醒神通督针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的作用研究❋

兰 瑞,邹旭欢,马云枝,付雪琴,王漫漫,王玮玮,张 勇

(1.河南中医药大学第一附属医院,郑州 450000,2.河南中医药大学,郑州 450000,3.郑州大学第三附属医院,郑州 450000)

脑卒中属中医学“中风病”范畴,是我国居民死亡和长期残疾的主要原因,对家庭和社会造成了沉重的精神负担和经济负担[1]。缺血性脑卒中是脑卒中的重要类型,可导致脑梗死、永久性脑损伤、神经功能缺损等问题,尽快恢复脑组织灌注以减少缺血损伤是急性期发病的主要治疗目的[2],然而组织缺血或缺氧后血液供应恢复会导致活性氧大量生成,进而使脑组织氧化损伤进一步加重,该过程被称为脑缺血再灌注损伤[3]。研究表明,炎症反应、氧化应激损伤、自噬和凋亡等参与了脑缺血再灌注损伤的发病过程[4-5]。

针刺在缺血性脑卒中的治疗中发挥着重要的作用。督脉是与脑关系最为密切的经脉,如《难经·二十八难》云“督脉者,起于下极之俞,并于脊里,上至风府,入属于脑”,提示针刺督脉经穴可以治疗头部诸疾。头为“诸阳之会”,督脉“总督诸阳”,为“阳经之海”,故疏通督脉经气能够达到醒脑调神、治疗脑卒中的功效。醒神通督针刺选用的穴位为百会、四神聪、足三里,临床应用率较高,且易操作,安全性好。前期课题组实验研究发现针刺“百会”“四神聪”可抑制缺血缺氧实验大鼠海马组织的细胞凋亡,上调胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达水平[6]。本研究旨在探讨醒神通督针刺是否通过介导脑缺血再灌注损伤后自噬而发挥神经保护作用,进一步明确其作用机制。研究方案经河南中医药大学第一附属医院实验动物福利伦理委员会审查批准,编号：YFYDW2017015。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠购自河南省实验动物中心,体质量230～250 g,动物许可证号：SCXK (豫) 2017-0001。大鼠饲养于河南省实验动物中心动物房,室温(24±2)℃,湿度(55±5)%,12 h：12 h黑暗/光照循环,自由进食、饮水。

1.2 主要试剂

氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)购自美国Sigma公司,货号T8170;微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(coiled coil moesin like BCL2 interacting protein, Beclin-1)、自噬相关蛋白(autophagy related protein, Atg)12、蛋白激酶B (protein kinase B, PKB,又称Akt)及磷酸化Akt (phosphorylated Akt, p-Akt)、GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司,货号分别为12741、3495、4180、4060、9272、5174;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)-山羊抗兔二抗、Cy3标记山羊抗兔二抗与凝胶配制试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,货号分别为A0208、A0516、P0012A。

1.3 主要仪器

SIGMA 3-18K型超速低温离心机,美国Sigma-Aldrich公司;164-5070蛋白垂直电泳仪、170-4070转印仪、170-8265凝胶图像系统,美国B1O-RAD公司;Ti-E荧光显微镜,日本Nikon公司。

1.4 分组与造模

适应性喂养1周后,将所有大鼠分为假手术组、脑缺血再灌注模型组(简称模型组)和脑缺血再灌注+醒神通督针刺组(简称针刺组)。模型组、针刺组大鼠参照课题组先前报道的方法建立脑缺血再灌注损伤模型[7-8]。大鼠深度麻醉后固定于操作台,颈部正中偏左切开皮肤,充分暴露颈总动脉后分离颈内动脉、颈外动脉。结扎颈外动脉的远心端,动脉夹夹闭颈总动脉、颈内动脉近心端,从颈外动脉近心端剪开一V字小口,将1根3.0 mm尼龙丝线从颈外动脉插入颈内动脉,深度约19 mm,结扎。90 min后缓慢退出部分丝线以恢复血流。假手术组大鼠进行动脉分离但不插入线栓。大鼠苏醒后出现对侧前爪不能伸展或向对侧旋转或倾倒,则视为造模成功,纳入后续研究。造模成功后假手术组纳入20只,模型组、针刺组各纳入24只大鼠。

1.5 针刺方法

针刺组大鼠造模前5 d开始进行针刺干预直至造模后24 h,其余2组大鼠只抓取不针刺。针刺穴位选择“百会”“四神聪”“足三里”,参考《实验针灸学》[9]进行穴位定位。“百会”：两耳连线与前后中线交点;“四神聪”：百会前后左右各旁开约2 mm;“足三里”：膝关节后外侧腓骨小头下约5 mm。皮肤消毒后,持华佗牌0.25 mm×15 mm针灸针,“百会”“四神聪”平刺5 mm,“足三里”直刺7 mm,每次留针30 min,日1次,10 min行针1次,施平补平泻手法1 min。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 脑梗死面积观察 再灌注24 h后,每组取6只大鼠麻醉、断头取脑,-20 ℃冰冻15 min行冠状切片,于1% TTC溶液中37 ℃避光孵育15 min,浸泡于固定液中24 h后拍照。参考文献报道的方法按照公式[(梗死面积/总面积)×100%]计算脑梗死面积百分比[3]。

