复方罗布麻颗粒UPLC特征图谱及6个成分含量测定△

傅咏梅，卢伟玲，王欢，黄后楷，陈静，车轸潮，罗锦波，梁砚康

国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528303

复方罗布麻颗粒是由罗布麻叶、菊花、山楂经提取制备而成，具有清热、平肝、安神功效，可用于治疗高血压、神经衰弱引起的头晕、心悸、失眠等。其君药罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetumL.的干燥叶[1]。研究表明，罗布麻叶具有降血压、降血糖、调血脂等作用[2-4]，有效成分多为黄酮类成分，如金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素等[5-6]。目前，复方罗布麻颗粒试行标准中仅测定金丝桃苷和总黄酮含量[7]，还有研究测定复方罗布麻颗粒中槲皮素含量[8-10]或所含菊花的木犀草苷含量[9]等，整体研究较少，不易全面控制复方罗布麻颗粒的质量。国家药典委员会于2013 年8 月13日公示了“关于2010 年版《中国药典》（一部）增补本品种及药品标准提高修订公示”附件24 复方罗布麻颗粒质量标准公示稿，对该品种质量标准进行了提升，但《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版仍未收录该品种。因此，本研究在参考罗布麻叶、菊花、山楂配方颗粒指纹图谱和罗布麻叶黄酮类成分含量测定等质量标准研究[10-14]的基础上，采用超高效液相色谱法（UPLC），选取了不同饮片来源制备的15 批复方罗布麻颗粒，建立了复方罗布麻颗粒的特征图谱，同时对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷进行了含量测定，可为全面、有效地控制复方罗布麻颗粒的质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

AB135-S 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；BT124S 型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；HH-8 型恒温水浴锅（常州市忆能实验仪器厂）；JM-30D-40 型超声清洗仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；ACQUITY UPLC H-Class Plus 型超高效液相色谱仪、H-Class Plus-PDA型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）。

1.2 试药

对照品金丝桃苷（纯度：94.9%，批号：111521-201809）、异槲皮苷（纯度：97.2%，批号：111809-201804）、绿原酸（纯度：96.3%，批号：110753-202119）、木犀草苷（纯度：96.6%，批号：111720-202111）、4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸（纯度：95.1%，批号：111894-202104），对照药材罗布麻叶（批号：120979-201906）、菊花（批号：121384-201805）、山楂（批号：121138-201206）均购于中国食品药品检定研究院；对照品新绿原酸（纯度：99.5%，批号：D23GB172337，上海源叶生物科技有限公司）；对照品隐绿原酸（纯度：98.0%，批号：3208，上海诗丹德标准技术服务有限公司）；乙腈为色谱纯（美国Honeywell公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

按中药制剂质量标准研究要求自制的15 批复方罗布麻颗粒所用饮片来自不同厂家，均由国药集团广东环球制药有限公司王欢主管中药师鉴定，且经本单位检测中心按《中国药典》2020 年版要求检验合格，饮片信息见表1。

表1 复方罗布麻颗粒饮片信息

2 方法与结果

2.1 样品制备

不同产地饮片随机组合为15 批复方罗布麻颗粒，按国药集团广东环球制药有限公司复方罗布麻颗粒现行质量标准（YBZ13042004）制备15 批浸膏，取浸膏加糊精及矫味剂适量，混匀，制成颗粒，干燥即得。

2.2 色谱条件

Waters CORTECS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；以乙腈为流动相A、0.1%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0～7 min，6%～12%A；7～11 min，12%～13%A；11～17 min，13%～15%A；17～20 min，15%～19%A；20～25 min，19%～30%A；25～28 min，30%～60%A；28～33 min，60%～75%A）；流速为0.33 mL·min-1；检测波长为360 nm；柱温为30 ℃；进样量为1 μL；理论板数以金丝桃苷色谱峰计＞6000。

2.3 供试品溶液制备

精密称取研细后的本品颗粒约2.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min（250 W，40 kHz），放冷，再用70%甲醇补减失的质量，摇匀，0.22 μm 滤过，取续滤液，即得。

2.4 混合对照品溶液制备

分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷对照品适量，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为29.651、176.807、36.652、58.980、58.369、51.391 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.5 对照药材溶液制备

分别取罗布麻叶对照药材1.0 g、菊花对照药材0.5 g 和山楂对照药材0.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水15 mL，加热回流提取1 h，放冷，滤过，滤液置25 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 滤过，取续滤液，分别作为对照药材溶液。

2.6 复方罗布麻颗粒特征图谱的建立

2.6.1 精密度试验 取同一份复方罗布麻颗粒样品，按2.2项下条件连续进样6次。以绿原酸色谱峰为参照峰，计算14 个特征峰与参照峰的相对保留时间、相对峰面积，相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1.0%，说明所用仪器的精密度良好。

