益气解毒方对12 Gy60Coγ射线诱导的支持细胞铁死亡的防护作用及机制研究❋

庄鑫丽,姜荟茜,徐旻灏,叶一帆,徐文慧,王 安,王 磊,王舒冉,赵章弟,张文彦,张淑静,胡素敏

(北京中医药大学,北京 100029)

据世界卫生组织统计,全球有近15%的育龄夫妇受不孕不育问题的困扰,其中男性因素占50%[1]。由于睾丸组织对放射线非常敏感,长期接触放射线的男性出现生殖障碍的概率更高[2]。放射线会造成曲细精管的各级生精细胞和支持细胞损伤,影响精子的生成,造成男性不育[3]。支持细胞是曲细精管内唯一与生精细胞直接接触的体细胞,为精子发生提供物理支撑、稳定的微环境以及营养支持[4],保证精子发生的正常有序进行,一旦受损必然影响精子发生。近年来有研究显示,电离辐射可引发一种新型、依赖活性氧和铁的调节性细胞死亡形式——铁死亡[5-6]。本课题组前期研究表明,放射线会引起小鼠睾丸组织氧化损伤,诱导铁死亡发生,导致生精功能障碍[7]。课题组前期研究表明益气解毒方对上述损伤有很好的防护作用。那么,放射线是否诱导睾丸支持细胞发生铁死亡?益气解毒方是否能干预支持细胞的铁死亡?为明确以上两个问题,本文以小鼠睾丸支持细胞为切入点展开研究,以期为进一步探讨该方防治睾丸辐射损伤的潜在分子机制奠定基础。本实验经北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审核通过,编号：BUCM-4-20211120301-4085 。

1 材料

1.1 动物与细胞

5～6周龄SPF级SD大鼠40只,雄性,体质量(170±10)g,由斯贝福(北京)生物公司提供,动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。所有大鼠饲养于北京中医药大学动物房,温度(23±2)℃,湿度(50±10%),动物自由摄食饮水。

TM4细胞(正常小鼠支持细胞)购自国家实验细胞资源共享平台,细胞编号为：1101MOU-PUMC000298。

1.2 药物与试剂

益气解毒方由黄芪30 g、马齿苋15 g、枸杞子10 g 、当归6 g、茯苓12 g、白芍10 g、西洋参6 g、淫羊藿10 g等组成,饮片均购自北京同仁堂有限公司,并由北京中医药大学中医学院中药教研室老师鉴定,符合《中华人民共和国药典》规定[8]。

胎牛血清(依科赛生物科技有限公司,货号：FND500);DMEM/F12培养基(美国Invitrogen公司,货号：C11330500BT);胰蛋白酶消化液(北京索莱宝科技有限公司,货号：T1300);细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8, CCK-8)试剂盒(北京翱擎生物科技有限公司,货号：AQ308-500t);Erastin(美国APExBIO公司,货号：B1524);Liproxstatin-1 (美国Selleck生物科技有限公司,货号：S7699);高迁移率族蛋白B1 ( high mobility group protein box-1, HMGB1) ELISA试剂盒(武汉云克隆生物科技有限公司,货号：SEA399Mu);活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒,JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司,货号：S0033S,C2006);铁离子比色法检测试剂盒,蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司,货号：E1042,P1511);总RNA小量抽提试剂盒(广州美基生物科技有限公司,货号：R4111-02);逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司,货号：K1622);实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒(苏州近岸蛋白质科技股份有限公司,货号：E096-01A)。

1.3 仪器

循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸公司,型号：SHB-Ⅲ),CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司,型号：Heracell Vios 160i),台式高速冷冻离心机( 德国 Eppendorf 公司,型号：5424R),BioTek Epoch全波长酶标仪(美国BioTeK公司,型号：Epoch2C),荧光酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司,型号：Varioskan LUX ),正倒置一体荧光显微镜(美国 Echo 公司,型号：Echo Revolve),超微量紫外可见分光光度计(杭州遂真生物技术有限公司,型号：F-2100 ),T100梯度PCR仪(美国 Bio-Rad 公司,型号：T100 Thermal Cycler),RT-qPCR扩增仪(美国 Bio-Rad 公司,型号：CFX96 ) 。

