基于生物信息学探讨犀角地黄汤治疗银屑病的作用机制❋

张 冰,李建伟,刘学伟,沈萃萃,何 英

(河南中医药大学第一附属医院,郑州 450000)

银屑病是一种免疫介导的多基因遗传性皮肤病,临床主要表现为丘疹、红斑、脓疱、鳞屑等皮肤损害,同时可伴有瘙痒、灼痛、关节痛等特征,给患者的社会和私人生活带来较大困扰,有的患者甚至出现精神抑郁、焦虑等症状,导致总体生活质量低下[1]。流行病学调查显示全世界范围内银屑病的成人患病率为0.51%至11.43%,儿童患病率则为0%至1.37%[2],近年来其患病率及发病率呈持续上升趋势,给社会和家庭带来很大的负担[3]。银屑病病因病机复杂,与遗传、环境及免疫应答异常等因素相关[4]。诸多研究发现炎症反应在银屑病的发病过程中发挥着重要作用[5-6]。林玲等[7]发现T细胞为主的免疫细胞浸润、促炎因子释放等诱导炎症反应,导致了银屑病的发生发展。活化的角质形成细胞可释放趋化因子和细胞因子参与炎症反应,进而维持银屑病皮损[8]。也有研究发现中医不同证候银屑病患者血清中细胞因子的表达存在差异[9]。目前研究报道银屑病的发病过程与众多细胞因子、趋化因子及其参与炎症反应有关,但未对其特征基因进行筛选,并缺乏系统分析和总结。

中医药治疗银屑病历史悠久,疗效确切,但作用机制尚待进一步研究。筛选与银屑病炎症反应相关的特征基因、有针对性地抑制特征基因的表达可能是银屑病治疗的有效选择。犀角地黄汤作为治疗银屑病的经典方剂,是否存在具有减轻银屑病炎症反应作用的中药成分以及相关的作用靶点值得探索[10]。本研究通过生物信息学方法筛选出银屑病炎症反应相关特征基因,并通过网络药理学方法预测犀角地黄汤中作用于银屑病炎症相关特征基因的成分,以期为后续的基础研究提供新的切入点,为临床研究提供参考和依据。

1 材料和方法

1.1 数据库和软件

本研究所使用的数据库有：GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)、UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)、GSEA数据库(http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)、中药系统药理学TCMSP数据库与分析平台(https：//tcmsp-e.com/)、TCMID数据库(http：//www.megabionet.org/tcmid/)、swissdock数据库(http：//www.swissdock.ch/)、蛋白质数据库PDB(http：//www.rcsb.org/)和pubchem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。数据分析主要使用R语言4.1.2,主要使用了“WGCNA”“clusterprofiler”“ggpubr”“Glmnet”“limma”及“pROC”等R包。

1.2 银屑病基因表达数据获取及差异基因分析

使用“Psoriasis”为检索词检索GEO数据库,筛选包含银屑病皮损及正常对照的数据集2组,其中1组作为训练组,另1组作为验证组。使用R语言中“limma”包对表达矩阵进行标准化处理和差异基因分析,设置|log2FC|≥1.5和校正P<0.05进行筛选,得出银屑病的差异基因并绘制火山图和热图。

1.3 炎症相关基因提取

以“inflammatory response”为检索词检索GSEA数据库,得到与炎症反应最相关的基因集,再与上述步骤中的差异基因取交集,得到银屑病差异表达的炎症相关基因(differentially expressed inflammation-related genes, DEIRGs),作为中药干预的靶点并进行后续分析。

1.4 基因本体论 (gene ontology, GO) 和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析

为分析银屑病DEIRGs潜在的生物学功能,使用R语言“clusterprofiler”包将步骤1.3得到的DEIRGs进行GO和KEGG富集分析,以P<0.05为过滤阈值筛选出最相关的GO条目和KEGG通路。

1.5 加权基因共表达网络分析(weighted geneco-expression network analysis,WGCNA)

首先对基因表达矩阵进行标准化处理,后使用R语言中“WGCNA” 包和“limma”包进行WGCNA,分别进行样本聚类,剔除离群样本,构建无尺度网络和拓扑重叠矩阵,动态模块分析及合并,找到与临床信息相关性最强的基因模块,最后以基因与模块相关性>0.8、基因重要性>0.5为过滤条件,在与临床信息相关性最强的基因模块中筛选出核心基因。

