不同覆膜处理下藠头根际土壤真菌群落的响应特征

王正强,张政兵,李清昊,李耀明,杨 平,杨艺帅,谭 琳

(1. 湖南农业大学植物保护学院,长沙 410128;2. 湖南省植保植检站,长沙 410006;3. 津市市农业农村局,湖南 常德 415400)

【研究意义】藠头(AlliumchinenseG.Don)又名薤、荞头,百合科葱属植物,一种药食两用资源,是目前所有农副产品中为数不多的复合型功能食品,被誉为“菜中灵芝”[1-2],湖南省津市市白衣镇更是被冠以“中国藠果之乡”的美誉。但随着种植年限的增加,藠头的病害问题逐年加重,尤其是根腐病[3]、炭疽病[4]等真菌性病害的发生,严重影响着藠头的产量和品质。农用地膜是现代农业的重要生产资料,覆膜措施具有防病、抗虫、抑制杂草生长等作用,还具有促进作物生长发育、提高作物产量等优势[5]。土壤微生物作为土壤生物区系中最重要的功能组分,其数量、种类及多样性在土壤物质循环和能量流动[6-7]、提高植物的抗病虫害能力[8]、促进植物的生长发育及生产力[9]等方面发挥着极其重要的作用,但对土壤环境变化非常敏感,因而被认为是衡量土壤健康的重要生物学指标[10]。【前人研究进展】地膜覆盖提供了特殊的土壤生态环境,改变了土壤理化性质,而土壤微生物能对土壤生态机制变化和环境胁迫作出反应,导致其群落结构及生态功能发生改变[11-12]。娄俊鑫等[13]在烟田土壤中覆盖黑色地膜后发现,地膜不影响真菌群落的多样性,但显著影响其群落结构及生态功能。而Huang等[14]在玉米地覆盖无色透明地膜后,显著影响了真菌群落的多样性及群落组成。刘岳飞[15]还发现,银色地膜能显著改变辣椒土壤真菌群落的类型和结构。可以看出,地膜颜色也是影响土壤微生物群落的重要因素。针对藠头作物的生产,已有学者提出使用地膜覆盖并结合高温曝晒能有效预防土传病害、地下害虫及杂草生长,且对藠头生产具有明显的增产效果[16-18],但不同覆膜处理对藠头根际土壤真菌群落的影响仍未可知。【本研究切入点】土壤真菌作为农田生态系统的重要组成部分,与土壤病害的发生和抑制密切相关[19],且在有机物的分解和养分循环等方面起着重要作用[20-21],但土壤真菌对人为干扰比较敏感,不同管理措施对土壤真菌群落结构和多样性具有较大影响[22]。为促进藠头健康生产,深入了解覆膜处理对藠头根际土壤真菌群落结构及功能的影响很有必要。【拟解决的关键问题】以藠头根际土壤真菌群落为研究对象,利用高通量测序技术并结合功能预测、分子生态网络等方法探讨其真菌群落结构与功能对不同覆膜处理的响应特征,以期为不同颜色地膜的选择及地膜覆盖对藠头根际土壤真菌群落的影响提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验田概况

试验在津市市白衣镇红光村进行(111°52′ E,29°24′ N),试验地为旱田壤土,肥力中等,前作为藠头,该地海拔44 m。

1.2 试验设计

试验设3个处理,每个处理重复3次,共9个小区,每小区面积为30 m2。于2021年9月16日分别覆盖0.06 mm厚普通透明地膜(Normal plastic mulch,NPM)、0.06 mm厚蓝色地膜(Blue plastic mulch,BPM),以不覆膜地块(CK)作对照。两种地膜材质均为聚乙烯(PE),其中普通地膜(透光率95%)产自山东省郓城一鸣塑业有限公司,蓝色地膜(透光率80%)产自江苏省宿迁恒华塑料制品有限公司。藠头播前各试验区统一施用复合肥(N 26%、P2O510%、K2O 16%)600 kg/hm2作基肥,于10月1日完成种植,次年3月20日施尿素(N ≥ 46%)250 kg/hm2作追肥。除草、病虫害防治等田间管理同当地一致。

