosis rate reduced（P＜0.05）;EF，FS，protein levels of SOD，Nrf2，and HO-1 in myocardial tissue increased（P＜0.05）.Compared with the DOX＋ grape seed proanthocyanidin group，myocardial injury in the DOX＋ grape seed proanthocyanidin＋ML385 group aggravated;LVESD，LVEDD，Serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，and myocardial cell apoptosis rate increased（P＜0.05）;EF，FS，myocardial tissue SOD，Nrf2，and HO-1 protein levels decreased（P＜0.05）.Conclusion：Grape seed proanthocyanidins may protect against DOX^-induced cardiotoxicity in mice by activating the Nrf2/HO-1 pathway.

Keywords grape seed proanthocyanidins;nuclear factor E2 related gene;heme oxygenase 1;doxorubicin;experimental study

基金项目 天津市科技发展计划项目（No.2018-HBCD-18）

作者单位 1.天津市南开区中医医院（天津 300102），E-mail：975350882@qq.com；2.上海市普陀区真如镇街道社区卫生服务中心

引用信息 吴敏，瞿怡倩，黄苏敏.葡萄籽原花青素调控Nrf2/HO-1通路减弱多柔比星诱导的心脏毒性［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（3）：464-469.

多柔比星（DOX）属于蒽环类药物，是应用较为广泛的化疗药物，对肿瘤组织有强大的杀伤作用，但其在杀伤肿瘤的同时也会对正常组织造成伤害，心脏是首当其冲的器官^［1-2］，保留DOX抗肿瘤作用并降低其心脏毒性是临床中亟待解决的问题之一。DOX造成心脏毒性的机制较为复杂，其通过提升心肌细胞氧化应激水平造成心肌细胞凋亡可能是原因之一^［3］。核因子E2相关基因（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）是在细胞氧化应激中发挥作用的关键通路之一，虎杖苷可通过激活此通路抑制氧化应激诱导的心肌细胞损伤^［4］；异甘草素可通过调控此通路抑制活性氧（ROS）的产生，对阿霉素诱导的胰腺炎发挥保护作用^［5］。因此，本研究从Nrf2/HO-1氧化应激通路入手寻求降低DOX所致心脏毒性的有效药物。葡萄籽中含大量原花青素，原花青素素是多酚类物质，可有效清除氧自由基，在心脑血管疾病中发挥防控作用，如葡萄籽原花青素可保护嗜铬神经瘤细胞（PCI2）免受过氧化氢诱导的损伤^［6］；还可通过降低氧化应激发挥对双酚A诱导的急性神经炎症雄性大鼠的神经保护作用^［7］。本研究通过构建DOX诱导的急性心脏毒性小鼠模型，探究葡萄籽原花青素对其的保护作用以及相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂

近交品系实验鼠（C57BL/6）小鼠60只，体质量20～25 g，购自吉林大学，许可证号：SYXK（吉）2021-0003，本研究经本院动物伦理委员会批准。葡萄籽原花青素（Y70767）购自上海源叶；Nrf2通路抑制剂ML385（S8790）购自selleck；肌酸激酶同工酶（CK-MB，ml037723）、白细胞介素-6（IL-6，ml063159）、白细胞介素-1β（IL-1β，ml301814）的酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自上海酶联；ROS（S0033S）、丙二醛（MDA，S0131S）、超氧化物歧化酶（SOD，S0101S）试剂盒购自上海碧云天；Nrf2（ab62352）、HO-1（ab52947）、GAPDH一抗（ab9485）、山羊抗兔IgG二抗（ab205718）购自美国Abcam。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的构建

给小鼠腹腔注射2.5 mg/kg的DOX，2周内注射6次，合计剂量为15 mg/kg，诱导心脏毒性模型^［8］。

1.2.2 实验分组及处理情况

60只C57BL/6小鼠随机分为对照组（正常喂养小鼠，饮食、饮水自由）、DOX组、葡萄籽原花青素（500 mg/kg）组^［9］、DOX＋葡萄籽原花青素组（造模成功后给予500 mg/kg的葡萄籽原花青素）、DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组（ML385剂量30 mg/kg）^［10］，每组12只。对照组和葡萄籽原花青素组给予腹腔注射10 mL/kg生理盐水，其余各组腹腔注射2.5 mg/kg DOX，2周内注射6次构建心脏毒性模型；其中葡萄籽原花青素组、DOX＋葡萄籽原花青素组每日给予500 mg/kg葡萄籽原花青素灌胃，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组每日灌胃500 mg/kg葡萄籽原花青素的同时腹腔注射30 mg/kg ML385，连续干预14 d。给药结束后，超声心动图检测各组小鼠心功能指标左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、射血分数（EF）、短轴缩短分数（FS）。

