苍耳茎腐病病原菌鉴定及其杀真菌剂室内筛选

2024-04-24张雪梅张廷富罗映清常艳华文国琴

西南农业学报 2024年2期

张雪梅,张廷富,罗映清,常艳华,宋波,文国琴

(西华师范大学生命科学学院,四川南充 637009)

【研究意义】苍耳(XanthiumstrumariumL.)隶属菊科苍耳属一年生草本植物,广泛分布于我国大部分省区[1]。苍耳全草、根、花和果实等均可入药,多种民族药中均有收录,具有较高的药用价值[2]。然而,由罗尔阿太菌引起的茎腐病威胁了苍耳的产量和品质,在农业生产上造成了一定经济损失,因此,有效防治其引起的真菌病害显得十分必要。【前人研究进展】罗尔阿太菌(Atheliarolfsii)无性世代为齐整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc),是一种死体营养型土传性植物病原真菌,土壤中越冬菌态常以菌核为主,也存在菌索和菌丝等形式,通常借助苗木、土壤及水流传播,以菌丝体在土中蔓延,侵入植物根及茎基部[3]。在侵染植物地表茎部产生丰富的白色菌丝和褐色菌核,引起南方枯萎病、白绢病、茎腐病等[4-5]。罗尔阿太菌的寄主范围广泛,各种农作物、园艺植物和中草药均有白绢病或茎腐病的报道,比如花生、辣椒、番茄、豇豆、向日葵、魔芋、南瓜、茶树、山楂、苹果、半夏、艾蒿、黄连、白术等[3, 6-10]。其中,白绢病已成为我国所有花生种植省份产量的主要制约因素,多数情况下产量损失10%～30%,严重时可达80%[11-12]。罗尔阿太菌引起茎腐病,发病初期病原侵染植物茎基后出现褐变性软腐,后期病菌向地上茎部扩散,发病植株轻则茎叶枯黄,重则枯萎而早衰死亡[3]。最近报道的向日葵茎腐病发病率约11.95%,且发病植株在苗期因枯萎而全部死亡[6]。南方枯萎病症状包括在土壤线以上的茎出现灰色和浸水的病变,之后发展为茎部软化腐烂,最终破坏植株冠部组织导致植株倒伏[13]。2020年,发现草珊瑚因感染南方枯萎病而萎蔫死亡,发病率在15%～20%[14];也有研究报道罗尔阿太菌会引起生菜南方枯萎病[15]。此外,十字花科植物也是罗尔阿太菌侵染的主要寄主[16],而且幼苗感染发病严重,影响植株正常生长导致减产,甚至引起苗期植株死亡而绝收[17]。农业生产上通常使用化学农药控制、生物防治和农艺措施等手段对茎腐病等进行综合管理[18]。农业防治中易感植物与非寄主作物轮作可降低病害发生率,如玉米、小麦和高粱等禾本科作物不易受罗尔阿太菌危害,它们与花生等易感作物轮作可显著降低土壤中菌核数量和后续年份的发病率[19-20]。利用有益生防菌绿色防治有害病原前景广阔,如芽孢杆菌和木霉等对茎腐病原菌均有较好的抑菌效果,但是大田应用及推广较化学农药而言相对较少[20-22]。目前,化学农药具有速效、易操作和高防效等优势,仍然是植物病害治理的主要措施。周锋等[23]测定了花生白绢病菌河南分离物对氟啶胺、咯菌腈、多菌灵等11种化学农药的敏感性,结果显示该病原对氟啶胺最敏感(EC50为0.05 mg/L);李敏等[20]在对花生白绢病菌的抗性风险评估分析中,37个分离物均对氟唑菌酰胺最敏感,EC50为0.25～0.69 mg/L,其次是咯菌腈,EC50为0.78～2.83 mg/L,约为周锋等[23]测定分离物的5～19倍;马琳[9]筛选了黄连白绢病菌对多菌灵、恶霉灵和甲基托布津等7种杀菌剂的室内毒力,恶霉灵3000倍稀释液效果最好,而80%多菌灵可湿粉剂1000倍稀释液无抑菌效果,这与周锋等[23]报道的花生白绢病菌为多菌灵敏感(EC50为0.47 mg/L)不同;马瑞[24]对温郁金白绢病菌的室内毒力测定显示,海南分离物对烯唑醇最为敏感,EC50为0.14 mg/L。【本研究切入点】目前,关于苍耳茎腐病病原菌的分离鉴定及其防控尚未报道,不同来源分离物对同种杀菌剂的敏感性存在较大差异,但是通过多种杀菌剂筛选,均可以确定不同病原菌的敏感性农药品种。【拟解决的关键问题】本研究以苍耳茎腐病植株为材料进行病原菌的分离鉴定,结合分子生物学技术明确其物种,并对病原菌进行室内杀真菌剂的筛选,以得到高效的杀菌剂,为苍耳茎腐病的防治提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苍耳茎腐病植株采自西华师范大学野生中药资源植物基地。将去壳种子浸种24 h后播种,25 ℃培养箱中黑暗处理至出苗,幼苗在16 h光照8 h黑暗的光周期下生长至30 d株龄,用于病原菌的致病性检测回接试验。PDA和LB培养基配制参照伍志[25]的方法。大肠杆菌克隆菌株Top10(上海唯地生物),苍耳茎腐病菌为本研究分离鉴定。本研究涉及的7种杀真菌剂均为原药粉末,纯度和工作浓度详见表1。另需试剂无水乙醇(国药)、50×TAE、琼脂糖(西班牙进口)、DNA分子标准(东盛生物)等;所用试剂盒为真菌基因组提取试剂盒(杭州博日)、凝胶回收试剂盒(Omega)、TA克隆试剂盒(大连宝生物)等。