1.3 样品采集

于2022年6月1日在藠头收获期利用五点取样法分别对各处理进行土壤样品采集,具体方法为每个处理设置5个取样点,每个取样点随机选取10株藠头,为避免土壤样品单一,5株藠头根际土壤并到一个自封袋,每个处理10份,共30份。将各处理所取样品带回实验室,-80 ℃冰箱保存。

1.4 DNA测序

参照FastDNA®SPIN Kit for Soil(MP,USA)土壤基因组DNA提取试剂盒的步骤提取各根际土壤样品DNA,DNA浓度和纯度利用NanoDrop 2000进行检测,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。使用引物ITS1 F(5’-ACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2 R(5’-BGCTGCGTTCTTCAT CGATGC-3’)对18S rRNA基因的ITS-1可变区进行PCR扩增[23]。使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen,USA)试剂盒进一步纯化回收后,委托广东美格基因科技有限公司进行Illumina高通量测序。

1.5 序列预处理

将所有原始数据以FASTQ格式以及样本对应的Barcode信息上传到Galaxy分析平台上(http://mem.rcees.ac.cn:8080)进行分析[24]。使用Trim Primer将正反向引物去除。通过FLASH将正反向序列进行拼接[25]。使用Btrim[26]步骤去除由FLASH拼接后序列中的低质量区域后,对序列进行筛选和修剪。用UPARSE方法按97%相似度进行OTU归类,生成原始OTU表,并对原始表进行重抽,使每个样品序列数相同,用重抽后OTU进行后期统计分析[27-28]。

1.6 生态与统计分析

通过RDP分类数据库对OTU进行注释。计算样本间的Bary Curtis距离,再进行非度量多维尺度NMDS(Non-metric multidimensional scaling)分析,为验证不同覆膜处理根际土壤微生物群落之间群落结构是否有显著差异,通过相似性分析(ANOSIM)、多响应置换过程分析(MRPP)以及置换多元方差分析(PERMANOVA)3种方法进行不相似性检验(Dissimilarity test)。使用FUNGuild数据库分析不同覆膜处理条件下的真菌功能类群[29-30],将Resample OTU表上传到INAP分析平台上(http://mem.rcees.ac.cn:8081)进行分析[31]。基于Spearman相关性构建分子生态网络,基于随机矩阵理论设置合适的阈值,利用Gephi对微生物网络可视化处理,并进行拓扑参数的计算。

2 结果与分析

2.1 不同覆膜处理藠头根际土壤真菌群落多样性分析

通过高通量测序分析,从30个样本中共获得2 696 172个有效序列,并从这些序列中识别出5054个OTU。将3个处理根际土壤样品的OTUs分布进行韦恩图分析,由图1可知,CK、NPM、BPM处理根际土壤样品中真菌的OTU丰度分别为342、385、338个,而三者共有的OTU为113个,占OTU总数的2.24%;NPM处理的OTU丰度相比CK增加12.57%,而BPM处理的OTU丰度相比CK降低1.17%;CK、NPM、BPM处理中特有的真菌OTU分别为147、203和156个,分别占各自总数的42.98%、52.73%和46.15%,且NPM、BPM处理特有的OTU数分别是CK的1.38和1.06倍。

CK:未覆膜处理;NPM:普通地膜处理;BPM:蓝色地膜处理。下同。CK: Control treatment; NPM: Normal plastic mulch treatment; BPM: Blue plastic mulch treatment. The same as below.图1 不同处理藠头根际土壤真菌OTUs分布Fig.1 Distribution of fungal OTUs of A.chinense rhizosphere soils with different treatments

根据Richness指数结果(图2-a)可知,所有样本的Richness多样性指数为435～760,且CK和BPM处理的根际土壤微生物多样性水平差异显著(P<0.05)。进一步分析不同处理下土壤真菌群落的β多样性,基于Bray-Curtis距离,利用NMDS方法对根际土壤真菌群落进行分析,可以发现(图2-b),不同处理下的真菌群落分化格局明显。随后进行不相似检验分析验证,结果表明(表1),CK和NPM、BPM处理间存在显著性差异(P<0.01,下同),且NPM和BPM间也存在显著性差异,从而证明覆膜处理对藠头根际土壤真菌群落的β-多样性具有显著影响。

a:Richness指数分析;b:基于Bray-Curtis距离的NMDS。不同字母表示显著差异(P<0.05)。a: Richness index analysis; b: NMDS based on Bary-Curtis distance. Different letters indicate significant difference(P<0.05).图2 不同处理藠头根际土壤真菌群落α与β多样性分析Fig.2 α and β diversity analyses of fungal community of A. chinense rhizosphere soils with different treatments

