52份枇杷种质资源遗传多样性分析与DNA指纹图谱构建

赵 科, 孙淑霞, 李 靖, 涂美艳, 王玲利, 何成勇, 徐子鸿, 江国良, 宋海岩, 陈 栋

(1.四川省农业科学院园艺研究所,成都 610066;2.农业农村部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,成都 610066)

【研究意义】四川大渡河流域是普通枇杷(EriobotryajaponicaL.)的发源地,枇杷栽培历史悠久,种质资源丰富。近年来,随着实生选种[1]、芽变选种[2]和杂交育种[3-4]工作的快速发展[5],生产中枇杷新品种明显增多,研发快速准确的种质资源鉴定方法对枇杷产业的良性发展具有重要意义。前人基于表型和地理分布的枇杷种质资源鉴定和分类方式容易受栽培条件和生态环境等因素影响[6-7],而基于DNA序列差异开发的分子标记检测技术具有准确度高、检测高效和操作简便等优势[8],为研究植物表型与基因型之间的联系提供了可靠工具。【前人研究进展】微卫星或简单序列重复(SSR)标记因具有共显性遗传、重现性、相对丰度、广泛的基因组覆盖、染色体特定位置和高通量基因分型等优势,在种质资源鉴定领域广泛应用[9]。近年来,育种家们围绕枇杷种质资源鉴定、倍性和果肉颜色等方面开发了系列分子标记。孙钧等[10]利用genic-SSR引物对14份白沙枇杷地方种质资源进行鉴定,并与现有白沙枇杷地方品种建立品种鉴定图(CID),为地方白肉枇杷种质资源的鉴定与产业化利用提供了依据;基于非整倍体材料基因剂量的不平衡效应,温国[11]从枇杷基因组中开发出17个连锁群的特异性非多态SSR标记,并结合qPCR技术准确检测染色体的非整倍性;宋海岩等[12]基于不同果肉颜色枇杷EjPSY2A基因的序列差异开发出2对InDel分子标记,准确鉴别黄肉和白肉枇杷种质资源及其EjPSY2A位点的显隐性,对指导白肉枇杷早龄选择育种具有重要意义。但由于枇杷基因组数据公布较晚[13-14],许多与分子标记紧密连锁的功能基因或片段未能被鉴定。DNA指纹图谱技术是对不同种质资源基因组DNA序列的组成和长度进行识别,获得其特有的图纹组成[15],在种质资源鉴定和功能基因定位等方面应用广泛[16]。目前已在枇杷中用于DNA指纹图谱构建和遗传多样性分析的分子标记有SSR[17]、ISSR[18]和SCoT[19]等。EST-SSR是基于转录组数据中表达序列标签(EST)集合开发的SSR标记,其开发成本低,功能基因识别率高,具备更高的使用价值[20-21],但目前关于枇杷EST-SSR标记开发和应用却鲜有报道。【本研究切入点】国家西南特色园艺作物种质资源圃(成都)现保存有国内外枇杷属种质资源200余份,是西南地区保存枇杷种质资源数量最多的综合性园艺作物种质资源圃。本研究利用国家西南特色园艺作物种质资源圃(成都)枇杷育种与栽培创新团队前期从黄肉洞庭枇杷及其白肉突变体果实发育期转录组数据中开发出的覆盖全基因组的277对EST-SSR标记和1对果肉颜色相关Indel标记[12, 22],对资源圃内近年来收集保存的52份国内外种质和本团队创制的杂交后代开展遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱。【拟解决的关键问题】丰富枇杷种质资源鉴定的分子标记,为枇杷种质资源鉴定和功能基因发掘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验地点

以国家西南特色园艺作物种质资源圃(成都)枇杷育种与栽培创新团队(104°18′47″ E,30°37′09″ N,海拔489 m)保存的52份国内外枇杷种质资源及创制的杂交后代为试材,其中21份为我国枇杷主产区的主栽品种,4份为国外收集的枇杷品种资源,1份为野生枇杷资源(表1),所有种质资源为8～10年生,株行距4 m×5 m,常规栽培管理措施。2021年5月收集枇杷幼嫩叶片用于DNA提取以及后续的基因分型工作。

