改进QuEChERS方法结合超高效液相色谱-串联质谱法快速测定藏茶中88种农药残留

严晓贤，仝凯旋，朱浙辉，谢瑜杰，吴兴强，常巧英，石志红，范春林，陈 辉*

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.河北大学 化学与材料科学学院，河北 保定 071002；3.西藏自治区产品质量监督检验所，西藏 拉萨 850000）

藏茶是一种黑茶，起源于唐朝，已有上千年历史［1］。它是藏族人民的养生之茶，因独特的口感和丰富的营养价值而受到广泛欢迎。藏茶在种植过程中可能会过量使用农药来防治病虫害，因此，农药残留是影响藏茶“绿色健康”属性的重要因素。针对茶叶中农药残留安全问题，我国实行GB 2763-2021《食品中农药最大残留限量》［2］标准，该标准规定了106种农药在茶叶中的最大残留限量（MRL），比2019 版增加了丁硫克百威、毒虫畏、二溴磷、乐果、氯磺隆等41 种农药［3］。GB 2763.1-2022《食品中2，4-滴丁酸钠盐等112 种农药最大残留限量》中，新增了马拉硫磷、仲丁威等4 种农药在茶叶中的MRL［4］，为我国茶叶产品中农药残留监管提供了依据。

目前，农药残留的前处理方式主要有固相萃取［5］、QuEChERS［6-7］、分散液液微萃取［8］以及磁固相萃取［9］等技术。QuEChERS可根据不同基质样品选择合适的净化材料进行净化，从而降低干扰物对目标分析物的干扰，提高检测的灵敏度和准确性。高尧华等［10］选用N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）和十八烷基键合硅胶（C18）填料对绿茶样品进行净化，通过气相色谱-三重四极杆质谱法检测绿茶中的35种农药。方俊兰等［11］同样使用PSA、GCB和C18填料对红茶和绿茶样品进行净化，通过超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱对茶叶中的166 种农药进行筛查。许芮菡等［12］利用多壁碳纳米管（MWCNTs）为主的净化填料对茶叶样品进行净化，采用气相色谱-串联质谱测定10 种拟除虫菊酯类农药。上述研究显示出QuEChERS 方法在茶叶农药残留分析中的重要应用，同时也突出了不同吸附剂组合在净化过程中的关键作用。

由于藏茶种植环境、加工工艺等条件与红茶或绿茶存在较大差异，茶褐素等成分明显高于普通茶叶［13-14］，增加了前处理净化难度，对检测结果的准确性造成较大影响。交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）吸附剂成本低，由于其特殊的分子结构，能较好去除茶褐素、多酚和儿茶素等［15］。本文依据GB 2763-2021和GB 2763.1-2022标准以及相关文献［16-18］报道，以茶叶中88种风险较高农药为研究对象，采用以PVPP 为主的吸附材料作为QuEChERS 前处理方法的净化剂，用于藏茶基质净化，建立了藏茶中88 种农药的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。该方法已应用于实际样品检测，可为藏茶中农药残留监测与风险防范提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY 超高效液相色谱仪配有Xevo TQ-S cronos 三重四极杆质谱仪（美国Waters 公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；N-EVAP112 氮吹浓缩仪（美国Organomation Associates 公司）；SR-2DS 型水平振荡器（日本TATEC 公司）；Allegra X-30R离心机（美国Becakmen Coulter 公司）；PL602-L电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

88 种农药标准溶液（纯度均大于98%，天津阿尔塔科技有限公司）；甲酸、甲酸铵（质谱级，美国Agilent 公司）；乙腈、甲醇（色谱级，美国Thermo Fisher 公司）；乙酸、氯化钠、无水硫酸镁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；GCB、C18、PSA（上海安谱实验科技股份有限公司）；交联聚乙烯基吡咯烷酮（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

藏茶样品购于西藏本地市场，将样品放入粉碎机中粉碎，过425 µm的标准网筛，混匀后放入自封袋中，置于4 ℃冷藏备用。

1.2 标准溶液的配制

将88种农药（质量浓度均为1 000 µg/mL）分为Ⅰ组、Ⅱ组，精密移取各农药标准溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀后得到10 mg/L的混合标准储备溶液，于4 ℃避光保存。精密移取混合标准储备溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释，配制成1 mg/L的混合标准工作液，于4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