表1 7种杀真菌剂的浓度梯度Table 1 Concentration gradient of the 7 fungicides

1.2 菌株的分离纯化

采集茎腐病害症状典型的苍耳植株,使用菌丝尖端切割法分离纯化病原菌。无菌接种针挑取患病苍耳发病茎基部表面的白色菌丝体,接种于含有氨苄青霉素和硫酸卡那霉素的PDA平板中央,在霉菌培养箱中(27±1)℃暗培养。待长出明显的菌落后,体式镜下挑取菌落边缘束状单根菌丝尖端接种于新的PDA平板上,重复纯化2～3次获得纯培养菌落。分离纯化的菌株依次命名为NCXS-1、NCXS-2、NCXS-3等。

1.3 形态学特征观察

用打孔器在已纯化培养的菌株平板上取菌饼接种在新鲜PDA平板中央,于(27±1) ℃黑暗培养,期间对其菌落、菌丝和菌核进行观察。待菌落即将长满平板(d=90 mm)时,十字交叉法测量菌落直径并计算生长速率,拍照记录菌落形态。平板上挑取少量菌丝制作临时装片,利用光学显微镜观察并记录病原菌的菌丝形态特征。对菌核观察的平板继续培养,待菌核形成后对菌核数量进行统计,用游标卡尺测量菌核大小。参照魏景超[26]和喻璋等[27]的方法对纯化菌株进行形态学鉴定。

1.4 PCR扩增与分子克隆测序

为确认形态学鉴定的结果,选取代表菌株刮取平板表面的菌丝体,使用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌总DNA,操作步骤详见试剂盒说明书。以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)引物对扩增病原菌内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS),以EF595 (5′-CGTGACTTCATCAAGAACATG-3′)和EF1160(5′-CCGATCTTGTAGACGTCCTG-3′)引物对扩增翻译延伸因子(Translation elongation factor 1-α,TEF1-α)[28]。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后切割目的条带,用凝胶回收试剂盒纯化目标产物,并与pMD-18连接。连接产物转化大肠杆菌Top10菌株感受态后,通过氨苄青霉素抗性LB筛选,挑取单克隆用上述引物进行菌液PCR鉴定,提取阳性克隆转化子质粒送昆泰锐(武汉)生物技术有限责任公司测序。

