30份割手密种质资源苗期抗旱性综合评价

吕绍芝,沈庆庆,饶席兵,钱禛锋,张蓉琼,何丽莲,3,李富生,3

(1. 云南农业大学农学与生物技术学院,昆明 650201;2. 云南农业大学甘蔗研究所,昆明 650201;3. 云南省作物生产与智慧农业重点实验室,昆明 650201)

【研究意义】甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是中国非常重要的能源作物和糖料作物。近几年来,干旱严重制约了中国的甘蔗生产,国内旱地种植的甘蔗所占比例已达 85%以上[1]。割手密(SaccharumspontaneumL.)具有很多适应自然逆境的优良性状,一直被作为甘蔗杂交育种过程中最重要的野生亲本,是抗逆基因的主要来源[2]。冬季和春季是种植甘蔗的季节,而云南在冬春季常常会发生干旱,这将会直接影响甘蔗的萌芽与出苗,进而影响甘蔗的产量及糖分积累[3]。杨建波等[4]研究表明,在苗期对甘蔗进行反复干旱胁迫处理,将对植株的长势产生较强的后续性效应,此效应对甘蔗生长发育的影响将会直接影响甘蔗产量。因此,综合评价甘蔗野生种质资源亲本苗期的抗旱性,对于优良抗旱亲本和抗旱基因的筛选与利用意义重大。【前人研究进展】在干旱胁迫条件下,作物能通过产生一系列生理生化变化(主要包括渗透调节、活性氧的清除和质膜透性的调节等方面)提高抗旱性,进而减轻干旱胁迫对其造成的伤害[5-7]。许文花等[8]研究发现,在割手密的伸长期进行干旱胁迫,不同材料间各个指标的耐旱系数存在差异,各材料的抗旱性与叶面积之间呈显著负相关。王天菊等[9]通过研究26份割手密种质材料伸长初期干旱胁迫前后的多项抗旱指标,发现在干旱胁迫后抗旱性较强的种质材料可以通过提高丙二醛含量、质膜透性、过氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量来提高抗旱性,并通过聚类分析和模糊隶属函数分析法筛选出1份高度抗旱材料。桃联安等[10]通过研究12份割手密F2代创新材料拔节初期干旱胁迫处理后的生理特性,发现干旱胁迫后材料的丙二醛含量增加、质膜透性增大,利用模糊隶属函数法筛选出5份抗旱性较强的材料。田春艳等[11]研究认为在拔节初期不同程度的干旱胁迫会对割手密后代的SOD活性、叶绿素(CHL)含量和可溶性蛋白(Pr)含量等指标产生影响,且随着胁迫程度的不断加重,植株的缺水症状会更加明显。经艳芬等[12]通过测定割手密及其F1代材料在干旱胁迫前后的多项指标,并通过模糊隶属函数法从28份材料中筛选出4份抗旱性特强的材料。【本研究切入点】近年来,已有众多国内外学者从多个角度对割手密抗旱性的指标和评价方法进行了研究,然而针对国内外不同基因型割手密苗期抗旱性综合评价的研究却鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究以30份不同基因型割手密种质为材料,在苗期对其进行干旱胁迫并测定其生理指标变化,结合主成分分析、模糊隶属函数、系统聚类等方法综合评价其抗旱性,旨在筛选出抗旱性较强的割手密种质,为甘蔗的抗旱性育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选择30份割手密无性系材料作为供试材料(表1)。割手密材料均取自于云南省省级甘蔗昆明种质资源圃(云南农业大学校园内,海拔1950 m)。

表1 供试材料基本情况Table 1 Basic information of test materials

1.2 试验设计

本试验于云南农业大学后山的塑料大棚内进行,首先将割手密种质材料均匀分兜,然后种植于塑料盆内,每份材料种植6盆。

于2022年5月4日供试材料处于苗期(大部分割手密幼苗具有5～6个叶片)时对割手密材料进行干旱胁迫处理。将每份材料随机分为2组,每组3盆。一组作为对照(CK),正常供水,另一组作为干旱胁迫处理(DT),停止供水。于每天上午9:00观察材料的生长情况,采用烘干法跟踪测定盆内土壤的相对含水量,当干旱胁迫处理达到重度胁迫(9 d)时土壤中的相对含水量为7.5%～10.0%[13],此时停止干旱胁迫。