2 方法

2.1 含药血清制备

益气解毒方水煎液制备方法与本课题组前期制备方法一致[9],参考《药理实验方法学》[10],将人用药剂量换算成大鼠等效剂量。所有药材洗净后加10倍水量浸泡1 h,武火煮沸后文火继续煮1 h,滤出第一次药液。药渣继续加8倍水量煎煮,步骤同第一次煎药液,将两次药液混匀,继续加热浓缩至原药材为1～2 g/mL。药液静置冷却后缓慢加入无水乙醇至乙醇浓度为60%,4 ℃冰箱静置24 h,减压抽滤药液,回收乙醇,最终得到生药浓度为1.044 g/mL的药液。因前期研究发现益气解毒方中、低剂量组对生殖系统辐射损伤的防护效果优于高剂量组[11-12],所以本实验选用了效果较好的两个剂量进行研究。本次实验高剂量益气解毒方给药量为人体临床等效剂量,生药浓度为1.044 g/mL,低剂量益气解毒方给药量为人体临床等效剂量0.5倍, 生药浓度为0.522 g/mL。

SD大鼠适应性饲养10 d,随机分为空白组和益气解毒方高、低剂量组,空白组20只,给药组各10只。空白组灌胃去离子水,益气解毒方高、低剂量组分别灌胃高、低剂量中药复方悬液,给药剂量为1 mL/100 g,连续灌胃5 d。末次给药后30 min,麻醉大鼠,腹主动脉取血,将采血管于室温静置4 h后,离心,取血清,同组混合分装至离心管中,于56 ℃水浴锅中30 min灭活,经0.22 μm微孔过滤膜除菌,将含药血清于-20 ℃冻存备用。

2.2 细胞培养、分组及造模

本研究选用铁死亡激动剂(erastin)作为阳性对照组,铁死亡抑制剂(liproxstatin-1, Lip-1)作为阳性药对照组。激动剂及抑制剂制备方法：将 Erastin和Lip-1分别溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),再用无血清培养基稀释成所需浓度。

支持细胞培养于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培养基中,置于含有5%CO2的37 ℃培养箱中,后续取对数生长期的支持细胞用于实验。细胞分组及处理如下：空白(negative Control, NC)组：支持细胞+空白组大鼠血清;模型(ionizing Radiation, IR)组：支持细胞+IR+空白组大鼠血清;益气解毒方高剂量(YQJD-H)组：支持细胞+IR+益气解毒方高剂量含药血清;益气解毒方低剂量(YQJD-L)组：支持细胞+IR+益气解毒方低剂量含药血清;铁死亡激动剂(Erastin)组：支持细胞+空白组大鼠血清+Erastin,照射前4 h加入 Erastin,使 Erastin的终浓度为 5 μmol/L;铁死亡抑制剂(Lip-1)组：支持细胞+IR+空白组大鼠血清+Lip-1,照射前4 h加入 Lip-1,使 Lip-1的终浓度为 0.2 μmol/L。

造模方法与本课题组前期研究一致[12],除空白组和铁死亡激动剂组的支持细胞外,其余各组细胞都使用12 Gy60Coγ射线进行一次性照射,照射剂量率为1 Gy/min。

2.3 细胞活性检测

消化细胞后,将密度调整至8×104/mL,接种于96孔板中,每孔100 μL,6 个复孔/组。接种后24 h按照2.2中的方法复制支持细胞辐射损伤模型,在照射24 h后,加入CCK8溶液,10 μL/孔,继续孵育2 h。孵育结束后,使用酶标仪测定在450 nm处的吸光度,并按照CCK8说明书计算细胞存活率。