根据Huang 等［16］的前处理方法进行改进，具体步骤为：精确称取2 g 粉末状藏茶（精确至±0.01 g）于50 mL 离心管中，加入2 mL 超纯水后，涡旋30 s，静置10 min。加入10 mL 的1%乙酸乙腈提取溶剂和锆珠4颗，涡旋1 min。再加入2 g NaCl，涡旋30 s，振荡5 min，离心（10000 r/min）5 min。取3 mL上清液至15 mL 离心管（含100 mg C18+200 mg PVPP+30 mg GCB）中，涡旋1 min，振荡5 min，离心5 min（4 200 r/min）。取1 mL 上清液，加入10 mL 玻璃离心管中，40 ℃水浴氮吹至干后，用1 mL 乙腈-水溶液（体积比3∶2）超声复溶，经0.22 µm滤膜过滤后，待测定。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 µm），柱温：40 ℃，进样体积：2 µL；流动相：A为0.01%甲酸水溶液（含2 mmol/L甲酸铵），B为0.01%甲酸甲醇。梯度洗脱程序：0～1.5 min，2% B；1.5～2 min，2%～10% B；2～6 min，10%～80% B；6～7 min，80%～90% B；7～10.5 min，90% B；10.5～11 min，90%～70% B；11～12.5 min，70%～2% B；12.5～15 min，2% B；流速：0.3 mL/min。

1.3.2 质谱条件电喷雾离子源：正离子扫描（ESI+），离子源温度：150 ℃；电喷雾电压：2.0 kV；脱溶剂气温度：550 ℃；脱溶剂气流速：800 L/h；锥孔气流速：50 L/h；多反应监测（MRM）模式检测。

由此对照当代个别忘记了初心、高高在上的官员，会发现他们太把自己当回事儿了。比如新闻里曝光过的“史上最牛环保局长”福建省长乐市环保局原局长陈桂光接到记者询问的电话说：“你也不要打我电话，一打就打局长，局长很不值钱是不是……你随便的一个群众就打我电话……”记者问：“一般群众不能给你打电话是吗？”局长说：“当然不能打电话，我电话为什么要让你打……”此局长官员群众界限分明，群众连打他的电话都不能，更何谈让这样的官员到群众中去，乃至让他爱民如子！

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

配制质量浓度为50 µg/L的88种农药混合标准溶液，在MS Scan模式下分别对农药进行一级质谱分析，通过优化锥孔电压获得每种农药具有最高响应信号的母离子。在Daughter Scan 模式下对母离子进行二级质谱分析，优化碰撞能量，选择响应信号最强的两个子离子分别作为定量离子和定性离子。88种农药的保留时间和质谱参数见表1。

表1 88种农药的保留时间及质谱参数Table 1 Retention times and mass spectrometry parameters of 88 pesticides

（续表1）

2.2 流动相的选择

以0.01%甲酸水溶液（含2 mmol/L 甲酸铵）为水相，考察了甲醇和乙腈两种体系对目标农药响应值与峰形的影响，结果表明，相较于乙腈，选用甲醇能提高加氢峰母离子农药或加铵峰母离子农药的响应值。在正离子扫描模式下，加入少量甲酸和甲酸铵能促进目标化合物离子化，提高化合物的质谱峰响应［19］。对比了0.01%甲酸水溶液（含2 mmol/L甲酸铵）-0.01%甲酸甲醇、0.01%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸铵）-0.01%甲酸甲醇、0.05%甲酸水溶液（含2 mmol/L甲酸铵）-0.05%甲酸甲醇、0.1%甲酸水溶液（含2 mmol/L甲酸铵）-0.1%甲酸甲醇4 组流动相对目标农药峰形和响应值的影响。结果表明，随着甲酸体积分数和甲酸铵浓度的增加，特丁硫磷、甲萘威、三唑酮等农药的响应值呈先升后降趋势。当甲酸体积分数为0.01%，甲酸铵浓度为2 mmol/L 时，目标农药的响应值和峰形达到最优，因此选用0.01%甲酸水溶液（含2 mmol/L 甲酸铵）-0.01%甲酸甲醇作为流动相。88 种农药混合标准溶液（100µg/mL）的总离子流图（TIC）见图1。

图1 88种农药混合标准溶液（100 µg/mL）的总离子流图Fig.1 TIC of 88 pesticides mixed standard solution（100 µg/mL）

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 水化体积的优化藏茶属于干燥样品，因此在样品提取前加入少量水浸润，可以有效提高目标化合物的提取效率，获得较好的回收效果。在50 µg/kg 加标水平下，考察了分别加入0、1、2、3、4 mL 水时对目标农药回收率的影响（图2）。结果表明，在不加水的情况下，虽然提取溶液中色素等杂质较少，但仅有60种目标农药的回收率在70% ～120%。加水量过多时，可能因提取基质更多，导致基质效应较大，回收率在70% ～120%之间的目标农药减少。当加水量为2 mL时，回收率在70% ～120%条件的目标农药数量最多。因此，本文选用2 mL加水量作为最优水化体积。

图2 不同水化体积对农药回收率和满足要求农药数量的影响Fig.2 Effect of different hydration volumes on recoveries and the amount of pesticides meeting requirements

