RNA结合蛋白RBPMS调控急性髓系白血病细胞系THP-1增殖与迁移

赵羚延，何 浏，马艳妮，余 佳

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系，北京 100005

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种血液细胞恶性克隆性疾病,具有髓系细胞异常增殖且分化受阻的特点,导致患者造血功能异常,功能性血液细胞数量减少,进而危及患者生命,全球每年因为急性髓系白血病死亡的人数超过8万[1]。MLL1基因的染色体易位会导致不同的白血病亚型,其中MLL重组型急性髓系白血病和淋系白血病,约占白血病的5-10%[2-3]。MLL易位产生的嵌合基因编码致癌的 MLL 融合蛋白,最常见的易位伙伴之一是染色体9p22上的 AF9[4]。多重剪接功能的RNA结合蛋白(RNA binding protein with multiple splicing,RBPMS)基因是位于人类第8号染色体p12位的一个基因,大小超过230 kb,具有一个RNA 识别位点(RNA recognition motif,RRM),可以与新生mRNA结合并调节其加工[5],也可以结合转录因子以调节基因表达,有研究发现RBPMS与Smad2、Smad3和Smad4相互作用,促进Smad介导的转录活性信号通路,而该信号通路与体外和体内的细胞生长、增殖和细胞存活有关[6-7],过表达RBPMS会抑制乳腺癌以及卵巢癌细胞的生长和、迁移和侵袭[6-8],此外有研究通过单细胞转录组测序揭示AML细胞层级关系的工作中,RBPMS作为定义疾病来源的造血干细胞样细胞的标志性基因被使用[9],但是RBPMS在AML细胞中发挥什么作用仍是未知。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:人急性单核细胞白血病细胞系THP-1(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.1.2 主要试剂:RPMI-1640(改良)、胎牛血清FBS(Gibco公司);双抗(Biological Industries公司);β-巯基乙醇、Lipofectamine LTX转染试剂(Thermo Fisher Scientific 公司);TRIzol RNA提取试剂(Invitrogen公司);BCA蛋白质浓度测定试剂盒(Solarbio公司);BioSciTMNewFlashTmProtein AnyKDPAGE蛋白电泳凝胶试剂盒(北京达科为生物技术有限公司);SYBR Green(北京兰博利德商贸有限公司); RBPMS抗体(Abcam公司);RBPMS OE质粒(云舟生物科技有限公司合成);Cell Counting Kit-8试剂(CCK-8,北京兰博利德商贸有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 公共数据分析:使用GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles)分析RBPMS基因在正常造血干祖细胞及急性髓系白血病干细胞中的表达水平。

1.2.2 RBPMS过表达细胞株构建:THP-1在1640完全培养基中培养至细胞密度1×106个/mL时,室温900 r/min 离心5 min,弃上清后用等体积培养基重悬细胞,转移至新的24孔板(1 mL/孔),将细胞分为对照组(vehicle control,PLV)及过表达组(over-expressed,OE)两组,分别加入对应的慢病毒溶液(100 mL/孔),培养14 h后相同条件离心换新的完全培养基继续培养,48 h后加入0.5 mg/mL的嘌呤霉素(puromycin,puro)进行筛选,筛选24 h后离心去掉含puro的培养基,加入新培养基继续培养2 d,用以后续实验。

1.2.3 RT-qPCR检测基因表达水平:取5×105个上述病毒感染后的THP-1细胞,离心弃上清,加入500 μL TRIzol RNA提取试剂,混匀后加入250 μL三氯甲烷快速颠倒混匀,4 ℃,11 304 r/min 离心15 min,吸取上层无色透明液体到新的离心管,加入250 μL异丙醇颠倒混匀,室温静置10 min后相同条件离心10 min,可以看到离心管底部有RNA白色沉淀,弃上清后加入1 mL 75% 乙醇,4 ℃ 11 304 r/min 离心5 min,吸弃乙醇,开盖晾干管壁液体,用20 μL无酶水溶解RNA白色沉淀,使用Nano Drop检测RNA溶液浓度,计算并吸取1μg RNA,通过两步法反转录得到cDNA。全程使用无酶材料和试剂。