表1 供试材料Table 1 Tested materials

1.2 枇杷DNA提取和PCR扩增

根据国家西南特色园艺作物种质资源圃(成都)前期开发的覆盖全基因组的277对EST-SSR标记和1对果肉颜色相关Indel分子标记设计并合成引物。用改良CTAB法提取枇杷gDNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测‘大五星’‘艳红’‘白沙’‘新白8号’4个主栽品种的分子标记多态性,用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳将筛选出条带清晰、多态性良好的引物对52份枇杷种质资源中进一步验证。PCR反应体系:1.0 μL DNA模板,12.5 μL 2×PCR Mix(擎科),1.0 μL 10 μmol/L正反向引物,加ddH2O至25.0 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性4 min;95 ℃变性1 min,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,循环35次;72 ℃彻底延伸10 min。

1.3 数据分析

根据扩增数据建立原始矩阵,应用NTSYSpc 2.20v软件计算Dice相似系数,根据各种质资源间的相似系数得到聚类分析图。以数字代表引物,字母代表不同带型,对不同引物扩增出的带型记录编号。使用WPS软件将每份枇杷种质资源指纹图谱上的数字或字母生成不同色块,每一个色块表示该枇杷种质资源对应引物扩增出的基因型,竖条表示该枇杷种质资源的指纹图谱,横条表示该引物扩增的全部基因型。

2 结果与分析

2.1 枇杷种质资源多态性引物筛选

利用‘大五星’‘艳红’‘白沙’和‘新白8号’等4份材料,从278对引物中初步筛选出12对带型清晰、稳定性和重复性好的引物,占4.32%,部分引物扩增效果如图1所示,引物信息如表2所示。随后将12对引物扩大到52份枇杷种质资源中筛选出扩增带型稳定并且不同样品之间具有明显差异的9对引物,分别为Ej77、Ej79、Ej85、Ej90、Ej115、Ej168、Ej171、Ej187和PSY2A-2。利用这9对引物对52份枇杷种质资源扩增,共获得765个条带,每对引物扩增条带数为2～5个,平均85个;多态性条带比率为40.00%～100.00%,平均71.55%;多态性信息含量(PIC)为0.250～0.999,平均0.685,有7对引物的PIC大于0.550,可以用于后续聚类分析和DNA指纹图谱的构建。

表2 筛选出的12对可用于构建指纹图谱的分子标记Table 2 12 pairs of molecular markers screened for use in constructing fingerprints

2.2 枇杷种质资源聚类分析

52份枇杷种质资源的平均遗传相似系数为0.791(图2);在相似系数D1=0.668处,可以将52份枇杷种质资源分为2类,第Ⅰ类为2份西班牙种质资源(‘培优’和‘乌里拉’),遗传相似系数为0.833,第Ⅱ类为剩余的50份枇杷种质资源。在相似系数D2=0.756处,可以将第Ⅰ类进一步划分为3类,第ⅰ类为育成品种(包括‘艳红’等)和创制的杂交后代(包括CB2-26等),共计38份种质资源;第ⅱ类包括栎叶枇杷和CB4-14等7份种质资源;第ⅲ类包括‘早钟6号’和W-4XC等5份种质资源,其中2份日本枇杷种质资源‘茂木’和日本红肉的遗传相似系数最大(0.977)。在相似系数D3=0.794处,可以将第ⅰ类种质细分为3类,第1类为育成品种(包括‘艳红’等)和创制的杂交后代(包括CB2-26等),共计19份黄肉枇杷种质资源;第2类为‘大五星’、TBY(洞庭枇杷)、‘黄蜜’和‘大白梨’4份种质资源,这4份种质资源既有黄肉又有白肉类型,可能是栽培中较早出现果肉颜色分化的种质资源;第3类为‘香种11号’‘新白7号’‘西蜀3号’‘新白8号’‘香妃’‘贵妃’‘白早钟7号’‘软条白沙’‘阳光白’‘冠玉’‘TBW’‘内江白’‘78-1’和‘白早钟5号’等14份白肉枇杷种质资源。果肉颜色一致或地理分布相近的枇杷种质资源被聚类到相近的分类单元中,可以准确将西班牙、日本与其他种质资源进行区分。此外,聚类分析结果表明西南特色园艺作物种质资源圃(成都)内现保存的枇杷种质资源遗传多样性丰富,但利用‘艳红’‘黄丰’等创制的杂交后代之间遗传相似系数较高。

图2 52份枇杷种质资源的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 52 loquat germplasm resources