1.2.3 ELISA法检测小鼠血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平

各组小鼠心功能指标检测结束后，收集小鼠静脉血血清，按照血清CK-MB、IL-6、IL-1β各自试剂盒说明书进行操作，测定各项指标值。

1.2.4 苏木精-伊红（HE）染色检测小鼠心肌组织病理变化

取血完成后断头处死小鼠，分离小鼠心脏，修剪后制备石蜡切片，参照HE染色试剂盒说明书处理，封片后显微镜下观察各组小鼠心肌组织病理变化。

1.2.5 原位末端转移酶标记测定法（TUNEL）检测小鼠心肌细胞凋亡

收集制备的石蜡切片，脱蜡后通过TUNEL试剂盒进行TUNEL染色，并显微镜下计数，计算小鼠心肌细胞凋亡率，凋亡率（%）＝凋亡细胞（黄褐色）数/总细胞数×100%。

1.2.6 小鼠心肌组织ROS、MDA、SOD水平检测

取部分心脏组织，称量后制备10%心肌组织匀浆，离心（3 000 r/min，15 min）后收集上清液，按照试剂盒说明书测定小鼠心肌组织中ROS、MDA、SOD水平。

1.2.7 蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测Nrf2/HO-1通路蛋白

取部分小鼠心脏组织，匀浆后离心（12 000 r/min，15 min）得上清液，聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，封闭，加入稀释一抗Nrf2、HO-1（稀释均为1∶1 000，内参GAPDH稀释比为1∶5 000），4 ℃孵育24 h后，添加1∶5 000稀释比的二抗，用增强型化学发现试剂（ECL）显色液显色，分析Nrf2、HO-1蛋白表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件分析数据，符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x^-±s）表示，组间比较进行单因素方差分析，进一步两两组间比较行LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 葡萄籽原花青素对心脏毒性小鼠心功能的改善

与对照组比较，DOX组小鼠LVESD、LVEDD升高（P＜0.05），EF、FS降低（P＜0.05）；葡萄籽原花青素组LVESD、LVEDD、EF、FS差异无统计学意义（P＞0.05）；与DOX组比较，DOX＋葡萄籽原花青素组小鼠LVESD、LVEDD降低（P＜0.05），EF、FS升高（P＜0.05）；与DOX＋葡萄籽原花青素组比较，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组小鼠LVESD、LVEDD升高（P＜0.05），EF、FS降低（P＜0.05）。详见表1。

2.2 葡萄籽原花青素对心脏毒性小鼠CK-MB、IL-6、IL-1β水平的影响

与对照组比较，DOX组小鼠血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.05），葡萄籽原花青素组CK-MB、IL-6、IL-1β水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与DOX组比较，DOX＋葡萄籽原花青素组小鼠CK-MB、IL-6、IL-1β水平降低（P＜0.05）；与DOX＋葡萄籽原花青素组比较，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组小鼠CK-MB、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.05）。详见表2。

2.3 葡萄籽原花青素对心脏毒性小鼠ROS、MDA、SOD指标的影响

与对照组比较，DOX组小鼠ROS、MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05），葡萄籽原花青素组ROS、MDA、SOD水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与DOX组比较，DOX＋葡萄籽原花青素组小鼠ROS、MDA水平降低（P＜0.05），SOD水平升高（P＜0.05）；与DOX＋葡萄籽原花青素组比较，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组小鼠ROS、MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05）。详见表3。

2.4 葡萄籽原花青素对心脏毒性小鼠心肌病理的改善

对照组心肌细胞排列正常；DOX组心肌细胞存在水肿、破裂，细胞排列紊乱；葡萄籽原花青素组无明显变化；葡萄籽原花青素处理可改善DOX组小鼠心肌损伤程度；与DOX＋葡萄籽原花青素组比较，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组心肌损伤程度加深。详见图1。

2.5 葡萄籽原花青素对心脏毒性小鼠心肌细胞凋亡的影响

与对照组比较，DOX组小鼠心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05），葡萄籽原花青素组心肌细胞凋亡差异无统计学意义（P＞0.05）；与DOX组比较，DOX＋葡萄籽原花青素组小鼠心肌细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与DOX＋葡萄籽原花青素组比较，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组小鼠心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05）。详见图2、表4。