2.6.2 稳定性试验 取同一份复方罗布麻颗粒样品，在0、3、6、9、15、24、30 h 分别进样分析，以绿原酸色谱峰作为参照峰，计算14 个特征峰与参照峰的相对保留时间、相对峰面积，相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于1.8%，表明供试品溶液在30 h内具有较好的稳定性。

2.6.3 重复性试验 取同一批（S8）复方罗布麻颗粒样品6 份，平行制备后按2.2 项下条件进样分析，以绿原酸色谱峰作为参照峰，计算14 个特征峰与参照峰的相对保留时间、相对峰面积，相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于1.2%，说明本方法具有较好的重复性。

2.6.4 中间精密度试验 与2.6.3 项下不同的操作人员取同一批复方罗布麻颗粒样品（S8）6 份，平行制备后在不同时间、不同超高效液相色谱仪上测定分析，以绿原酸色谱峰作为参照峰，计算14 个特征峰与参照峰的相对保留时间、相对峰面积，相对保留时间和相对峰面积RSD 均小于2.2%；中间精密度试验制备的6 份供试品溶液和重复性试验制备的6 份供试品溶液中，14 个特征峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积RSD 均小于3.0%，说明本方法具有较好的中间精密度。

2.6.5 特征图谱 15 批（S1～S15）复方罗布麻颗粒制备后按2.2 项下条件进样分析，其色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）软件，得到15 批样品的特征图谱及对照特征图谱（图1）。3 味对照药材特征图谱见图2。比对发现，2 号峰（绿原酸）归属于罗布麻叶、菊花、山楂，1、3～5 号峰（新绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷）归属于罗布麻叶、山楂，6 号峰（木犀草苷）归属于菊花，8～11 号未知峰归属于罗布麻叶，12 号峰（4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸）及7、13、14号未知峰归属于菊花。从上述结果可以发现，对复方罗布麻颗粒特征图谱影响较大的药材是罗布麻叶和菊花，山楂对其影响较小。

图1 15批复方罗布麻颗粒UPLC特征图谱及对照特征图谱

图2 罗布麻叶、菊花、山楂对照药材特征图谱

2.6.6 复方罗布麻颗粒特征图谱的相似度分析 分析15 批复方罗布麻颗粒样品的色谱图，与对照特征图谱比较得到其相似度结果，S1～S15 相似度分别为0.993、0.965、0.992、0.979、0.991、0.990、0.975、0.988、0.960、0.967、0.995、0.993、0.991、0.991、0.991，相似度均大于0.95，可知15批不同饮片来源的复方罗布麻颗粒相似度良好。

由于绿原酸含量最高、峰形对称、与相邻峰的分离度也符合要求，因此选取绿原酸峰作为参照峰，计算15 批样品14 个特征峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积。15 批样品的14 个特征峰与参照峰的相对保留时间RSD分别为0.1%、0、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.1%、0.2%、0.2%、0.2%、0.1%，相对峰面积RSD分别为22.2%、0、18.1%、11.2%、16.5%、32.8%、33.8%、8.9%、21.9%、16.4%、30.4%、21.8%、35.3%、37.4%。从相对峰面积RSD 结果可知，15 批复方罗布麻颗粒的化学组分大体相同，但特征峰的具体含量存在一定差异。

2.7 复方罗布麻颗粒中6个成分的含量测定

2.7.1 系统适用性试验 将复方罗布麻颗粒样品溶液、对照品溶液按2.2 项下条件分析测定，色谱图见图3。由图3 可知，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷与各相邻峰间的分离度均大于1.5，以金丝桃苷色谱峰计，理论板数＞6000。

图3 混合对照品溶液及复方罗布麻颗粒供试品溶液UPLC图

2.7.2 线性关系考察 精密称取新绿原酸对照品5.96 mg、绿原酸对照品36.72 mg、隐绿原酸对照品7.48 mg、金丝桃苷对照品12.43 mg、异槲皮苷对照品12.01 mg、木犀草苷对照品10.64 mg 置100 mL量瓶中（以此时各对照品质量浓度为200%计），分别稀释成5 种质量浓度的混合对照品溶液，进样分析，测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的峰面积。以混合对照品质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），分别对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷进行线性回归分析，绘制标准曲线，结果见表2。由表2 可知，在一定质量浓度范围内6 个成分线性关系均良好。

表2 复方罗布麻颗粒线性关系考察结果

2.7.3 稳定性试验 取同一份复方罗布麻颗粒样品溶液，按2.2 项下条件分别在0、3、6、9、15、24、30 h 进样分析，测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的峰面积。结果显示，6个成分的峰面积RSD分别为1.8%、1.5%、1.9%，1.5%、1.3%、1.6%，表明在30 h 内复方罗布麻颗粒样品溶液具有良好的稳定性。

2.7.4 重复性试验 按2.3 项下条件平行制备复方罗布麻颗粒样品溶液（S8）6 份，进行测定，结果显示，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的平均含量分别为2.5、16.5、3.4、5.3、6.6、6.1 mg/袋，其RSD 分别为1.5%、1.0%、1.2%、0.3%、0.4%、0.7%，表明本方法的重复性较好。