1.6 最小绝对值收敛和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)回归筛选特征基因及验证

将得到的银屑病DEIRGs与核心模块基因取交集得到银屑病核心炎症反应基因,通过LASSO回归筛选出与银屑病发生高度相关的特征炎症基因。然后,通过对验证组绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)评价LASSO回归筛选特征基因的准确性和模型的准确性。

1.7 犀角地黄汤活性成分和靶点的筛选

以中药名为检索词检索TCMSP、TCMID数据库,根据口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(drug likeness,DL)≥0.18或Lipinski五规则和Veber原则筛选候选活性成分及其对应靶点。使用Uniprot数据库对靶点进行标准化处理。

1.8 药物-炎症反应交集靶点及有效作用成分筛选

将得到的银屑病DEIRGs与中药作用靶点取交集得到中药作用于炎症反应的靶点,并得出起作用的有效成分和中药。

1.9 分子对接

从Pubchem数据库获取中药有效作用成分的结构文件作为配体,从PDB数据库获取中药作用于炎症反应交集靶点的蛋白结构作为受体。将对应的配体和受体导入swissdock数据库进行分子对接,并计算结合能。

2 结果

2.1 数据集与差异基因分析结果

在GEO数据库检索得到GSE14905和GSE13355这2个包含银屑病皮损和正常对照的数据集,GSE14905包含21个正常对照和33个银屑病皮损样本,GSE13355包含64个正常对照和58个银屑病皮损样本。本研究使用GSE14905作为训练组,获取银屑病炎症反应特征基因并进行相关分析,使用GSE13355作为验证组验证特征基因的准确性。经差异基因分析,GSE14905共有560个差异基因,其中344个上调基因,216个下调基因,见图1。

a.火山图;b.热图

2.2 银屑病DEIRGs获取结果

在GSEA数据库中,下载炎症相关基因集(ID号为M5932),使用该基因集与差异基因取交集,共得到20个银屑病炎症反应差异基因,分别为肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)、水通道蛋白(aquaporin,AQP)9、C-C趋化因子配体(C-C motif chemokine ligand, CCL)20、CCL22、C-C趋化因子受体(C-C chemokine receptor type,CCR)7、C-X-C基序趋化因子(C-X-C motif chemokine,CXCL)10、CXCL9、凝血因子Ⅲ(coagulation factor Ⅲ,F3)、白细胞介素( interleukin,IL)-6、IL-7R、CXCL8、干扰素调节因子(interferon regulatory factor, IRF)7、溶酶体相关膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein, LAMP)3、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, LCK)、Lck/Yes相关新型蛋白酪氨酸激酶(Lck/Yes-related novel protein tyrosine kinase,LYN)、N-myc相互作用因子(N-myc-interactor,NMI)、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein,NOD)2、P2Y嘌呤受体(P2Y purinoceptor,P2RY)2、受体转运蛋白(receptor-transporting protein,RTP)4、滋养层糖蛋白(trophoblast glycoprotein,TPBG)。并将它们作为中药干预银屑病炎症反应的潜在靶点基因。

2.3 GO和KEGG富集分析结果

银屑病炎症差异基因的GO富集分析结果显示,共富集到779个条目,其中生物过程(biological process,BP)707条,细胞组分(cell components,CC)21条,分子功能(molecular function,MF)51条。主要与细胞趋化性、细胞因子介导的信号通路、质膜外侧、内吞囊泡、趋化因子活性、趋化因子受体结合等有关,见图2a。KEGG富集分析结果显示,共映射出37条通路,主要与病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、Toll样受体信号传导途径、IL-17信号通路和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路等有关,见图2b。

a.GO富集分析;b.KEGG富集分析

2.4 WGCNA分析结果

WGCNA分析结果显示,数据集GSE14905的最佳软阈值β=16,因此本研究选择软阈值16构建加权基因共表达网络,见图3a。基于最佳软阈值分步构建基因模块和共表达矩阵网络,并通过动态混合剪切得到6个以热图呈现基因模块与临床数据相关性的结果,对应的颜色分别为black、red、blue、brown、green、grey,见图3b。选择与银屑病皮损最显著相关的brown模块,将brown模块中满足模块相关性>0.8、基因显著性>0.5标准的基因定义为银屑病核心基因,共筛选出483个基因,见图4,并用于下一步分析。

a.软阈值图;b.模块聚类图

a.银屑病炎症差异基因的基因模块与样本特征相关性;b.brown模块中基因显著性与模块相关散点图

2.5 核心炎症反应基因筛选结果

将得到的20个银屑病炎症反应差异基因与WGCNA筛选出来的483个核心基因取交集,得到9个银屑病核心炎症反应基因,分别为CXCL10、F3、IRF7、LAMP3、NMI、NOD2、P2RY2、RTP4和TPBG,见图5。将此9个银屑病核心炎症反应基因作为候选特征基因。