1.6.2 缺血皮层神经元自噬亚显微结构观察 再灌注24 h后,每组各取3只大鼠麻醉,先后心脏灌注0.9%氯化钠溶液、2.5%戊二醛溶液。取缺血皮层1 mm3大小的组织6～8块,置于2.5%戊二醛溶液中固定,送至电镜室进行样本处理,透射电镜下观察神经元自噬结构。

1.6.3 Western blot检测缺血皮层Beclin-1、LC3、Atg12、Akt与 p-Akt表达 再灌注24 h后,每组各取6只大鼠麻醉,提取新鲜的脑缺血皮层组织总蛋白并检测其浓度。蛋白变性后经凝胶电泳分离蛋白,转膜。5%脱脂牛奶封闭2 h,加入Beclin-1(1：1 000)、LC3(1：1 000)、Atg12(1：1 000)、Akt(1：1 000)、p-Akt(1：1 000)、GAPDH抗体(1：1 000)4 ℃孵育过夜,洗膜后,与HRP偶联二抗(1：2 000)孵育90 min,再次洗膜后,滴加增强型化学发光液(enhanced chemiluminescence, ECL),在凝胶成像分析系统中显影,分析目标条带灰度值。

1.6.4 免疫荧光检测缺血皮层LC3表达 再灌注24 h后,每组各取3只大鼠麻醉,心脏灌注固定,取出脑组织制作冰冻切片(片厚8 μm)。脑组织切片室温静置15 min,10%山羊血清封闭1 h, LC3(1：500)一抗4 ℃孵育过夜,次日经洗片后滴加荧光二抗(1：800)避光孵育90 min,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色后甘油封片,荧光显微镜下观察拍照。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠脑梗死面积比较

图1、表1提示,假手术组大鼠未出现脑梗死,模型组大鼠在大脑中动脉供血区可见明显梗死区域(P<0.05);与模型组比较,针刺组大鼠梗死区域面积显著下降(P<0.05)。

注：氯化三苯基四氮唑(TTC),白色部分为梗死区域;A.假手术组;B.模型组;C.针刺组

表1 各组大鼠脑梗死面积比较

2.2 各组大鼠缺血皮层自噬亚显微结构比较

图2示,假手术组大鼠透射电镜下可见缺血皮层神经元细胞膜,核膜连续,线粒体、内质网等细胞器亚显微结构正常,染色质均匀,自噬体较少。模型组大鼠可见缺血皮层神经元胞外及胞内均肿胀,线粒体密度减少,嵴断裂,胞质内可见大量的自噬泡及自噬体,丰富的溶酶体,还可见被降解的线粒体。针刺组大鼠缺血皮层神经元胞外可见轻度水肿,细胞器如线粒体轻微肿胀,基质密度接近正常,自噬体、溶酶体数量较少。

注：透射电镜图(A～C 2 μm,D～F 200 nm);假手术组(A,D);模型组(B,E);针刺组(C,F)

2.3 各组大鼠缺血皮层脑组织Beclin-1、LC3、Atg12蛋白表达比较

图3、表2与图4示,模型组大鼠缺血皮层脑组织Beclin-1、Atg12蛋白表达及LC3Ⅱ/I比值较假手术组显著升高(P<0.05),针刺组大鼠缺血皮层脑组织Beclin-1、Atg12表达及LC3Ⅱ/I比值较模型组明显降低(P<0.05)。

注：肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin-1),自噬微管相关蛋白1轻链3(LC3),自噬相关蛋白12(Atg12) ;假手术组(Sham);模型组(IR);针刺组(Acu)

注：红色标记自噬微管相关蛋白1轻链3(LC3),蓝色标记细胞核;假手术组(Sham);模型组(IR);针刺组(Acu)

表2 各组大鼠缺血皮层脑组织Beclin-1、LC3、Atg12蛋白表达

2.4 各组大鼠缺血皮层脑组织p-Akt、Akt蛋白表达比较

图5、表3示,与假手术组比较,模型组大鼠缺血皮层脑组织p-Akt表达显著下降(P<0.05)。与模型组比较,针刺组大鼠缺血皮层脑组织p-Akt蛋白表达显著上调(P<0.05)。各组大鼠缺血皮层脑组织Akt蛋白表达比较差异无统计学意义。

注：蛋白激酶B(PKB,又称Akt),磷酸化Akt (p-Akt);假手术组(Sham);模型组(IR);针刺组(Acu)