1.3 抗旱性指标测定

干旱胁迫结束后,对全部供试材料的+1叶进行取样,迅速放置在封口袋中并带回实验室,将其放于-80 ℃冰箱中保存备用。测定相同抗旱指标时剪取叶片的同一个部位,将叶片的主脉剪去。测定的抗旱指标包括丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、可溶性糖(SS)含量和过氧化氢酶(CAT)活性,以上指标均用苏州格锐思生物科技有限公司生产的试剂盒进行检测。

1.4 统计分析

数据整理和统计软件为Excel 2010和SPSS 25.0。

1.4.1 计算抗旱系数 抗旱系数=该指标干旱处理的指标值/该指标正常浇水的指标值。

1.4.2 计算隶属函数值 隶属函数值参照李晓君等[14]的方法计算,当所测指标与抗旱性呈正相关时按公式(1)计算,呈负相关时则按反隶属函数即公式(2)计算。

R(Vi)=(Vi-Vmin)/(Vmax-Vmin)

(1)

R(Vi)=1-(Vi-Xmin)/(Vmax-Vmin)

(2)

式中,Vi表示某一材料的某一指标测定值,Vmax为所测指标的最大值,Vmin为所测指标最小值,为了判断不同材料的抗旱性强弱,计算出苗期各材料隶属函数值的平均值,隶属函数值均值越大,抗旱能力越强。

1.4.3 计算综合指标的权重 参照刘硕等[15]的方法计算各综合指标的权重。

(3)

式中,Hj是指某一综合指标的贡献率。

1.4.4 计算参试材料的综合评价值

(4)

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下割手密材料各指标的变异分析

由表2可知,干旱胁迫处理后,割手密材料的过氧化氢酶活性为166.59～1252.24 U/g,平均为706.10 U/g,较对照上升233.25 U/g;丙二醛含量为19.27～69.02 nmol/g,平均为35.99 nmol/g,较对照上升5.42 nmol/g。另外,过氧化物酶活性均值、超氧化物歧化酶活性均值、可溶性糖含量均值和脯氨酸含量均值较对照分别上升117.87 U/g、857.72 U/g、7.31 mg/g、321.46 μg/g。由此可见,不同的割手密材料,其抗旱性与多种指标相关,只运用单一指标难以对参试材料的抗旱性进行准确评价,因此需要对各项指标进行综合评价。

表2 不同处理割手密苗期各指标的描述性统计Table 2 Descriptive statistics of the seedling stage for S. spontaneum under different treatments

2.2 干旱胁迫下割手密主要生理指标的相关性分析

由表3可知,在干旱胁迫下,30份割手密种质材料的过氧化氢酶活性和脯氨酸含量之间呈显著正相关(P<0.05),超氧化物酶活性和脯氨酸之间呈极显著正相关(P<0.01);过氧化物酶活性与超氧化物歧化酶活性之间、过氧化氢酶活性与丙二醛含量之间呈显著负相关,其他指标之间无显著相关性(P>0.05)。由此可见,在干旱胁迫下,不同割手密材料的各个抗旱指标之间存在一定的协同性和拮抗性。

表3 抗旱生理指标的相关系数矩阵Table 3 Correlation coefficient matrix of physiological indexes of drought resistance

2.3 割手密苗期的抗旱隶属函数比较

通过模糊隶属函数法计算出干旱胁迫下各性状的隶属函数均值,对抗旱性进行综合评价(表4)。在干旱胁迫下,90-53是30份割手密材料中抗旱性最强的,最弱的是I91-61,其余材料的抗旱性由强到弱排序为 Ⅱ91-126>2015-22>I91-17>2015-50>90-33> IND81-138> IND81-164>2015-6>2015-83>89-2>90-37>88-301>87-13>84-260>82-25>90-22>90-15>84-261>88-284>2015-104>2015-89>2015-57>90-20>2015-88>2013-13>88-283>2013-26>I91-10>I91-10。

