酸奶中乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸和糖精钠的检测方法

凌 玲，周 雨，袁 媛，安 娜

北京市石景山区疾病预防控制中心理化科，北京 100043

0 引言

酸奶以牛奶为原料，经过杀菌、接种、发酵、包装等工艺加工而成，因其加工过程添加有益菌，部分乳糖被分解，不但保留了牛奶的营养价值，还可减轻乳糖不适症状，适合更多消费群体。乙酰磺胺酸钾又名安赛蜜，是一种食品添加剂，具有强烈甜味。糖精钠也是食品工业中常用的合成甜味剂，因其价格低廉被部分生产企业使用。酸奶中添加乙酰磺胺酸钾、糖精钠等甜味剂可有效缓解发酵产生酸味，既满足口感，又解决糖尿病人以及老年人和肥胖患者等特殊人群控制糖摄入量的困难。如今越来越多年轻人也更注重低糖低脂食品摄入，使添加乙酰磺胺酸钾和糖精钠等甜味剂的无糖酸奶越来越受消费者喜爱。乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸和糖精钠等添加剂的长期超量使用会对人体产生不同程度危害，但部分酸奶生产厂家为降低生产成本，获取更大利益，滥用或超标使用食品添加剂。我国目前实施的乙酰磺胺酸钾国标检测方法只检测单一成分，为同时检测酸奶中更多食品添加剂，本文通过高效液相色谱仪，同时检测酸奶中甜味剂乙酰磺胺酸钾、糖精钠，以及防腐剂苯甲酸、山梨酸4 种添加剂的方法。通过检测过程中可能影响检测结果的有关因素进行不确定度分析，为检测方法可行性、检测结果准确性提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UltiMate 3000（DAD）高效液相色谱仪，Thermo Fisher公司；BS 224S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司； KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司； 3-30KS高速冷冻离心机，SIGMA公司；Milli-Q超纯水系统；一次性针头过滤器；0.22 μm水相微孔滤膜；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；乙酸铵（分析纯，西亚试剂公司）；亚铁氰化钾（分析纯，北京化学试剂公司）；乙酸锌（分析纯，北京化学试剂公司）；冰乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酰磺胺酸钾溶液标准物质GBW（E）100171，1 000 μg/mL，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；苯甲酸溶液标准物质GBW（E）100006，1.00 mg/mL，中国计量科学研究院；山梨酸溶液标准物质GBW（E）100007，1.00 mg/mL，中国计量科学研究院；糖精钠溶液标准物质GBW（E）100008，1 000 mg/L，中国计量科学研究院。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

称取5 g（精确至0.001 g）酸奶样品于50 mL容量瓶中，加纯水40 mL，混匀，超声20 min后分别加入蛋白沉淀剂亚铁氰化钾溶液（92 g/L）、乙酸锌溶液（183 g/L）各1 mL，混匀后用纯水定容至刻度。经冷冻离心机13 000 r/min 离心15 min，将上清液过0.22 μm水相滤膜后上机检测。

1.2.2 混合4 种添加剂标准使用液及标准系列的配制

分别取乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸和糖精钠4 种添加剂标准溶液各1.00 mL至10 mL容量瓶中，加水稀释并定容至刻度，得到浓度为100 mg/L混合标准使用液。分别吸取适量浓度为100 mg/L混合标准使用液，加水稀释并定容，配制成4 种添加剂混合标准系列工作液，浓度分别为1.00 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L。