取0.4 μL cDNA作为模板,配置10 μL RT-qPCR反应体系,使用罗氏LC480进行PCR扩增,每个样本3个复孔,得到每个样本每个基因的阈值循环数(Ct值),以β-actin为内参,按照log 2-△△Ct法计算得到RBPMS的相对表达量(relative quantification,RQ)。

1.2.4 Western blot检测蛋白质表达水平:取2×106个病毒感染后的THP-1细胞,用大约5倍细胞沉淀体积的细胞裂解液(加入蛋白酶抑制剂)在冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min,吸取上清至新的离心管,使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度,用5×SDS-PAGE loading将蛋白质溶液稀释至3 μg/μL。吸取10 μL蛋白质溶液上样到SDS-PAGE胶中,300 V恒压电泳跑至溴酚蓝到达胶底部,之后260 mA恒流转膜1 h,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,分别4 ℃过夜孵育β-actin及RBPMS一抗,室温孵育二抗1 h后显影。

1.2.5 细胞增殖检测:将THP-1细胞稀释成浓度为5×104个/mL,吸取100 μL到96孔板,每个样本做6个复孔。按照10∶1的体积,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃,5% CO2培养2.5 h后,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值,连续监测4 d(D0、D1、D2、D3)。

1.2.6 细胞迁移检测:THP-1细胞离心后,用不含血清的培养基重悬,稀释成浓度为2×106个/mL,吸取100 μL到直径8 μm的Transwell板上室,下室加入600 μL含10%血清的完全培养基,37 ℃,5% CO2培养24 h后,取出上室,吸取下室所有液体,用流式细胞仪检测迁移进下室的细胞数量,使用公式(下室细胞数/初始总细胞数)×100% 计算得到细胞迁移率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 RBPMS在造血干细胞中高表达,在白血病干细胞中低表达

为了明确RBPMS在造血细胞分化以及AML中的可能作用,首先检索下载了两组公共数据,共117个样本的基因表达数据,然后分析比较了RBPMS在正常造血干祖细胞中的表达,发现RBPMS在造血干细胞中高表达,并随着向下游祖细胞分化表达量逐步降低(图1A),提示RBPMS对于造血干细胞的干性维持具有重要作用。接着分析了RBPMS在白血病干细胞中的表达,发现与正常造血干细胞相比,RBPMS在急性髓系白血病干细胞中表达显著降低(图1B),其中在MLL融合基因型急性髓系白血病干细胞中表达最低(图1C),提示RBPMS的异常低表达可能与急性髓系白血病的产生存在某种联系。

A.RBPMS expression in normal hematopoietic stem progenitor cells(GSE63270);B.RBPMS expression in normal HSC and LSC(GSE17054);C.RBPMS expression in normal HSC,LSC and MLL-LSC(GSE63270); HSC.hematopoietic stem cell;MPP.multipotent progenitor;CLP.common lymphoid progenitor;CMP.common myeloid progenitor;GMP.granulocyte-monocyte progenitor;MEP.megakaryocytic-erythroid progenitor;LSC.leukemia stem cell;*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.0001 compared with HSC group;#P<0.0001 compared with MPP group;▽P<0.0001 compared with CMP group;△P<0.0001 compared with LSC group.

2.2 过表达RBPMS抑制THP-1细胞增殖和迁移能力

为了探究RBPMS的低表达水平在MLL融合基因型急性髓系白血病细胞中的作用,本实验使用携带RBPMS过表达阅读框的慢病毒感染THP-1细胞,感染4 d后,通过RT-qPCR和Western blot检测RBPMS的过表达效率(图2A),确定RBPMS过表达成功后检测其细胞增殖和迁移能力是否受到影响。检测结果表明过表达RBPMS后THP-1细胞出现凋亡(P<0.000 1),增殖能力大幅下降(P<0.05)(图2B),同时迁移能力也显著减弱,24 h时内的迁移率相比对照组减少约20%(图2C)。

A.the mRNA (left) and protein (right) level of RBPMS in vehicle control (PLV) and RBPMS over-expressed (OE) THP-1 cell;**P<0.0001 compared with PLV1 group;#P<0.000 1 compared with PLV2 group;B.A450 represents cell proliferation;C.percentage migration of PLV and OE THP-1 cells;*P<0.05,**P<0.0001 compared with PLV group.