1.5 基于ITS和TEF1-α的系统发育树构建

ITS和TEF1-α片段的重组质粒测序序列去除载体和引物序列后,分别获得ITS和TEF1-α克隆片段序列,在NCBI网站的BLAST在线工具中比对同源序列。下载一致性(Identity)大于90%的同属不同物种的同源序列,使用MEGA6.0下的clusterW进行序列多重比对,手动去除两端未比齐序列后采用Neighbor-Joining法构建系统发育树,Bootstrap检验重复1000次[29]。

1.6 病原菌的致病性测定

选取1.1中所述长势一致的幼苗6株。3株作为实验组,取代表菌株NCXS-1的菌饼接种于苍耳茎基部;另外3株接种水琼脂块作为对照组。同样标准选择6株苍耳,3株在茎基部接种代表菌株NCXS-1的菌核,3株不做任何接种作对照组。所有植株单独套袋隔离置于光照培养箱中,在(25±1)℃和16 h光照8 h黑暗的光周期条件下继续培养至植株发病,观察发病苍耳植株的染病情况并拍照记录,同时再次从发病植株上分离病原观察形态特征,完成科赫法则验证。

1.7 杀菌剂的筛选

7种农药分别取适量原药粉末配制母液,按照不同浓度梯度稀释为储存液(工作浓度×1000),按v(杀菌剂储存液)∶v(培养基)=1∶1000添加至PDA混匀倒平板,空白对照添加等体积的杀菌剂溶剂二甲基亚砜或0.25 mol/L稀盐酸(溶解多菌灵和噻菌灵)。用打孔器在均匀长满菌丝的种子平板上取菌饼(d=7 mm),分别接种在不同杀菌剂浓度的PDA平板,(27±1)℃培养至对照长满平板;用十字交叉法测量菌落直径,计算杀菌剂对病原菌生长的抑制率。抑制率=[(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)÷(对照菌落生长直径-菌饼直径)]×100%[30]。每种杀菌剂抑菌实验重复3次,利用Excel和SPSS统计软件进行数据处理,计算杀菌剂的毒力回归方程、半数最大效应浓度(Concentration for 50% of maximal effect,EC50)和相关系数[22]。

2 结果与分析

2.1 分离真菌的形态学观察

种植基地的苍耳野外发病植株茎基部凹陷,呈褐色并附有大量白色菌丝(图1-A、C、D),患病前期其韧皮部、木质部被破坏而出现部分植株倒伏(图1-A);随着病程发展,患病植株茎基部的韧皮部受损严重伴有木质部腐烂,水分运输中断导致植株缺水萎蔫,叶片枯黄,早衰苗期死亡(图1-B、E)。田间不同种植小区采样发病植株共分离到6株菌落形态一致的菌株,在PDA培养基上生长快速,生长72 h束状菌丝可铺满整个平板(d = 90 mm)。所有菌株的气生菌丝粗壮为白色,菌落呈放射状(图2-A),具有浓郁的蘑菇气味。在(27±1)℃继续黑暗培养4～5 d开始形成白色点状的菌核,之后逐渐变为浅黄色,在第10天左右可形成表面光滑的油菜籽状褐色菌核。PDA平板上菌核主要分布在菌落边缘和平板中央,每个平板的产菌核数在328～432粒不等,直径0.87～1.65 mm(图2-B)。显微镜下可见粗壮菌丝上有分支和隔膜以及明显的锁状联合结构(图2-C)。根据以上所观察的形态特征,初步将苍耳茎腐病菌鉴定为罗耳阿太菌(A.rolfsii)。

A.苍耳茎腐病发病初期;B.苍耳茎腐病发病后期;C～E.苍耳茎基部特写。A.Initial stage of X. strumarium stem rot disease; B.Later stage of X. sibiricum stem rot disease; C-E.Close-up of the stem base of X. strumarium.图1 田间苍耳茎腐病植株Fig.1 Stem rot plants of X. strumarium in the wild