表1 不同处理藠头根际土壤真菌群落差异性分析Table 1 Dissimilarity test of fungal community of A. chinense rhizosphere soils with different treatments

2.2 不同覆膜处理藠头根际土壤真菌群落物种组成

由图3-a可知,CK、NPM、BPM处理根际土壤真菌区系在门水平上主要由子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)组成,二者含量在各处理中均达70%以上。进一步分析组间差异可以发现,不同覆膜处理对藠头根际土壤真菌群落的相对丰度有一定影响,NPM处理与CK相比,子囊菌门增加16.76%,担子菌门和壶菌门(Chytridiomycota)分别降低19.60%、3.46%;BPM处理与CK相比,子囊菌门增加26.61%,担子菌门和壶菌门分别降低17.73%、3.60%。

图3 不同处理藠头根际土壤真菌群落在门水平(a)和属水平上(b)的相对丰度Fig.3 Relative abundance of fungal community at phylum (a) and genus (b) levels of A.chinense rhizosphere soils with different treatments

由图3-b可知,除未分类菌属(Unclassified)在各处理根际土壤真菌区系中占一定比例外,CK优势菌属为腐质霉属(Humicola,7.72%)、杯革菌属(Cotylidia,9.78%)、Neottiosporina(4.29%);NPM处理优势菌属为半内果菌属(Hamigera,5.38%)、腐质霉属(Humicola,8.41%)、篮状菌属(Talaromyces,5.58%)、曲霉属(Aspergillus,4.57%)、锥毛壳属(Coniochaeta,5.54%);BPM处理优势菌属为半内果菌属(24.74%)、腐质霉属(4.93%)、篮状菌属(9.27%)、曲霉属(7.96%)、鬼伞属(Coprinellus,6.41%),可以看出不同覆膜处理导致真菌群落在门水平和属水平上的比例变化。

由图4可以看出,曲霉属、半内果菌属、篮状菌属、被孢霉属(Mortierella)、鬼伞属、木霉属(Trichoderma)在BPM处理中丰度较高,杯革菌属(Cotylidia)和Neottiosporina在CK中丰度较高,锥毛壳属(Coniochaeta)和枝孢霉属(Cladosporium)在NPM处理中丰度较高。由此可见,同一菌属在不同处理条件下丰度存在差异;对各处理进行聚类发现,CK和NPM处理的土壤真菌群落结构和组成较为相似,与BPM差异较大。

图4 不同处理藠头根际土壤主要真菌菌属热图Fig.4 Heatmap of the main fungal genera of A. chinense rhizosphere soils with different treatments

2.3 不同覆膜处理藠头根际土壤真菌分子生态网络

为研究不同覆膜处理对藠头根际土壤真菌群落的影响,利用INAP分析平台,采用相同阈值0.81构建分子生态网络(图5),其幂定律均>0.8,且各拓扑参数大于随机网络的相应数值(表2),可进一步分析。

表2 不同处理藠头根际土壤真菌群落分子生态网络及随机网络拓扑属性Table 2 Characteristic parameters of the molecular ecological network and random network of fungal community of A. chinense rhizosphere soils with different treatments

1个节点代表1个OTU,且节点大小与连接数呈正比。不同颜色区分不同模块,小于5分子的模块中的节点为灰色。A node represents an OTU, and the node size is proportional to the number of connections. Different colors distinguish different modules, and the nodes in modules smaller than 5 molecules are gray.图5 不同处理藠头根际土壤真菌群落分子生态网络Fig.5 Molecular ecological network of fungal community of A. chinense rhizosphere soils with different treatments