2.3 枇杷种质资源DNA指纹图谱

将引物Ej77、Ej79、Ej85、Ej90、Ej115、Ej168、Ej171、Ej187和PSY2A-2分别命名为1、2、3、4、5、6、7、8和9号,根据带纹迁移率不同进行分组,组内的不同带纹以字母表示,缺失记为D。以8号引物Ej187为例(图3),1、2、3号样品分别读作8A、8A和8AB。将每份种质资源的9对引物扩增带型用上述方法记录,构成指纹图谱(表3)和色块矩阵(图4),24份枇杷种质资源可以通过指纹图谱区分,其中Ej90和Ej171可以特异性鉴别栎叶枇杷和‘茂木’。

1～52的材料名称见表1。1-52 meaning material names are the same as table 1.图3 8号引物Ej187的扩增结果Fig.3 Amplification results of primer No.8 Ej187

横轴为种质资源名称(同表1);纵轴为引物名称;1.Ej77;2.Ej79;3.Ej85;4.Ej90;5.Ej115;6.Ej168;7.Ej171;8.Ej187;9.PSY2A-2。 The horizontal axis is the name of germplasm resources(the same as table 1); The longitudinal axis is the primer name;1.Ej77; 2.Ej79; 3.Ej85; 4.Ej90; 5.Ej115; 6.Ej168; 7.Ej171; 8.Ej187; 9.PSY2A-2.图4 52份枇杷种质资源的DNA指纹图谱色块矩阵Fig.4 Color block matrix of DNA fingerprints of 52 loquat germplasm resources

表3 52份枇杷种质资源的数字DNA指纹图谱Table 3 Digital DNA fingerprints of 52 loquat germplasm resources

3 讨 论

DNA多态性是单一基因座等位基因变异性在群体水平的体现[23-24]。胡经煌[25]利用构建的群体开发多态性分子标记,发现1个新的抗白粉病基因Pm61。本研究筛选出扩增带型稳定且不同品种之间具有明显差异的9对引物。其中,Ej85是基于丝氨酸/苏氨酸激酶基因Sapk1的表达序列标签开发的分子标记,在栎叶枇杷等13份种质资源中出现了不同的带型,该基因在水稻[26]和黑麦草[27]等作物中被证实与抗逆性密切相关,表明不同枇杷种质资源中Sapk1基因可能存在不同等位基因并导致抗逆性差异。

聚类分析结果可以为枇杷种质资源的鉴定及核心种质筛选提供依据,平均遗传相似系数越低表明样本间的遗传多样性越丰富,样本间遗传相似系数越高亲缘关系则越近[28-29]。范付华等[30-31]采用ISSR标记构建了39份贵州野生枇杷种质资源的指纹图谱,供试材料的遗传相似性系数为0.40～0.98,在相似系数为0.70时,可将供试材料分成五大类。胡文舜等[32]采用SSR标记构建了19份枇杷杂交新品种的指纹图谱,供试材料的遗传相似性系数为0.728～0.969,平均相似系数为0.852。本研究中,保存于国家西南特色园艺作物种质资源圃(成都)的52份枇杷种质资源的相似系数为0.462～1.000,平均相似系数(0.791)介于野生枇杷种质资源和育成品种之间,表明资源圃内现保存的西南地区枇杷种质资源遗传多样性丰富。但利用‘艳红’和‘黄丰’等创制的杂交后代之间的平均遗传相似系数分别为0.986和1.000,今后还需要继续引进和收集国内外不同产区的枇杷种质资源丰富其遗传背景。

本研究还将指纹图谱进行数字化和图像化处理,其中24份枇杷种质资源具备特异性DNA指纹图谱,其余材料出现重复,这可能是由于本研究仅选择EST-SSR分子标记且部分种质资源亲缘关系较近。胡文舜等[32]利用6对枇杷EST-SSR引物、6对枇杷gSSR引物、6对苹果gSSR引物和1对梨gSSR引物构建24个枇杷品种的SSR指纹图谱,整合不同分子标记的鉴定结果后19个枇杷杂交新品种可以明确地相互区分。

4 结 论

52份枇杷种质资源的平均相似系数(0.791)介于野生枇杷种质资源和育成品种之间,表明西南地区枇杷种质资源具有丰富的遗传多样性。聚类分析结果显示,果肉颜色一致或地理分布相近的枇杷种质资源被聚类到相近的分类单元,该结果可以准确地将西班牙、日本枇杷种质资源与其他种质进行区分。本研究丰富了枇杷种质资源鉴定的分子标记,为今后发掘分子标记紧密连锁的功能基因或片段提供了研究基础。