2.2 ITS和TEF1-α的PCR扩增及其分子克隆测序

为进一步鉴定病原菌菌株,提取NCXS-1菌株的基因组DNA为模板,分别扩增TEF1-α和ITS约500 和700 bp的片段(图3-A)。目的片段回收和克隆后,各挑取5个单克隆分别用TEF1-α引物和ITS引物进行菌液PCR检测,所有转化子均为阳性克隆(图3-B、C)。重组质粒的克隆片段测序获得NCXS-1菌株TEF1-α基因的498 bp序列和ITS rDNA的645 bp序列(登录号:OQ873315.1和OQ851522.1)。

A.PCR扩增TEF1-α和ITS rDNA;B～C.菌液PCR法分别鉴定克隆TEF1-α和ITS。A.PCR amplification of partial TEF1-α and ITS rDNA;B-C.Identification of TEF1-α and ITS rDNA clonies by bacterial solution PCR, respectively.图3 PCR扩增及克隆NCXS-1的TEF1-α基因和ITS的rDNA序列Fig.3 PCR amplification and cloning of partial TEF1-α gene and ITS rDNA from NCXS-1 strain

2.3 分子鉴定及系统发育分析

NCXS-1 ITS和TEF1-α测序序列分别在NCBI数据库中进行BLAST在线搜索,结果显示菌株NCXS-1的ITS和TEF1-α分别与数据库中的NC-1(MW311079.1和MW322687.1)等多株罗耳阿太菌(A.rolfsii)的相应序列一致性为100%。下载与NCXS-1菌株ITS和TEF1-α一致性大于90%且同属物种的同源序列构建系统发育树,结果显示NCXS-1菌株的ITS和TEF1-α分别与5个A.rolfsii菌株聚在一支,支持系数均为100(图4-A、B)。综上所述,结合形态学特征和系统发育分析,将NCXS-1菌株鉴定为罗耳阿太菌(A.rolfsii)。

表示试验菌株。 indicates test strains.图4 基于ITS (A)和TEF1-α (B)的苍耳茎腐病菌系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of X. strumarium stem rot pathogen based on ITS (A) and TEF1-α (B)

2.4 分离菌株对苍耳的致病性测定

NCXS-1于PDA上培养待菌丝铺满平板和产生菌核后,分别取菌饼和菌核接种于苍耳茎基部进行致病性检测。接种NCXS-1菌饼的苍耳植株在3 d后茎基表面褐色伴有水渍样腐烂,茎表附有稀疏的白色菌丝,茎基部整体凹陷萎缩甚至折断,植株萎蔫,而接种水琼脂块的对照组无发病症状(图5-A、C、D);接种NCXS-1菌核的苍耳植株在12 d后出现褐色、腐烂的茎基部,植株叶片卷缩萎蔫褐色,未接种处理的对照组同样无发病症状(图5-B、E、F)。无论是含菌丝的菌饼还是菌核接种实验组,其病变症状均与野外自然发病样本症状相同;对接种发病茎基部的病原菌再分离,经鉴定与原接种的NCXS-1相同,符合科赫氏法则,以上结果证明菌株NCXS-1等罗尔阿太菌(A.rolfsii)为苍耳茎腐病的病原。

A.茎基部接种水琼脂(左)和菌饼(右)的发病情况;B.茎基部未处理(左)与接种菌核(右)的发病情况;C～F.A和B接种部位对应的茎基部特写。A.Symptoms of water agar (left) and mycelial plug (right) inoculated on stem base; B.Symptoms of null (left) and sclerotium (right) inoculation on stem base; C-F.Close-up of inoculated stem base corresponding to the seedlings in A and B.图5 NCXS-1对苍耳的致病性实验Fig.5 Pathogenicity test of NCXS-1 strain to X. strumarium