2.4 荧光酶标仪检测支持细胞ROS水平

将DCFH-DA探针用无血清培养基按1：1 000的比例稀释至10 μmol/L。细胞按照8×104/mL的密度接种于12孔板中,每孔1 mL,6个复孔/组。分组处理后,消化细胞,调整细胞密度为2×105/mL,收集于1.5 mL离心管中,用无血清培养基洗涤2次,重悬于稀释好的DCFH-DA悬液,于37 ℃培养箱中避光孵育20 min,每隔5 min颠倒混匀一次,让细胞充分接触探针。孵育结束后,细胞用无血清培养基洗涤3次,最后重悬于500 μL的无血清培养基中,取100 μL重悬液移入黑色的96孔板,荧光酶标仪设定激发波长为488 nm,发射波长为525 nm,测定荧光强度,荧光强度直接反映了细胞内的ROS水平。

2.5 铁离子比色法试剂盒检测支持细胞二价铁离子(Fe2+)水平

将支持细胞按照8×104/mL的密度接种于6孔板内,每孔2 mL,每组设6个复孔,经分组处理后,去除培养基,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤2次,吸弃PBS。每孔加入200 μL 裂解液裂解细胞,置于摇床裂解2 h后,取25 μL裂解液用BCA法检测蛋白浓度,根据BCA标准曲线计算出样本浓度,再加入不同体积的裂解液调整至样本浓度一致,每个样本取100 μL裂解液于1.5 mL离心管中,加入100 μL混合液A(按说明书配制),混匀,于60 ℃水孵育1 h,再加入30 μL铁离子检测剂,混匀,室温孵育30 min,取上述混合液体200 μL于96孔板,在550 nm波长处测定吸光度,绘制标准曲线并计算铁离子浓度。

2.6 ELISA检测细胞上清液 HMGB1水平

将细胞按照 8×104/mL 的密度接种于24孔板中,每组设6个复孔。细胞经分组处理后,于照射后24 h吸取细胞培养液。严格按照HMGB1检测试剂盒说明书进行操作,应用酶标仪在450 nm波长处读板,检测细胞上清液中HMGB1水平。

2.7 JC-1试剂盒检测线粒体膜电位

将细胞按照 8×104/mL 的密度接种于24孔板中,每孔0.5 mL,3个复孔/组。细胞经分组处理后,吸除培养液,用无菌PBS清洗。每孔加入0.25 mL 无血清培养基和0.25 mL的JC-1染色工作液,混匀,于培养箱中避光孵育20 min。孵育结束后,吸除上清液,用配制好的JC-1缓冲液洗涤2次,再加入0.5 mL的无血清培养基,在荧光显微镜下观察、拍照,并用Image J软件分析平均荧光强度。

2.8 RT-qPCR检测铁死亡相关mRNA的表达水平

细胞以8×104/mL接种于6孔板中,每孔2 mL。分组处理后采用总RNA小量抽提试剂盒说明书操作提取总RNA。检测RNA浓度及纯度,结果中A260/280的取值在1.9～2.1之间,说明提取的RNA纯度高,可以用于后续实验。每个RNA样本取3 μg用于逆转录,按逆转录试剂盒说明书配制20 μL的逆转录体系,逆转录条件：42 ℃孵育60 min,70 ℃孵育5 min,终止反应。进行扩增,扩增体系：SYBR 10 μL,上下游引物各 0.4 μL,cDNA 2 μL,无酶水7.2 μL;扩增条件：95 ℃变性5 min,95 ℃循环10 s,55 ℃循环30 s,循环40次。本实验选取GAPDH作为内参,2-△△Ct表示目的基因相对定量,引物序列见表1。

表1 铁死亡相关基因引物序列

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 益气解毒方对12 Gy60Coγ射线辐射后支持细胞活力的影响

与NC组比较,Erastin组和IR组细胞活力显著下降(P<0.01);与IR组比较,Lip-1组、YQJD-H组、YQJD-L组的细胞活力均显著提高(P<0.01)。结果见图1。

注：与NC组比较**P<0.01;与IR组比较##P<0.01;空白(NC)组;模型(IR)组;铁死亡激动剂(Erastin)组;铁死亡抑制剂(Lip-1)组;益气解毒方高剂量(YQJD-H)组;益气解毒方低剂量(YQJD-L)组