由3个不同覆膜处理下根际土壤真菌分子生态网络的拓扑参数比较分析可知,节点数、边数、平均度及平均聚类系数呈现为BPM

在共现网络中,可以根据节点在模块内的连通度(Zi)与模块间的连通度(Pi)识别群落的的关键物种,而节点属性类型一般分为4类:模块枢纽(Zi>2.5,Pi<0.62)、网络枢纽(Zi>2.5,Pi>0.62)、外围节点(Zi<2.5,Pi<0.62)、连接节点(Zi<2.5,Pi>0.62)。在本研究中所构建的3个分子生态网络中(图6),大部分节点是外围节点,主要与模块内的节点相连,连接数很少,均无网络枢纽节点。在CK处理中,有3个模块枢纽节点(OTU_154、OTU_138、OTU_40),2个连接节点(OTU_97、OTU_181);在NPM处理中,均为外围节点;在BPM处理中,有1个模块枢纽节点(OTU_2164)。进一步对共现网落中起重要作用的节点进行注释,发现在CK根际土壤中的主要关键物种为散囊菌目(Eurotiales)、毁丝霉属(Myceliophthora)等;在BPM根际土壤中的主要关键物种为Neosetophomarosarum。可见,随着生态环境的改变,关键物种也发生着显著变化。

图6 不同处理藠头根际土壤真菌群落Zi-Pi图Fig.6 Zi-Piof fungal community of A. chinense rhizosphere soils with different treatments

2.4 不同覆膜处理藠头根际土壤真菌功能预测

采用FUNGuild平台对藠头不同覆膜处理根际土壤真菌群落进行功能预测分析,结果发现,样本共涉及腐生型(Saprotroph)、病原型(Pathotroph)、病原-腐生-共生型(Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph)、病原-腐生型(Pathotroph-Saprotroph)、共生型(Symbiotroph)、腐生-共生型(Saprotroph-Symbiotroph)、病原-共生型(Pathotroph-Symbiotroph)7种生态营养模式。本研究以相对丰度超过10%的功能菌群进行作图分析(图7-a),结果显示,腐生型(Saprotroph)、病原型(Pathotroph)、病原-腐生-共生型(Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph)3种功能菌群在CK和NPM处理中占比均超过10%,其相对丰度分别为46.26%、13.86%、11.53%和47.07%、13.92%、12.82%,而在BPM处理中相对丰度超过10%的功能菌群为腐生型(Saprotroph,48.44%)和病原型(Pathotroph,15.40%)。

a:营养型分类;b:Guild详细分类。a: Trophic mode; b: Guide detailed classification.图7 不同处理藠头根际土壤真菌群落FUNGuild功能分类Fig.7 FUNGuild function classification of fungal community of A. chinense rhizosphere soils with different treatments

对各样品菌群进行了详细的物种生态功能预测分类,并以相对丰度超过3%的菌群进行作图(7-b),可以看到,不同覆膜处理藠头根际土壤真菌已鉴定出的主要生态功能菌群是未定义腐生菌(Undefined Saprotroph),在CK、NPM、BPM处理中的占比分别为33.49%、33.15%、35.64%,其次是植物病原型(Plant Pathogen),其相对丰度依次为8.26%、8.42%、10.21%。

3 讨 论

覆膜措施具有防治病虫草害、增温调温、保墒提墒等多种综合效应,能在作物的产量和品质上发挥重要作用[32],但覆膜处理改变了土壤微环境,进而对土壤微生物活性及群落结构造成一定影响[33]。Tian等[34]在黍种植田中覆盖透明地膜后显著降低了土壤真菌群落多样性,改变了真菌群落组成及关键类群。Dong等[35]在玉米地中覆盖透明地膜显著提高了真菌群落多样性和丰富度。而宋健等[36]发现,蓝色地膜对韭菜根际土壤真菌群落结构造成一定影响,对其多样性影响不大。在本试验中,覆膜处理造成藠头根际土壤真菌群落多样性降低,并对β-多样性(Bray-Curtis距离)具有显著影响,该结果与Liu等[37]的研究结果相似。Liu等[37]认为,由于真菌对有氧环境的偏好,覆盖会造成局部厌氧环境,从而导致真菌群落发生变化和丰富度下降,且胡志娥等[38]研究发现,覆膜处理虽然降低了土壤真菌群落多样性,但并不意味着土壤功能性的降低,其土壤氮磷等养分含量仍受其多样性的显著影响。在藠头根际土壤真菌种群中,有70%以上的真菌来自子囊菌门和担子菌门,这与其他农田或草地根际土壤真菌群落结构研究相似[39-42]。子囊菌门和担子菌门位于真菌进化树的顶端[43],它们不仅是有机质的主要分解者,而且参与根际氮素循环,对植物生长发育起着重要重用[39,44]。在属水平上,腐质霉属、篮状菌属、曲霉属等菌群的相对丰度在覆膜处理后显著提升,已有研究表明,这几种真菌类群是自然界重要的分解者,可降解植物木质纤维素,增加土壤腐殖质,还具有较强的溶磷能力,使植物能更好地利用土壤中的磷元素[45-47];另一方面,半内果菌属菌群的含量在覆膜处理后也呈上升趋势,研究报道该菌群是一种耐热性霉菌,常在食品加工阶段引起食品污染[48],而这将可能给藠头的实际生产带来潜在风险。