2.5 NCXS-1对杀菌剂的敏感性测定

NCXS-1菌株对所测试7种杀菌剂的敏感性结果显示,NCXS-1对多菌灵(Carbendazim)、抑霉唑(Imazalil)、腐霉利(Procymidon)、噻菌灵(Thiabendazole)和甲基托布津(Topsin-methyl)不敏感,杀菌剂浓度在5.0 mg/L范围内,不同农药浓度梯度平板菌落直径与对照平板无显著差异;咪鲜胺(Prochloraz)对NCXS-1具有一定的抑致效果,在5.0 mg/L浓度范围内,平板菌落直径随药物浓度增加而减小;NCXS-1对咯菌腈(Fludioxonil)敏感,1.0 mg/L药物平板上菌丝基本停止生长,只在接种菌饼周围出现白色晕圈,当药物浓度为5.0 mg/L时完全抑制菌丝生长,晕圈消失(图6)。进一步增加咪鲜胺浓度而降低咯菌腈浓度,设置系列浓度梯度,测定其对NCXS-1的抑菌率。结果显示,在1～25 mg/L咪鲜胺或0.01～1.00 mg/L咯菌腈浓度范围内,NCXS-1的生长速率依次减小,且25 mg/L咪鲜胺或1.00 mg/L咯菌腈的抑致率达到100%(图7-A、B、C)。基于不同药物浓度及其抑菌率求出咪鲜胺和咯菌腈的毒力回归方程分别为y=2.396x-0.194(R2=0.817)和y=1.804x+8.809(R2=0.922),EC50分别为8.74 和0.12 mg/L(表2)。结果表明,罗耳阿太菌对咯菌腈敏感,在较低浓度时可有效抑制其菌丝生长。

图6 NCXS-1在7种抗真菌药物不同浓度梯度下的生长情况Fig.6 The growth of NCXS-1 under different concentrations of seven antifungal agents

A.菌丝在不同浓度咪鲜胺和咯菌腈的生长情况;B.咪鲜胺的抑制率;C.咯菌腈的抑制率。A.Mycelial growth of fludioxonil and prochloraz at different concentrations; B.The inhibition rate of prochloraz; C.The inhibition rate of fludioxonil.图7 不同浓度梯度的咪鲜胺和咯菌腈对NCXS-1的抑制情况Fig.7 Inhibitions of NCXS-1 with different gradient concentrations of prochloraz or fludioxonil

表2 咪鲜胺和咯菌腈的毒力回归方程Table 2 Toxicity regression equation of prochloraz and fludioxonil

3 讨论

目前,苍耳上已报道的病害主要有白粉病和霜霉病[31-35],未见苍耳茎基腐病的文献报道。茎腐病属于典型的土传病害,通常发病植株根基靠地表位置腐烂而根系正常。引起植物茎腐的病原种类多样,包括镰刀菌属(Fusarium)、小菌核属(Scleritium)、腐霉属(Pythium)、核盘菌属(Sclerotinia)和链格孢属(Alternaria)等真菌[34-37]。小菌核属中基腐小核菌(S.bataticolaTaub.)主要引起多种针、阔叶树种苗木茎腐病,也危害芝麻、红豆、大豆、棉花等农作物[38]。而齐整小菌核(S.rolfsii)的宿主范围更广泛,据报道可危害600多种植物,比如引起向日葵、铁皮石斛和雪铁芋茎腐病等[6, 39-40]。自然条件下,该菌不易产生担子或担孢子,有性阶段研究颇少且存在多种异名,目前普遍接受的是罗尔阿太菌(A.rolfsii);无性阶段菌丝呈白色丝状,有分枝、隔膜和锁状联合,且随着菌龄增加菌丝体特化,产生表面光滑、形似油菜籽的褐色菌核,是其形态学鉴定的重要特征[24]。将分子系统发育分析与之结合,可大幅度提高病原鉴定的准确度,比如陈燕萍等[41]使用ITS、LUS和TEF-1α分别构建系统发育树鉴定了太子参白绢病菌A.rolfsii。本研究根据菌落培养特性、菌丝和菌核形态特征并结合ITS和TEF-1α进行分子鉴定。基于ITS和TEF-1α的多基因系统发育分析时,NCBI数据库中阿太菌属(Athelia)物种ITS较多,而可用TEF-1α物种序列较少,同一菌株很少同时提交两种基因序列。因此,本研究分别采用ITS和TEF-1α单基因系统发育分析,均能鉴定苍耳茎腐病菌为A.rolfsii。