3.2 益气解毒方对12 Gy 60Coγ射线辐射后支持细胞ROS、Fe2+、HMGB1水平的影响

与 NC组比较,IR组ROS、Fe2+、HMGB1水平均显著升高 (P<0.01),趋势与Erastin组一致。与IR组比较,Lip-1组、YQJD-H组、YQJD-L组的ROS、Fe2+、HMGB1水平均降低(P<0.01)。与YQJD-H组比较,YQJD-L组ROS、Fe2+、HMGB1水平升高(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组支持细胞的ROS、Fe2+、HMGB1水平

由于益气解毒方高、低剂量组含药血清均对辐射后的支持细胞活力降低及ROS、Fe2+、HMGB1水平升高具有明显的防护作用,且高剂量益气解毒方的防护作用比低剂量益气解毒方更显著(P<0.05),因此本研究在后续实验中仅选用益气解毒方高剂量组作为益气解毒方组的代表剂量进一步研究。

3.3 益气解毒方对12 Gy 60Coγ射线辐射后支持细胞线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位的异常改变不仅是线粒体损伤的重要标志,也是铁死亡发生的早期预警[13]。JC-1染色表明,与NC组比较,Erastin组和IR组细胞线粒体JC-1聚合物降低,红色荧光减弱(P<0.01),线粒体膜电位降低。与IR组比较,Lip-1组和YQJD-H组支持细胞的线粒体膜电位均显著提高(P<0.01)。结果见图2、表3。

注：空白(NC)组;模型(IR)组;铁死亡激动剂(Erastin)组;铁死亡抑制剂(Lip-1)组;益气解毒方高剂量(YQJD-H)组

表3 各组支持细胞的线粒体膜电位相对荧光强度

3.4 益气解毒方对 12 Gy60Coγ射线辐射后支持细胞铁死亡相关mRNA表达水平的影响

与NC组比较,IR组和Erastin组的GPX4 mRNA表达水平显著降低(P<0.05);IR组的ACSL4和 LPCAT3 mRNA 水平显著升高(P<0.05);而Erastin组的ACSL4和LPCAT3 mRNA 水平呈升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。与 IR 组比较,Lip-1组GPX4、ACSL4和LPCAT3 mRNA表达水平均呈升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。与 IR 组比较,YQJD-H组的GPX4 mRNA表达水平显著升高(P<0.05);ACSL4和LPCAT3 mRNA 水平显著降低(P<0.05)。结果见图3。

注：与NC组比较*P<0.05;与IR组比较#P<0.05;空白(NC)组;模型(IR)组;铁死亡激动剂(Erastin)组;铁死亡抑制剂(Lip-1)组;益气解毒方高剂量(YQJD-H)组

4 讨论

近半个世纪以来,男性精液质量以及男性生育率的下降趋势十分明显[14-15],而电离辐射是导致男性不育的重要原因之一。放射线可引起睾丸生精功能损伤,使精子发生出现异常。精子发生的过程离不开支持细胞,支持细胞为各级生精细胞提供了重要的骨架支撑以及营养物质,并且能够通过紧密连接形成血睾屏障,为精子发育提供必要的微环境[4]。研究表明,电离辐射作用于生殖系统,不仅会造成生精细胞的损伤,也会导致支持细胞变性、坏死、破坏其紧密连接结构,进而破坏生精微环境,不利于精子的生成[16-17]。课题组前期研究表明,电离辐射可严重损伤由支持细胞紧密连接构成的血睾屏障,使生精功能受损[18],且生精功能的这一损伤与铁死亡密切相关[7]。