2.6 葡萄籽原花青素激活心脏毒性小鼠心肌组织Nrf2/HO-1通路

与对照组比较，DOX组小鼠心肌组织表达Nrf2、HO-1蛋白表达水平降低（P＜0.05），葡萄籽原花青素组心肌组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与DOX组比较，DOX＋葡萄籽原花青素组小鼠心肌组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与DOX＋葡萄籽原花青素组比较，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385组小鼠心肌组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平降低（P＜0.05）。详见图3、表5。

3 讨 论

DOX引发的心脏毒性是阻碍其发挥抗肿瘤作用的原因，探究其引发心脏毒性的机制并寻求有效防治药物是研究方向。DOX诱导的心脏毒性机制包括对心肌细胞肌小节结构的破坏^［11］、氧化应激导致的心肌细胞凋亡^［12］、自噬^［13］等。

本研究从氧化应激角度进行探讨，通过腹腔注射DOX构建小鼠急性心脏毒性模型，小鼠LVESD、LVEDD明显升高，EF、FS明显降低，即模型小鼠心功能下降；CK-MB、IL-6、IL-1β水平较正常小鼠明显升高，提示模型小鼠心肌损伤、炎症水平升高；ROS、MDA水平的升高与SOD水平的下降提示小鼠心肌氧化应激水平升高；HE染色与TUNEL染色结果显示模型小鼠心肌水肿、破裂，细胞排列紊乱、凋亡率升高，心脏损伤加剧，由此表明，DOX可引发心脏毒性。

DOX产生的副作用为产生过量细胞内ROS，过量的氧化剂（自由基）在体内游离会破坏DNA与组织，产生心脏毒性，但ROS反映的下游分子信号转导发挥着更关键的作用^［14］。Nrf2是内源性抗氧化剂，可与抗氧化原件结合，激活抗氧化酶的基因表达，其受ROS调控，Nrf2是HO-1的诱导剂之一，在氧化应激状态下可发挥对HO-1的调控作用^［15］。正常状态下Nrf2与Keap1相互作用保持低转录状态活性，但受ROS等氧化应激刺激下解离，进入细胞核，启动HO-1等抗氧化基因的转录^［16］。姜黄素可剂量依赖性地减少人鼻腔成纤维细胞ROS的生成，并促进Nrf2/HO-1通路激活^［17］；没食子酸通过激活弹性蛋白酶诱导的肺气肿大鼠Nrf2/HO-1/核转录因子（NF）-κB通路，抑制氧化应激与炎症^［18］；丁酸可通过激活Nrf2通路激活抗氧化途径减轻大鼠神经功能缺损^［19］；激活Nrf2/HO-1通路可保护缺氧诱导的心肌组织损伤^［20］。以上研究均说明Nrf2/HO-1通路在抗氧化应激损伤中发挥积极作用。

原花青素是一种天然抗氧化剂，葡萄籽中原花青素含量丰富，是由儿茶素、没食子酸、表儿茶素组成的多聚体，其多羟基结构使其拥有高抗氧化作用。方欢乐等^［21］研究显示，葡萄籽原花青素可降低D-半乳糖致衰老模型肝组织、血液、皮肤组织中MDA水平，并提高SOD水平，对大鼠肝脏的病理状态有改善作用；云少君等^［22］研究显示原花青素对铁过量引起的大鼠肾脏铁超载、氧化损伤及细胞凋亡发挥保护作用；本研究中，原花青素可改善DOX引发的心功能损伤，降低CK-MB、IL-6、IL-1β、ROS、MDA水平、心肌细胞凋亡率，而原花青素对正常小鼠心功能、氧化应激、心肌酶谱等无作用，提示原花青素可改善DOX引发的小鼠氧化应激、炎症反应、心肌损伤。DOX诱导的心肌组织Nrf2、HO-1水平降低，经原花青素处理后小鼠心肌组织Nrf2、HO-1水平升高；提示原花青素对DOX诱导的小鼠心脏毒性的保护作用，可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。在原花青素处理基础上增添Nrf2抑制剂，抑制Nrf2激活，此心脏毒性的保护作用被削弱，进一步提示葡萄籽原花青素可能通过激活Nrf2/HO-1通路发挥对DOX诱导的心脏毒性小鼠发挥保护作用。

综上所述，葡萄籽原花青素可能通过激活Nrf2/HO-1通路，对DOX诱导的心脏毒性小鼠发挥保护作用，但本研究仍存在一定局限性，有待今后研究补充体外实验进一步验证。

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（收稿日期：2022-03-28）

（本文编辑 王雅洁）