表3 各组大鼠大脑缺血皮层脑组织Akt、p-Akt蛋白表达比较

3 讨论

针刺治疗缺血性脑卒中的记载可追溯至《黄帝内经》,历代医家总结了丰富的治疗经验,临床证据显示,针刺配合中药口服可显著改善缺血性脑卒中患者的肢体运动功能[10],明显促进患者大脑病灶侧初级运动区-健侧初级运动区功能连接[11]。此外临床研究还发现,针刺可改善缺血性脑卒中患者失眠、抑郁状态、便秘等[12-14]。实验研究证实,针刺可通过改善脑部的血流量、抑制氧化应激损伤和炎症反应、减少凋亡与自噬发生、减轻脑水肿形成、调节神经递质活动、促进神经修复与再生等方面多靶点、多途径治疗缺血性脑卒中[15]。

缺血性脑卒中患者多因脏腑阴阳失调,气血逆乱,清窍闭阻而出现神志不清、肢体痿软、语窍不通等症状。督脉起于胞中,上至巅顶,总督一身之阳,因其循行路线和功能的特殊性,督脉穴位常被用来针刺以治疗该病。百会为百脉之会,通达全身经穴。前后神聪与百会均位于督脉,左右神聪旁及足太阳膀胱经,可通达阳气、醒神开窍。足三里位于足阳明胃经,可升发阳气、鼓舞脾胃,是临床治疗缺血性脑卒中患者肢体障碍的必选要穴。三穴联用可达到醒脑开窍、通督调中等功效。实验选用上述穴位进行研究发现,针刺“百会”“四神聪”“足三里”后大鼠脑梗死面积显著缩小,提示针刺可减少脑缺血再灌注损伤。

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程,其中坏死、凋亡和自噬是重要的神经细胞死亡形式,参与脑缺血后神经元损伤的机制[16]。自噬通过吞噬损坏的蛋白或细胞器,与溶酶体融合形成自噬溶酶体降解细胞内容物,维持细胞内环境的稳定。自噬由自噬泡的发生、自噬体的形成、自噬溶酶体形成和自噬体降解[17]等4个步骤组成,最终实现代谢需要和细胞器的更新[18]。自噬过量或不及均可对神经元的存活产生不利影响[19-20]。研究发现,针刺预处理通过抑制自噬过程减轻脑缺血再灌注损伤[21]。此外,针刺已被证明可通过雷帕霉素靶蛋白复合物 (mechanistic target of rapamycin complex,mTORC) 1-unc-51样自噬激活激酶 (unc-51 like autophagy activating kinase,ULK) 1复合物-Beclin-1途径抑制自噬和自噬体形成,发挥抗脑缺血再灌注损伤作用[22]。多项研究发现,磷脂酰肌醇-3-激酶 (phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/Akt信号通路参与细胞增殖、代谢与存活,Akt是PI3K信号通路下游蛋白,被磷酸化激活,参与调节脑缺血再灌注诱导的自噬[23-24]。自噬的过程受到严格管控,多种蛋白参与其中,Beclin-1、LC3、Atg12是自噬的关键蛋白,Beclin-1与PI3K相互作用可触发自噬,参与自噬体和溶酶体融合的相关步骤[17],Beclin-1促进自噬蛋白定位到自噬泡[25-26]。Atg5参与自噬泡中吞噬细胞膜延伸,与Atg12形成组成型的复合物进而形成自噬体[27]。LC3与自噬体膜结合形成完整的自噬体,然后与溶酶体融合并降解[28]。LC3分为细胞质型(LC3I)和膜型(LC3Ⅱ),LC3Ⅱ与自噬体膜的增多成正比,被认为是自噬体的标志蛋白[29]。目前自噬相关研究以LC3Ⅱ/I比值评估自噬水平[30]。透射电镜是研究神经元亚显微结构及自噬最直接的检测方法之一。研究结果显示,假手术组大鼠缺血皮层神经元亚显微结构正常,自噬结构较少;模型组大鼠缺血皮层神经元亚显微结构破坏,胞外及胞内均出现严重肿胀,自噬被激活,出现大量典型的自噬体、自噬空泡、溶酶体;而针刺组大鼠缺血皮层神经元结构较正常,细胞的自噬体、溶酶体较少。结果提示针刺能够有效调控脑缺血再灌注后自噬的活化。随后的免疫印迹、免疫荧光检测结果表明,针刺治疗“百会”“四神聪”“足三里”可以显著上调p-Akt的表达水平,下调Beclin-1、Atg12蛋白的表达及LC3Ⅱ/LC3I比值。故推测醒神通督针刺可能通过抑制自噬来发挥神经保护作用。

综上所述,针刺具有抗脑缺血再灌注损伤作用,其作用机制可能通过抑制自噬发生来实现,后续将应用通路抑制剂进一步对自噬的相关信号转导通路进行研究和验证,以期为针刺治疗缺血性脑卒中提供更多的实验证据。