2.7.5 中间精密度试验 与2.7.4 项下不同的操作人员取同一批次的复方罗布麻颗粒样品（S8）6 份，平行制备后在不同时间、不同的超高效液相色谱仪上测定分析，结果显示，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的平均含量分别为2.5、16.6、3.5、5.4、6.6、6.1 mg/袋，其RSD 分别为1.8%、1.3%、1.1%、0.8%、0.7%、1.0%；中间精密度试验制备的6 份供试品溶液和重复性试验制备的6 份供试品溶液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的平均含量分别为2.5、16.6、3.4、5.3、6.6、6.1 mg/袋，其RSD 分别为1.7%、2.0%、2.1%、1.1%、1.3%、1.5%，表明本方法的中间精密度较好。

2.7.6 加样回收率试验 精密称取同一批复方罗布麻颗粒样品（S8），以含量测定分析方法中的样品测定质量浓度为100% 计，设计50%、100%、150% 3 种质量浓度，每种质量浓度分别制备3 份进行测定分析，结果见表3。结果显示，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的平均回收率分别为99.9%、100.8%、99.9%、97.6%、101.1%、100.6%，其RSD 分别为1.8%、1.4%、1.9%、0.9%、0.8%、1.8%，表明该方法加样回收率良好。

表3 复方罗布麻颗粒样品加样回收率结果

2.7.7 含量测定 分别精密称取15 批复方罗布麻颗粒样品，每个样品平行取2份，按2.2项下条件对各样品中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷含量进行测定，结果见表4。

表4 复方罗布麻颗粒含量测定结果 mg/袋

2.7.8 测定结果系统聚类分析 将15 批复方罗布麻颗粒样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的含量数据导入SPSS 20.0 软件进行系统聚类分析，分析方法采用组间联接和平方欧氏距离，结果见图4。当平方欧氏距离为15 时，15 批样品可以分为4 类，S1、S3 聚为第1 类，S7、S8 聚为第2 类，S2、S9～S10 聚为第3类，S4～S6、S11～S15聚为第4类。结合15 批样品所用罗布麻叶、菊花、山楂饮片信息分析，聚为第1类、第2 类、第3 类的几批样品的3 味饮片产地均相同，说明相同产地的饮片含量差异较小，制得的复方罗布麻颗粒样品中6 个成分的含量差异也较小；第4 类的8 批样品所用3 种饮片的产地不尽相同，说明不同产地的饮片也可能存在含量差异较小的情况，相应的样品中6 个成分含量差异较小；不同产地的3 种饮片制得的15 批样品中，6 个成分含量系统聚类分析聚为4 类，再结合15 批样品新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的含量RSD 分别为22.2%、9.1%、18.2%、9.7%、10.1%、27.3%，差异较大，说明本研究中自制的15批样品具有代表性。

图4 15批复方罗布颗粒含量结果聚类分析

3 讨论

3.1 样品的收集

目前，虽然获得复方罗布颗粒生产批文的厂家有6 家，但近年来仅有吉林紫鑫药业股份有限公司和国药集团广东环球制药有限公司有产品在市场流通，且仅能收集到1 批吉林紫鑫药业股份有限公司的样品（批号：210901），所以本研究所用的15 批样品为国药集团广东环球制药有限公司制备。

3.2 供试品溶液的制备

采用单因素法，以新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的总含量作为考察指标，选取了超声提取和加热回流提取2种方法进行比较，结果超声提取和加热回流提取时含量接近，RSD＜3%，考虑到方法的简便性，故选择超声提取法进行提取。在此基础上，分别选择50%甲醇、70%甲醇、甲醇作为提取溶剂进行超声处理，根据含量测定结果选择70%甲醇。在70%甲醇超声提取的基础上，又考察了超声时间（20、30、40 min）和超声功率（250、450、600 W），结果显示，超声时间和超声功率对新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的总含量影响较小，最终选择250 W超声提取30 min。

3.3 色谱条件的选择

考察了不同流动相（0.09% 磷酸水溶液、0.10%磷酸水溶液、0.11%磷酸水溶液）、检测波长（256、280、320、360 nm）、流速（0.30、0.33、0.35 mL·min-1）及柱温（25、30、35、40 ℃），结果显示，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液、检测波长为360 nm、流速为0.33 mL·min-1、柱温为30 ℃时色谱的各项指标较好。

4 结论

分析15 批复方罗布麻颗粒的含量测定结果发现，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷的总含量均在35 mg/袋以上，可在此基础上制定复方罗布麻颗粒的含量限度，以控制其质量。目前，复方罗布麻颗粒试行标准中含量测定评价指标相对单一，且对其特征图谱研究较少。本研究建立了可以同时测定其特征图谱和新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草苷含量的UPLC 方法，可以定性、定量控制复方罗布麻颗粒的质量。该方法灵敏度高、重复性好，可为复方罗布麻颗粒质量的科学全面评价提供参考。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。