图5 银屑病炎症反应差异基因与WGCNA核心基因韦恩图

2.6 LASSO回归筛选特征基因及验证组验证结果

提取候选特征基因的表达量建立LASSO回归模型,共得出6个与银屑病发病高度相关的炎症反应基因,分别为CXCL10、F3、NMI、P2RY2、RTP4和TPBG,见图6a、b、c。使用GSE13355作为验证组,通过ROC曲线评估特征基因及LASSO回归模型预测的准确性。结果表明各个基因的曲线下面积(area under curve,AUC)均>0.9,见图6c。LASSO回归模型的AUC为1,见图6d,表明该模型准确性较高,CXCL10、F3、NMI、P2RY2、RTP4和TPBG在银屑病发病及炎症反应过程中发挥了重要作用。

a.交叉验证曲线图;b.系数路径图;c.图为不同基因的ROC曲线及其AUC数;d.LASSO回归模型的AUC为1

2.7 网络药理学分析结果

网络药理学分析结果显示,犀角地黄汤中赤芍有29种活性成分,生地黄有8种活性成分,水牛角有5种活性成分,牡丹皮有11种活性成分,这些活性成分共对应216个靶点。将靶点标准化后与银屑病炎症反应差异基因取交集,得到交集靶点4个,见图7,分别为CXCL8、IL-6、F3和CXCL10。进一步解析发现,赤芍中的有效成分鞣花酸(ellagic acid)可作用于CXCL8,芍药苷(paeoniflorin)可作用于IL-6;牡丹皮中的有效成分栎精(quercetin)可作用于CXCL8、IL-6、F3和CXCL10。本研究重点关注银屑病炎症反应基因,最终得出的作用靶点和成分较少,故未进行中药复方调控网络图的绘制。

图7 犀角地黄汤中药物靶点与银屑病炎症靶点韦恩图

2.8 分子对接结果

分子对接结果显示,鞣花酸与CXCL8结合能为-7.25 kcal/mol,芍药苷与IL-6结合能为-8.08 kcal/mol,栎精与 CXCL8结合能为-7.35 kcal/mol,栎精与IL-6结合能为-7.15 kcal/mol,栎精与F3结合能为-7.47 kcal/mol,栎精与CXCL10结合能为-6.94 kcal/mol,各结合能均小于-6.9 kcal/mol,表明配体和受体均能较好结合,见图8。

注：a.代表栎精与CXCL8;b.代表栎精与IL-6;c.代表栎精与F3;d.代表栎精与CXCL10;e.代表鞣花酸与CXCL8;f.代表芍药苷与IL-6

3 讨论

银屑病的发病机制复杂,至今尚未完全阐明。具体机制涉及遗传、免疫等领域,与角质形成细胞异常表达、T淋巴细胞功能失常、微生物生态失调、皮肤屏障功能受损以及持续存在的炎症反应等有关[11-12]。本研究通过生物信息学方法分析GSE14905基因数据集,共筛选出560个差异基因,包含344个上调基因和216个下调基因,得到了20个银屑病炎症反应差异基因。GO富集分析表明银屑病炎症差异基因涉及多个生物学过程,如细胞趋化性、细胞因子介导的信号通路、质膜外侧、内吞囊泡、趋化因子活性、趋化因子受体结合等。KEGG富集分析主要涉及病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、Toll样受体信号转导途径、IL-17信号通路、TNF信号通路等。这些基因主要参与免疫异常应答(包含G蛋白偶联体受体结合,细胞因子受体结合,趋化因子受体结合等)、皮肤屏障功能破坏(包含质膜外侧,内吞囊泡等构成皮肤的结构成分)和生物功能调节(包含细胞因子介导的信号通路,细胞趋化性,趋化性的调节等)。其中,银屑病炎症反应差异基因CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL20、Lck可能是趋化T淋巴细胞介导免疫反应维持银屑病皮损发展的关键因素[13-16]。细胞趋化因子参与了银屑病全身炎症的发展,如CCR7、CXCL10等趋化因子可能在银屑病性关节炎的发生发展中起着重要作用[17-19]。T细胞中的CD4+、CD8+淋巴细胞在银屑病中的作用已经明确,而CD4+辅助细胞Th1、Th2、Th17亚群分泌的细胞因子与银屑病关节炎、银屑病年龄、持续时间、皮损面积及银屑病甲等密切相关。Th17细胞分泌的IL-17 在银屑病的发展中起着至关重要的作用,它能够刺激角质形成细胞并促进树突状细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23等细胞因子,致T细胞进一步分化和活化后驱动银屑病炎症发生[20-21],IL-17家族中的IL-17A已被证明是银屑病及其关节炎发病的重要参与者[22]。因此,银屑病皮损及关节炎的发生发展与趋化因子及免疫介导的炎症反应密切相关。