生态网络已成为揭示不同环境条件下微生物物种之间相互作用的重要手段[49],网络的拓扑特征可以反映微生物之间的连通性和相互作用的水平[50]。关键物种的存在或消失可能会导致群落的结构与功能发生一系列变化[51]。本研究发现,对藠田进行不同覆膜处理后,造成了NPM和BPM处理在网络中的节点数和连接数减少以及平均度和平均聚集系数降低,从而降低了藠头根际土壤真菌群落的网络复杂性,这与胡志娥等[38]对覆膜下农田土壤真菌群落响应一致,且Tian等[34]认为地膜覆盖下微生物α多样性的降低是造成微生物网络简化的重要原因;另一方面,虽然不同覆膜处理降低了网络的复杂性,但其模块化指数均呈上升趋势,表现为BPM>NPM>CK,研究表明,模块化指数表征系统抵抗外界干扰的能力,其值越大,系统稳定性越高[52]。此外,在本研究中,不同覆膜处理下的真菌生态网络中的模块枢纽节点和连接节点差异明显,在CK中,主要关键物种为散囊菌目(Eurotiales)、毁丝霉属(Myceliophthora)等。研究报道,散囊菌目中存在着一些高效的纤维素降解菌,在碳转化循环中发挥着重要作用[53];还有研究发现大多毁丝霉属真菌是嗜热真菌,能产生热稳定的酶,具有较强的降解能力[54]。在NPM处理中没有出现关键物种;在BPM处理中只出现1个关键物种为Neosetophomarosarum,该物种隶属子囊菌门(Ascomycota)、新刺毛茎点霉属(Neosetophoma),由Perera等[55]分离并命名,目前,该菌的研究报道并不多,其生物学功能还有待进一步挖掘。综上,不同覆膜处理下真菌网络中关键核心物种的改变,可能与覆膜后改变了真菌群落结构,导致真菌类群为适应环境变化而采取多样化的生态策略有关。

不同覆膜处理改变藠头根际土壤真菌群落结构的同时,也改变了其生态功能,从而对宿主和环境产生不同的影响。研究发现,部分真菌会随着土壤环境的变化而改变自身的营养类型,以抵抗环境变化带来的不利影响[56-57]。基于FUNGuild功能预测结果可以发现,腐生型真菌在各处理中的相对丰度表现为CK

4 结 论

在本试验中,覆膜处理降低了真菌群落的多样性,富集了相对丰度更高的腐质霉属、篮状菌属、曲霉属等有益真菌菌群,而有益菌群在蓝色地膜处理下更为富集;覆膜处理还使根际土壤的真菌分子生态网络变得简化,但覆膜处理后的模块化程度更高,表明覆膜后真菌群落对外部环境的抵抗能力也相对提高,其中蓝色地膜较普通地膜表现更优越;试验进一步对各处理的真菌群落进行功能预测,结果发现,覆膜处理增加了腐生型功能菌群的相对丰度,而该功能型菌群在蓝色地膜下占比更高,更利于有机物的分解和养分循环。此外,在本试验的测产结果中,未覆膜处理藠头总产量为267.9 kg,普通地膜处理总产量为283.2 kg,蓝色地膜处理总产量为359.7 kg,普通地膜及蓝色地膜处理相比对照分别增产5.7%和34.3%,与本试验结论相吻合。因此,推测覆膜处理对土壤微生物群落结构和功能的改变可能是藠头增产的重要因素。在实际生产中,覆膜处理在一定程度上虽能促进作物生长,增产增收,但覆膜措施也可能带来潜在风险,如病原型功能菌群显著提升,还得进一步深入研究并加入限制。