表4 试验材料各指标的模糊隶属函数值比较Table 4 Comparison of fuzzy membership function values for indicators of the test materials

2.4 割手密种质材料的抗旱性综合评价

2.4.1 主成分分析 以30份割手密材料所有指标的抗旱系数为基础进行主成分分析,计算出各主成分的特征向量和贡献率(表5)。前3个主成分的累积贡献率达74.72%,因此原来的6个抗旱指标能够转换成另外3个综合抗旱性指标,分别用P1、P2、P3表示。在第一主成分中,SOD活性和脯氨酸含量的系数较大,故该主成分代表了SOD活性和脯氨酸含量;第二主成分代表了CAT活性、POD活性和可溶性糖含量;第三主成分代表了MDA含量。表明6个生理生化指标均可作为评价割手密抗旱性的指标。

表5 主成分的特征向量及其贡献率Table 5 Eigenvectors and eigenvalues of principal components

2.4.2 模糊隶属函数分析 首先计算出3个主成分综合指标所对应的隶属函数值,基于3个指标的贡献率可得到3个指标的权重(Ej),然后通过公式(4)计算出割手密抗旱性评价的综合评价值(D),最后对D值进行排序(表6)。根据综合D值排名前5的割手密依次为90-53、2015-22、88-301、II91-126、2015-50,仅90-53、2015-22、II91-126、2015-50还位居前5,这个结果与仅根据各项生理指标计算出的隶属函数均值进行评价的结果存在一定差异。以生理指标计算出的隶属函数均值为依据评价上述5份材料,其抗旱性强弱为90-53>II91-126>2015-22>I91-17>2015-50。说明,仅凭借一种方法对割手密的抗旱性进行评价容易造成误判,需结合多种方法进行综合性评价。

表6 参试材料的综合指标值、隶属函数值和D值Table 6 The values of comprehensive index, membership function and D value of the test materials

2.4.3 聚类分析 采用系统聚类法对所有参试材料的综合D值进行聚类分析,由图1可知,在欧氏距离7处可以将30份割手密材料划分为高度抗旱、中高度抗旱、中度抗旱、低度抗旱4类,90-53自成一类,可列为高度抗旱型材料,占供试材料的3.33%;2015-22、88-301聚为一类,为中高度抗旱型材料,占供试材料的6.67%;I91-17、II91-126、2015-50、2013-26、88-283、90-37、IND81-138、2015-6、I91-10、2015-57、87-13、2015-83、90-22、90-33共14份材料聚为一类,为中度抗旱型材料,占供试材料的46.67%;低度抗旱类型的13份材料聚为一类,分别为90-15、2015-89、82-25、84-261、88-284、2013-13、90-20、2015-88、I91-61、84-260、89-2、IND81-164、2015-104,占供试材料的43.33%。

图1 30份割手密材料的系统聚类图Fig.1 System cluster of fuzzy subordination values of thirty S. spontaneum materials