通过WGCNA分析和LASSO 回归筛选出与银屑病发生高度相关的6个特征炎症基因,分别为CXCL10、F3、NMI、P2RY2、RTP4和TPBG。ROC曲线显示各个基因的AUC面积均>0.9,LASSO回归模型的AUC为1。这些基因与银屑病的免疫异常应答及皮肤屏障功能受损密切相关。CXCL10在6个特征炎症基因中相关度最高,研究表明,CXCL10在银屑病患者的病变皮肤和血清中均呈上调状态,它能够吸引辅助性Th1细胞,通过促进T细胞趋化和黏附特性在炎症反应中发挥重要作用[23]。一项研究发现,NMI广泛参与了细胞因子信号传导,而且NMI与PI3、IRF9、IFIT1基因组成的基因簇在女性银屑病患者的皮损组织和血浆样本中呈正相关和差异共表达,这可能是银屑病的特异性生物标志物[24]。P2RY2基因的表达产物P2Y2受体已被既往研究证实参与了人类角质形成细胞的增殖,P2Y2受体的细胞外核苷酸是调控角质形成细胞生长和分化的重要因素[25]。此外,本研究还发现F3、RTP4和TPBG也参与了银屑病的相关炎症反应,这揭示了银屑病的潜在发病机制并为诊断提供了新的生物标志物。

在犀角地黄汤中药成分的网络药理学分析中,发现赤芍的有效成分鞣花酸可作用于CXCL8,芍药苷可作用于IL-6;牡丹皮中的栎精可作用于CXCL8、IL-6、F3和CXCL10。研究显示,鞣花酸可高效抑制银屑病发病关键靶点热休克蛋白(heat shock protein, HSP)70-1[26]。芍药苷可显著降低银屑病患者外周血单核细胞中IL-17、干扰素(interferon,INF) -γ、IL-6和TNF-α等炎症细胞因子的mRNA表达[27]。栎精可通过降低血清中TNF-α、IL-6和IL-17的表达,抑制核因子(nuclear factor,NF)-κB信号通路并改善机体的抗氧化和抗炎状态,从而发挥治疗银屑病的作用[28]。这些中药的有效成分均可作为治疗银屑病的潜在药物,具有广阔的研究前景。除了已知的作用靶点外,本研究还发现鞣花酸和栎精可共同作用于CXCL8,而栎精也可作用于本研究前期筛选出的特征炎症基因F3和CXCL10,这表明,牡丹皮中的栎精可能是通过影响这些炎症相关基因来减轻银屑病炎症。

本研究还存在一些不足之处。首先,由于GEO数据库里满足研究条件的样本较少,本研究纳入分析的样本有限;其次,网络药理学是药物研究的一种新模式[29],其内容是基于现有的数据库开展研究,因为这些数据库存在不完善之处,可能会对研究结果产生一定的影响;最后,本研究利用生物信息学和WGCNA的方法挖掘出6个银屑病相关炎症特征基因,并采用外部数据验证了其诊断效能,但后续仍需要动物或细胞实验进行验证。综上所述,本研究明确了6个与银屑病高度相关的炎症反应特征基因,这些基因可能成为治疗银屑病的潜在靶点。本研究还探讨了这些基因的功能和可能涉及的信号通路,为探索银屑病的发生机制提供了参考。通过网络药理学研究,本研究发现治疗银屑病的经典方剂犀角地黄汤中的鞣花酸、芍药苷和栎精可能是治疗银屑病炎症的潜在药物,这为从炎症角度应用中医药治疗银屑病提供了思路。