Na+/Ca2+交换体抑制剂SN-6和维拉帕米降低肾上腺皮质癌细胞系NCI-H295R醛固酮合成酶表达

王 宇，高寅洁，任卫东，童安莉*

1.河北北方学院 研究生院，河北 张家口075000；2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 内分泌科 国家卫生健康委员会内分泌重点实验室，北京100730；3.河北北方学院附属第一医院 内分泌科，河北 张家口 075000

原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism,PA)是由肾上腺皮质球状带自主分泌醛固酮增多所致。醛固酮产生腺瘤(aldosterone producing adenoma,APA)是PA常见的病因,研究表明,APA中存在KCNJ5、ATP2B3、ATP1A1或CACNA1D等基因体系突变,这些突变通过引起离子通道或酶的异常,最终激活细胞内钙信号,导致醛固酮合成酶CYP11B2表达增加,醛固酮合成和分泌增多[1]。钙通道阻滞剂(calcium channel blocker,CCB)作用于APA细胞膜上的钙通道,阻断细胞的钙内流,减少细胞内Ca2+浓度,从而减少醛固酮合成酶表达及醛固酮分泌。在肾上腺皮质癌细胞系NCI-H295R(以下简称H295R)细胞中也观察到,CCB能减少醛固酮合成[2-3]。

Na+/Ca2+交换体(Na+/Ca2+exchanger,NCX)在维持细胞内钙的稳态中起着重要作用,其位于细胞膜上,是一种双向转运蛋白质,即存在正向和反向两种转运模式,正向模式为Na+转入细胞内同时Ca2+转出细胞外,反向模式为Ca2+转入细胞内同时Na+转出细胞外,转运方向取决于跨膜Na+、Ca2+的浓度梯度与膜电位的差值[4]。在肾上腺皮质细胞中NCX的作用目前尚不清楚,为探讨NCX对肾上腺皮质细胞的醛固酮合成功能的调节作用,本研究拟观察选择性的NCX抑制剂SN-6对K+刺激的H295R细胞的醛固酮合成酶的表达及细胞内钙信号调节的影响,并探讨NCX抑制剂SN-6和CCB维拉帕米(verapamil)这两种钙信号调节剂的共同作用产生的效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:人肾上腺皮质腺癌细胞系NCI-H295R(中国医学科学院国家生物医学实验细胞资源库)。

1.1.2 试剂:Ultroser G 血清替代品(Pall公司);DMEM/F-12培养液(中国医学科学院国家生物医学实验平台);100×MEN非必需氨基酸添加剂(NEAA)(北京酷来搏科技有限公司);1 mol/L HEPES和1×PBS溶液(北京索莱宝科技有限公司);青链霉素(100×)(Cytiva公司);ITS液体培养补充剂(100×)(Sigma-Aldrich公司);SN-6和维拉帕米(MedChemExpree公司);TRIzol RNA提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司);反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(TaRaRa公司);FLIPR Calcium6检测试剂盒(Molecular Device公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:H295R细胞置于含2% UltroserTMG的DMEM/F-12完全培养液中培养,待细胞汇合度接近90%时,用0.25%蛋白胰酶(含EDTA)消化后将其制成单细胞悬液,将细胞以浓度为2×105个/mL接种于6孔板,每孔2 mL,置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2 细胞分组:将细胞分为对照组、K+(15 mmol/L)处理组、维拉帕米(10 μmol/L)处理组、SN-6(10 μmol/L)处理组、K++维拉帕米处理组、K++SN-6处理组、维拉帕米+SN-6处理组和K++维拉帕米+SN-6处理组,每组3孔,药物处理24 h,收集细胞,于-80 ℃保存。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测mRNA表达:依据TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA,通过检测A260/A280比值及RNA浓度,保证样品RNA高纯度,根据反转录的标准条件进行反转录,所获取的cDNA作为PCR反应模板,用实时荧光定量PCR仪扩增目标基因CYP11B2。CYP11B2上游引物:5′-GCTGTGA TTTTGTCCCTTGCCT-3′CYP11B2下游引物:5′-GACC CAACACTCGCTGCTT-3′。内参GAPDH上游引物:5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTC-3′;下游引物:5′-TGG GTGGAATCATATTGGAACAT-3′。PCR反应条件:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;共40个循环;72 ℃终延伸 2 min。