2.3 过表达RBPMS影响白血病细胞增殖及凋亡相关基因表达

为了进一步挖掘RBPMS调控白血病细胞增殖及迁移能力的机制,对THP-1细胞进行了转录组测序。转录组测序结果显示,空载对照组(PLV)和RBPMS过表达组(OE)的样本相关性高(图3),证明重复性较好,可以用于后续比较分析。与对照组相比,OE组有128个基因表达水平发生变化,其中有78个基因表达上调,50个基因表达下调(图4)。通过更深入的分析这些差异基因发现,一些与肿瘤发生发展有关联的基因被下调,比如转录因子HNF1B;同时具有促进肿瘤细胞增殖和迁移功能的基因也被下调,比如趋化因子受体XCR1;除此之外还发现一些促进细胞凋亡有抑癌作用的基因表达上调,比如肿瘤坏死因子LTA(图5),这些结果提示:RBPMS可能通过调节细胞内各类因子的表达进而抑制了白血病细胞的增殖和迁移能力。

A.correlation of vehicle control (PLV);B.correlation of RBPMS over-expressed (OE);FKPM+1,fragments per kilobase of gene per million mapped fragments+1.

A.volcano of differentially expressed genes;B.heatmap of down rugulated genes compared with vehicle control (PLV) cells; C.heatmap of up rugulated genes compared with vehicle control (PLV) cells.

图5 对照组(PLV)和过表达组(OE)细胞间差异表达基因的功能分类

3 讨论

急性髓系白血病存在多种亚型,并且不同亚型之间发病机制大相径庭,随着干细胞生物学和基因组分析技术的发展,AML患者基因改变与其疾病发生间的机制关系逐渐被揭示,目前普遍认为AML起源于白血病干细胞,而白血病干细胞是由正常造血干祖细胞转变的,这种转变通常由基因突变引起,其中融合基因是最常见的致病突变,占所有AML病因的19%[10]。

MLL,又称KMTA2,是一种原癌基因,1979年首次发现其在AML中存在染色体易位,后续出现大量研究报道MLL在血液系统恶性肿瘤中的染色体异常。MLL有40多种不同的融合伴侣蛋白质,由这些融合蛋白质导致的白血病患者化疗缓解率低,预后较差[11],其中AF9是MLL最常见的融合伴侣之一[12]。RBPMS作为一种RNA结合蛋白,具有复杂的功能,目前多项研究发现RBPMS在不同组织和环境中发挥的作用各不相同,与神经发育、心脏发育、肿瘤发生发展等重要生命活动有关[6-9],并且在造血干细胞中维持高表达,而在急性髓系白血病干细胞中表达显著下降,因此探究其在急性髓系白血病中的作用更值得关注。本研究发现在MLL-AF9融合基因型急性髓系白血病细胞系THP-1中过表达RBPMS,会显著抑制其细胞增殖和细胞迁移,转录组测序结果也发现RBPMS的过表达会导致与细胞增殖迁移相关的基因表达下调。

综上所述, 本研究通过检索分析GEO数据库中公共数据发现RBPMS在正常造血干细胞中维持高表达,但是在急性髓系白血病干细胞中表达下调,尤其是在MLL融合基因型急性髓系白血病干细胞中下调最强。在携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病细胞系THP-1中过表达RBPMS后显著抑制了其细胞增殖能力和迁移能力,通过分析转录组测序结果发现,RBPMS可能通过上调肿瘤坏死因子LTA的表达,来抑制THP-1细胞的增殖。同时RBPMS的过表达会下调趋化因子受体XCR1,有研究报道发现XCR1可以促进口腔癌[13]、卵巢癌[14]和肺癌[15]的细胞增殖和迁移,证明RBPMS的低表达对AML细胞的极速扩增具有重要意义,甚至可能有助于白血病的髓外转移,有望成为治疗MLL融合基因型急性髓系白血病的新靶点。