铁死亡是一种在形态、生化方面有特征性变化的细胞死亡方式,主要生化特征为Fe2+水平升高、ROS聚积,形态特征为线粒体萎缩、外膜破裂、嵴减少或消失[19]。线粒体是细胞内产生ROS的主要场所,当细胞内Fe2+含量升高时,会通过芬顿反应产生大量ROS,导致线粒体损伤、膜电位下降[20],并使细胞处于氧化应激状态,诱发脂质过氧化反应,对细胞结构产生严重破坏,致使细胞大量死亡。HMGB1是细胞内高度保守的核蛋白,能够由细胞发生铁死亡后所释放,被认为是铁死亡中的关键作用分子[21-22]。研究表明,ROS累积能够促进HMGB1从细胞核易位到细胞质,从而促进HMGB1的分泌,进一步促进细胞铁死亡[23]。本研究发现,12 Gy60Coγ射线照射后,支持细胞的细胞活力及线粒体膜电位降低,而Fe2+、ROS及HMGB1水平均显著升高,上述指标的变化趋势均与铁死亡诱导剂Erastin的作用结果一致,且能被铁死亡抑制剂Lip-1所抑制,提示电离辐射导致了支持细胞铁死亡的发生。

调控铁死亡的通路有很多,其中Xc-/GPX4通路是主要的发生途径之一。GPX4是铁死亡通路的中心调控因子,能够抑制细胞的过氧化,保护其免受铁死亡的影响,它的缺失会造成ROS的累积和脂质过氧化物的增多[24]。ACSL4和LPCAT3是脂质代谢过程中的重要调节者,可以通过催化多不饱和脂肪酸转化为脂质过氧化物,进而诱发铁死亡[25-26],而GPX4可以抑制ACSL4及LPCAT3的活性,降低多不饱和脂肪酸和脂质过氧化物的产生[27-28]。本研究发现,12 Gy60Coγ射线照射后,支持细胞的GPX4 mRNA表达水平降低,ACSL4、LPCAT3 mRNA表达水平升高,表明电离辐射能够通过GPX4/ACSL4/LPCAT3通路,使细胞ROS累积、脂质代谢异常,进而诱发支持细胞铁死亡。

铁死亡属于调节性细胞死亡(regulated cell death,RCD)的一种[29],可以通过药物或基因干预来进行调节。既往研究表明,铁死亡是疾病发展进程中的早期事件,会进一步触发炎症反应和继发性坏死性细胞死亡[30-31],因此,早期用药物对铁死亡进行调节,对病程的截断具有重要意义。中医理论认为,电离辐射具火毒之性,课题组通过前期的病因学研究,将其命名为“电离毒”,认为其所致损伤具有暴戾性、广泛性、顽固性等特点[32]。根据“电离毒”的致病特点,课题组以中医治未病理论为指导,做到未病先防,既病防变[33],这与铁死亡的早期干预不谋而合。源自临床的益气解毒方能够益气养阴、补血生精、凉血解毒,在体内和体外实验中均被证实对辐射造成的生殖损伤具有良好的防治效果[7,12,18]。本研究发现,益气解毒方能够恢复照射后支持细胞的活力、线粒体膜电位,降低照射后支持细胞的ROS、Fe2+、HMGB1水平,并且能够缓解GPX4 mRNA的下降趋势,与铁死亡抑制剂Lip-1作用一致。此外,益气解毒方还降低了ACSL4、LPCAT3 mRNA表达水平,说明该方可以通过GPX4/ACSL4/LPCAT3信号通路,调控电离辐射后细胞的铁代谢、脂质代谢平衡,从而维持细胞内铁水平含量平衡,减少细胞中脂质过氧化物的积累,减轻支持细胞铁死亡,从而减轻辐射损伤。

综上,本研究证实了铁死亡参与小鼠睾丸支持细胞辐射损伤,而益气解毒方可通过调控GPX4/ACSL4/LPCAT3信号通路,减轻小鼠睾丸支持细胞铁死亡,起到辐射防护作用。在下一步的研究中,将进一步探讨电离辐射诱导的支持细胞铁死亡影响了该细胞的哪些结构或功能,益气解毒方对上述结构或功能损伤又发挥了怎样的防护作用,从而为进一步揭示睾丸辐射损伤的分子机制及益气解毒方的防护机理奠定基础。