3 讨 论

3.1 干旱胁迫对割手密生理指标的影响

割手密的抗旱性是一个比较复杂的综合性状表现,其反应在一系列的生理变化上。在植物遭受干旱胁迫时会导致活性氧(ROS)生成增加[16],这些ROS会对细胞膜、蛋白质、酶活性、RNA 和 DNA 造成氧化损伤[17]。本研究表明,割手密种质材料的SOD、POD、CAT活性在干旱胁迫后均有不同程度上升,说明植物通过抗氧化酶系统有效提高植物抗氧化能力并对ROS进行有效清除来减轻其对植物细胞造成的损伤[5],本研究结果与彭云玲等[18]认为干旱胁迫处理后这3种抗氧化酶活性均会增加的结果一致。脯氨酸积累可以减少细胞损伤、增加细胞渗透潜力、促进水分吸收。而在胁迫期间,可溶性糖也可维持液泡和细胞质之间的渗透平衡,从而保证植物细胞可以正常进行一系列的代谢活动[19]。本研究发现,割手密材料干旱胁迫后的可溶性糖和脯氨酸含量均有不同程度的上升,说明不同的渗透调节物质对其在干旱胁迫条件下对渗透调节作用的贡献存在差异。前人研究表明,干旱胁迫会导致植物脂质过氧化作用增加,而脂质过氧化作用是以 MDA 含量来衡量的,MDA 是一种众所周知的氧化损伤标记物[20]。本研究表明,干旱胁迫后MDA 含量也有一定程度的增加,但其增加幅度低于本研究中测定的其余5个指标,这可能是因为MDA 含量增加使植株的细胞膜受到损伤的同时,抗氧化酶系统可以迅速清除有害物质,进而减轻脂质过氧化对细胞造成的损伤,使细胞能够正常地发挥其生理功能[21]。

3.2 干旱胁迫下各生理指标之间的相关性分析

本研究中,干旱胁迫后割手密材料的各生理指标之间存在一定的协同性和拮抗性,其中SOD活性和POD活性之间呈显著负相关,这与李晓君等[14]研究发现甘蔗苗期干旱胁迫处理后SOD活性和POD活性呈正相关的结果不一致,这可能是因为所选取的材料及材料受干旱胁迫的时间和程度不同,导致酶活性的变化趋势出现差异。在王立伟等[22]的研究中,燕麦幼苗的SOD活性随着干旱胁迫时间的延长呈先升高后降低趋势。不同割手密种质材料对干旱胁迫的响应机制不尽相同,干旱胁迫后所产生的生理变化也存在差异。只运用某一单一指标的评价结果与多个指标综合评价得出的结果并不完全一致,因此为了得到更加准确可靠的评价结果,需采用多个指标进行综合性评价[23]。

3.3 割手密抗旱性综合评价

将主成分分析、模糊隶属函数和系统聚类这3种方法结合运用到割手密种质材料的抗旱性综合评价中,可消除单一指标带来的偏差、区分出各种质的抗旱等级,使得评价的结果与实际的结果较接近[24]。本研究结合这3种方法,对30份割手密种质材料的6个生理生化指标进行综合评价,比较这些材料的抗旱能力,结果表明90-53的抗旱性最强,其次为2015-22和88-301,而2015-104的抗旱性最弱,聚类分析可以将30份割手密种质材料划分为高度抗旱、中高度抗旱、中度抗旱、低度抗旱4类。前人研究表明基于主成分分析和模糊隶属函数分析计算出的D值进行系统聚类分析的方法,结果与各材料田间表现出的实际抗旱性更接近[15, 25],这与本研究得到的结果一致。

经艳芬等[12]研究认为割手密及其血缘材料的抗旱性较复杂,植株在生长发育过程中所表现出的抗旱性强弱和遗传机理会因时期不同而产生差异。另外,抗旱性评价结果的差异也与供试材料、评价指标和评价方法的不同有很大关系,因此应该从多角度出发分析割手密的抗旱性,本研究仅根据苗期的生理指标进行抗旱性的综合评价,具有一定的局限性。为了对割手密种质进行更加全面的抗旱性评价,需要对多个关键的生育时期进行干旱胁迫,并结合多种抗旱指标与多种评价方法,建立一套标准的综合评价体系。

4 结 论

割手密在干旱胁迫条件下可以通过提高CAT、SOD、POD活性以及积累可溶性糖和脯氨酸来减轻植株中MDA含量增加而导致的细胞膜脂质过氧化对细胞造成的损伤。通过主成分分析、模糊隶属函数和系统聚类相结合的方法对供试的30份材料的抗旱性进行综合评价,其中90-53的抗旱性最强,2015-22、88-301次之,2015-104的抗旱性最弱。