1.2.3 仪器条件

色谱柱：C18柱（柱长250 mm、内径4.6 mm、粒径5 μm）。

流动相：等度洗脱甲醇与乙酸铵溶液（0.02 mol/L）比例为10∶90。

运行时间：10 min。

流速：1.0 mL/min。

柱温：40 ℃。

检测波长：227 nm。

进样量：10 μL。

2 结果

2.1 测量模型

试样中每种添加剂含量按如下公式计算：

其中，X—试样中每种添加剂的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

c—试样溶液中添加剂的质量浓度，单位为微克每毫升（mg/L）；

V—被测试样总体积，单位为毫升（mL）；

m—称取试样的质量，单位为克（g）；

1 000—换算系数。

2.2 混合标准曲线的线性相关系数

以乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、糖精钠和山梨酸4 种混合标准系列工作液的浓度为横坐标，以测得4 种添加剂相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。由表1可知，浓度1.00～50.0 mg/L范围内4 种添加剂相关系数均大于0.999 9。

2.3 检出限与定量限

对浓度1 mg/L混合标准溶液色谱图分析可得，该浓度进样时各添加剂峰高与基线噪声的比值（信噪比）。计算信噪比（S/N）=3时对应各添加剂进样浓度，结合酸奶取样量和定容体积可确定酸奶中4 种添加剂含量，得到检出限。计算信噪比（S/N）=10时对应各添加剂进样浓度，结合酸奶取样量和定容体积可确定酸奶中4 种添加剂含量，得到定量限。本试验结果4 种添加剂的检出限与定量限见表1。

2.4 回收率与精密度

向酸奶样品中分别加入4 种添加剂的标准溶液，得到5 mg/L、10 mg/L、15mg/L3 个浓度的加标量，每个浓度分别取6 个平行样共18 份酸奶样品进行检测。试验结果4 种添加剂的回收率平均值为91.2%～104.8%，精密度均小于2%，试验结果满意（表2）。

表2 加标回收率和精密度（n=6）

3 讨论

3.1 流动相选择

乙酰磺胺酸钾的国标检测方法GB/T 5009.140—2003中流动相为：0.02 mol/L硫酸铵溶液+甲醇+乙腈+10 %H2SO4溶液[1]，2024年3月6日实施的新版国标检测方法GB 5009.140—2023中流动相为：0.02 mol/L硫酸铵溶液+甲醇+乙腈[2]，配制都较复杂，且时间较长。本文以甲醇和乙酸铵溶液（0.02 mol/L）为流动相，配制简单，不需加入甲酸调节流动相的pH值，只调整流动相的速度和比例就能使4 种添加剂完全分离。与加入甲酸的流动相相比，只是4 种添加剂出峰先后顺序不同，并不影响分离效果[3]。考虑尽可能缩短试验时间，经过多次不同比例的流动相试验后，最终确定甲醇与乙酸铵溶液比例10∶90。4 种添加剂标准溶液分离效果及出峰顺序见图1。

图1 10 mg/L 标准溶液色谱图

3.2 波长选择

通过二极管阵列检测器检测4 种添加剂在波长190～300 nm的特征吸收光谱图。波长200～260 nm每种添加剂响应峰值不同，4 种添加剂最大吸收波长分别为乙酰磺胺酸钾224 nm、苯甲酸227 nm、糖精钠200 nm、山梨酸255 nm。波长200 nm时山梨酸响应较差，波长255 nm时糖精钠响应较差，波长227 nm时4 种添加剂同时响应很好且出峰面积较均衡（图1），最终选择检测波长227 nm（图3） 。

图3 4 种食品添加剂特征吸收光谱图

3.3 样品处理方法

4种添加剂的国标检测方法中，一般样品都经过2 次提取[1～3]，再合并离心后的上清液定容。本方法在检测酸奶样品，样品经过稀释混匀并超声20 min的前处理方法一次提取4 种添加剂即可达满意效果，通过加标回收率证明能满足要求，缩减步骤，减少时间。

3.4 蛋白沉淀方法

不同样品待测组份不同时，沉淀蛋白的方法不同。本方法处理酸奶样品，采用蛋白沉淀剂亚铁氰化钾和乙酸锌。通过多次试验，调整2 种试剂用量，最终确定取样量5.0 g时2 种试剂各加入1 mL沉淀蛋白效果最好，样品加标回收率满意。