1.2.4 FLIPR Calcium6检测细胞内钙离子水平:细胞以浓度0.8×105个/μL接种于96孔板,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。处理分组:对照组、K+(15 mmol/L)处理组、K++维拉帕米处理组、K++SN-6处理组、K++维拉帕米+SN-6处理组。制备上样缓冲液:将试剂盒10 mL组分B溶液加入到组分A(QF-A液)瓶中,充分溶解组分的内含物,并将AB混合溶液移至离心管中。组分C溶解在DMSO中,充分混合后离心,将内容物转移至AB混合液的离心管中。上样:将细胞培养板从培养箱中取出,弃去培养液,加入组分B溶液(每孔100 μL),再加入上样缓冲液(每孔100 μL)。将细胞板置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育2 h。用多功能酶标仪测定细胞钙离子荧光值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SN-6和维拉帕米单独或联合处理对K+刺激的H295R细胞CYP11B2 mRNA表达的影响

与对照组相比,K+能够刺激CYP11B2 mRNA表达(P<0.001),与K+刺激组相比,K++SN-6组、K++维拉帕组、K++SN-6+维拉帕米组能够抑制K+刺激的CYP11B2 mRNA表达(P<0.001);K++SN-6+维拉帕米组较K++SN-6组、K++维拉帕组抑制CYP11B2 mRNA表达更显著(P<0.05)(图1)。

SN-6:10 μmol/L;verapamil:10 μmol/L;K+:15 mmol/L;*P<0.001 compared with control group;△P<0.001 compared with K+ group;#P<0.05 compared with K+ +verapamil group.

2.2 SN-6和维拉帕米单独或联合处理对K+刺激的H295R细胞内钙离子水平的影响

K+刺激组的细胞内钙水平显著高于对照组(P<0.001); 与K+刺激组相比,K++SN-6组、K++维拉帕组、K++SN-6+维拉帕米组能够抑制K+刺激的细胞内钙水平增加(P<0.001)(图2)。

SN-6:10 μmol/L;verapamil:10 μmol/L;K+:15 mmol/L;*P<0.01 compared with control group;#P<0.000 1 compared with K+ group.

3 讨论

肾上腺皮质球状带细胞中,钙离子是调节醛固酮生成的关键第二信使。血浆钾离子浓度增加时,细胞膜去极化,引起电压门控钙离子通道开放,进而钙内流,钙信号通路激活,增加醛固酮合成酶(CYP11B2)的表达并最终产生醛固酮[5]。

PA是血浆醛固酮水平过高的主要原因,典型的临床表现为高血压伴或不伴有低血钾,是最常见的继发性高血压,占高血压人群5%～13%。在PA患者的药物治疗中,除醛固酮受体拮抗剂外,CCBs也可有效降低血压,其作用是抑制细胞钙内流,进而松弛血管平滑肌张力[6]。本课题组和其他学者[7-8]对人肾上腺和PA中的电压门控钙通道的研究中,观察了人肾上腺皮质组织中L型、N型和T型电压门控钙离子通道的作用,结果显示,不同类型的钙通道均可能参与钙相关的醛固酮生物合成。此外,CCB维拉帕米抑制KCNJ5突变型H295R细胞的CYP11B2 mRNA的表达[9]。

本课题组曾报道CCBs对原代培养APA类固醇激素谱的影响,结果显示维拉帕米10 μmol/L处理可显著抑制醛固酮的合成[10]。本研究以NCL-H295R细胞进行研究,发现维拉帕米抑制CYP11B2的表达,同时减少细胞内钙离子浓度。这与先前研究结果一致。

在大多数生理条件下,NCX可将1个Ca2+与3个Na+的交换,其中Ca2+流出(正向)或Ca2+内流(反向)模式的方向性取决于离子浓度和特定细胞类型中的膜电位。通常,NCX的反向模式在病理环境中占主导地位,它可以显著改变Ca2+稳态[11-12]。NCX作用在心力衰竭、心律失常疾病中研究报道较多。但目前尚缺乏在PA中的研究报道。本研究发现,SN-6能直接抑制NCI-H295R细胞基础及K+刺激的CYP11B2 mRNA表达,以及降低细胞内钙离子水平,提示NCX在肾上腺细胞的作用以反向转运模式为主。

本研究还发现SN-6联合维拉帕米对CYP11B2 mRNA的抑制作用较单独使用SN-6或维拉帕米药物抑制作用更加显著,提示两者在减少醛固酮合成酶的表达上有协同或叠加作用。

研究局限性:首先,本研究为细胞学实验,缺乏在体内研究对结果的验证;其次,醛固酮分泌调控的机制复杂,钙信号与其他信号通路之间存在相互作用,这些都需要进一步深入研究。

综上所述,SN-6能抑制K+刺激的醛固酮合成酶的表达,并且和CCBs联合较单独使用这种抑制作用更强,这种多种钙信号调节剂的联合使用为探索临床上治疗PA的新手段奠定理论基础。