A.rolfsii的寄主广泛,引起的病害在多种农作物、果树、蔬菜、花卉、中药材上被发现,且在不同区域有不同程度的发生和流行,主要病害有茎腐病、白绢病、南枯病等[31, 42-43]。如侵染花生引起白绢病[41]、感染苹果后造成白绢病[44]、寄生于甘蓝引起南枯病[45]、导致向日葵茎腐病[6]、引起白术白绢病[10]等。基于A.rolfsii寄主范围广泛,有学者提出和开展了以A.rolfsii作为生物除草剂的相关研究[46],但由于可能危害到农作物或其它有益植被,因此将其作为除草剂开发颇具挑战性。本研究首次从苍耳上分离鉴定了引起茎基腐病的病原菌A.rolfsii,考虑到这些分离物及其目前已报道的A.rolfsii之间的遗传多样性尚不清楚,不同病原分离物的致病性差异及其与不同寄主间相互作用机制理解的欠缺,因此,不同区域、不同寄主上的病原实际危害的寄主范围还需进一步考察验证。

A.rolfsii属于土壤习居真菌,腐生性和适应性极强,菌丝体特化形成的菌核在不利条件下或冬季于土壤表层休眠可存活多年,当气候适宜时又重新长出菌丝侵染植物根、茎基部或其它部位。A.rolfsii一旦成功侵染宿主植物,菌丝体生长快速,容易大面积爆发,加之病原易变异和产生抗药性,一直是其引起病害防治的难点[9]。目前对于A.rolfsii引起的病害仍以化学农药防治为主,田间施用广谱性杀菌剂具有较好防效。目前已有多种对白绢病或茎腐病防效较好的农药品种配方,但是相同农药在不同报道中防效存在差异。比如马琳[9]研究显示恶霉灵、氟硅唑和代森锰锌的1000倍稀释液对黄连白绢病的防效均达到93.3%及以上,而马瑞[24]室内药剂毒力测定结果表明99%恶霉灵、40%氟硅唑和80%代森锰锌对温郁金白绢病菌的EC50分别为31.42、0.54和30.62 mg/L,这可能是由于温郁金白绢病菌和黄连白绢病菌对恶霉灵和代森锰锌的敏感性差异所致。因此,有必要对不同植物寄主或区域流行的A.rolfsii进行杀菌剂敏感性检测,以期筛选低毒高效的农药品种。苍耳茎腐病菌室内毒力测定结果表明,NCXS-1为多菌灵、噻菌灵、甲基托布津、抑霉唑和腐霉利抗性分离物(5.0 mg/L无抑菌效果),与周锋等[23]报道的多菌灵、腐霉利、白绢病菌的敏感性(EC50为0.47 和0.62 mg/L)差异巨大,这可能与农业生产上大量使用化学农药导致其产生抗药性,EC50进而升高有关。苍耳茎腐病菌对咪鲜胺较为敏感,在5.0 mg/L时具有一定的抑菌效果,EC50为8.74 mg/L,比张佳星等[10]测定花生白菌病菌的咪鲜胺EC50(11.63 mg/L)低,这可能与病原菌株对药物敏感性差异有关;苍耳茎腐病菌对咯菌腈较为敏感,抑制效果最佳,EC50为0.12 mg/L,与张佳星等[10]测定白术白绢病菌的咯菌腈 EC50(0.13 mg/L)接近,而比黎杨凯[47]测定花生白绢病菌的咯菌腈EC50(0.22 mg/L)低,但差异不大。综上所述,本研究明确了苍耳茎腐病的病原,咯菌腈为所筛选7种杀真菌剂中抑制A.rolfsii生长效果最佳的农药品种,对于苍耳茎腐病的有效防治具有重要参考意义,后期可以深入开展田间防效试验。