3.5 不确定度分析

分析本方法建立的测量模型，可总结试验结果的不确定度来源，主要包括进样液浓度检测过程引入的相对标准不确定度、样品定容体积引入的相对标准不确定度、样品的质量测量引入的相对标准不确定度等。以乙酰磺胺酸钾含量为例进行分析。

3.5.1 测量模型中进样液浓度检测过程引入的相对标准不确定度

本试验中乙酰磺胺酸钾标准物质证书标明相对扩展不确定度为1%，k=2，由标准物质纯度引入的相对标准不确定度为：

本试验使用10 mL容量瓶的允许误差为±0.020 mL，按均匀分布计算，k=，由容量瓶引入的相对标准不确定度为：

本试验使用10 mL容量瓶已在20 ℃校准，实验室温度（20±4） ℃，水的体积膨胀系数（2.1×10-4）℃-1，假设温度变化是矩形分布，k=，由实验室温度变化引入的相对标准不确定度为：

本试验标准系列取5 个浓度，采用线性拟合，得到乙酰磺胺酸钾浓度和响应值的标准曲线y=0.3812x，对加标（10 mg/L）样品进行6 次测定，由标准曲线计算加标样品浓度，可求出加标样品浓度的平均值为x=9.828 mg/L，由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为：

式中：s—标准溶液峰面积的标准偏差；x—样品测定液平均浓度；b—标准曲线斜率；m—样品测定次数；n—绘制标准曲线的标准点个数；—绘制标准曲线标准点的平均浓度；xi—绘制标准曲线各标准点浓度；yi—各标准点峰面积实际测得值（表3）。

表3 标准曲线拟合数据计算表

由上述4 个分量合成进样液浓度检测过程引入的相对标准不确定度为：

3.5.2 样品定容体积引入的相对标准不确定度

本试验样品处理时定容于50 mL容量瓶，该容量瓶允许误差为±0.050 mL，按均匀分布计算，k=，由容量瓶引入的相对标准不确定度为：

原理同3.5.1，此处略。计算可得由实验室温度变化引入的相对标准不确定度为：

上述两个分量可合成样品定容体积引入的相对标准不确定度为：

3.5.3 样品的质量测量引入的相对标准不确定度

本试验的样品取样量5.023 g，电子天平分辨力为0.001 g，则区间半宽度可假设为均匀分布，k=，由分辨力引入的标准不确定度为：

上述两个不确定度分量不相关，所以合成样品质量测量引入的相对标准不确定度为：

3.5.4 合成不确定度

由测量模型以及各不确定度分量的分析，合成相对标准不确定度为：

高效液相色谱仪测得进样液浓度9.828 mg/L，由测量模型计算样品中乙酰磺胺酸钾含量x=9 7.8 3 mg/kg，合成标准不确定度为uc（x）=0.006 817×97.83=0.67 mg/kg。

3.5.5 扩展不确定度

取包含因子k=2，由合成不确定度计算扩展不确定度U=2×0.67=1.34 mg/kg。样品中乙酰磺胺酸钾含量97.83 mg/kg时，结果表示为X=（97.83±1.34）mg/kg，k=2。

由不确定度分析和评定可知，采用高效液相色谱仪同时检测酸奶中的4 种添加剂含量时，最主要的不确定度来源于进样液浓度检测过程。在实际检测工作中，可通过选择高纯度标准物质，严格控制标准曲线配制，定期检定仪器设备等来提高检测结果准确性，降低检测结果的不确定度。

4 结论

本文建立采用高效液相色谱仪同时检测酸奶中的4 种添加剂含量的方法。通过亚铁氰化钾与乙酸锌试剂沉淀蛋白的方法处理酸奶样品，操作简单。通过优化高效液相色谱仪的流动相比例及相关仪器参数，使酸奶样品中的乙酰磺胺酸钾等4 种添加剂色谱峰良好分离，检测速度快，可实现同时检测目的。