2.3.2 提取溶剂的优化分别考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为提取溶剂对藏茶中目标农药回收率的影响。结果表明，相较于甲醇和乙酸乙酯，乙腈作为提取溶剂时的残留杂质较少，回收率在70%～120%之间的目标农药数量最多（图3）。由于敌敌畏、乐果等在碱性环境中较为敏感，且易分解，需在乙腈溶剂中加入适量乙酸调节溶液的pH 值。因此，考察了1%乙酸乙腈、2%乙酸乙腈、4%乙酸乙腈对藏茶中目标农药的提取效率（图3）。实验发现，相较于乙腈，使用1%乙酸乙腈作为提取溶剂时，烯啶虫胺、甲拌磷、苯线磷等60 种目标农药的回收率增加。随着酸度的增加，回收率在70%～120%之间的农药数量基本相同，但有68 种农药的响应明显降低。本研究选择1%乙酸乙腈作为提取溶剂。

图3 不同提取溶剂对满足要求农药数量的影响Fig.3 Effect of different extraction solvents on the amount of pesticides meeting requirements

2.3.3 萃取盐的优化考察了1 g NaCl、2 g NaCl、3 g NaCl、2 g NaCl+4 g MgSO4共4 种不同加入量的萃取盐对藏茶中农药回收率及满足要求农药数量的影响。结果显示（图4），采用上述萃取盐时满足回收率在70%～120%之间的农药数量分别为79、86、82、85种，其中加入2 g NaCl 时的提取和分离效果优于1 g NaCl 和3 g NaCl，加入2 g NaCl+4 g MgSO4时满足回收率要求的农药数量和平均回收率与加入2 g NaCl 基本相同。考虑绿色环保与节省成本，本研究选择2 g NaCl进行后续优化。

图4 不同加入量的萃取盐对农药回收率和满足要求农药数量的影响Fig.4 Effect of different additions of extraction salts on recovery and the amount of pesticides meeting requirements

2.3.4 净化填料的优化常用的吸附剂填料PSA、C18、GCB 能有效去除藏茶中的有机酸、糖类、脂肪、色素等物质，PVPP可去除多酚、茶褐素等物质。因此，选用PSA、C18、GCB、PVPP对样品进行净化处理。

在50 µg/kg 加标水平下，考察了5 种不同组合的吸附剂填料：150 mg PSA+150 mg C18+30 mg GCB+150 mg PVPP（A）、150 mg C18+30 mg GCB+150 mg PVPP（B）、150 mg C18+30 mg GCB（C）、30 mg GCB+150 mg PVPP（D）、150 mg C18+150 mg PVPP（E）对目标农药回收率的影响。结果表明（图5），采用A、B 组时目标农药回收率在70%～120%范围内的数量基本一致，尽管PVPP与PSA对茶叶基质中极性干扰化合物的减少程度近似［20］，但考虑成本原因，后续使用更为廉价的PVPP作为净化填料。B 组相较于C 组，有97.72%目标农药的基质效应下降，且C组目标农药回收率在70%～120%范围内的数量低于其余4组，证明加入PVPP 能有效降低基质效应，提高农药的回收率。D 组相较于B 组，克百威、仲丁威、地虫硫磷、三唑酮、敌敌畏的回收率均大于120%，灭线磷、甲基异柳磷、氯噻啉等农药的回收率增至115% ～120%之间，证明加入C18能有效吸附藏茶基质中的杂质。与E 组对比，B 组中低基质效应的农药数量占比比E 组多7%，说明GCB 的加入可以明显净化色素，降低基质干扰。最终选用C18、PVPP和GCB吸附剂进行优化。

图5 B组对比于C组的基质效应降幅程度和不同吸附剂组合对满足要求农药数量的影响Fig.5 Reduction degree of matrix effect in group B versus group C and the effect of different adsorbent combinations on the number of pesticides meeting the requirements

2.4 基质效应

基质效应（ME）通常在样品离子化过程中出现，会影响分析结果的准确性和可靠性，主要表现为基质抑制或基质增强［21］。计算公式为：ME（%）=（基质匹配标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率-1）×100%，当|ME|≤20%时为弱基质效应；20%＜|ME|≤50%时为中等基质效应；|ME|＞50%时为较强基质效应［22］。

藏茶中基质较为复杂，基质中组分和共提取物易干扰目标农药离子，导致离子增强或抑制。本文通过测定基质标准溶液（0.5、1、2、5、10、50、100、200、500、1000 µg/kg）和对应的溶剂标准溶液（0.1、0.2、0.4、1、2、10、20、40、100、200 µg/L），建立基质标准曲线和溶剂标准曲线并计算ME。结果表明，藏茶基质中54.5%的目标物农药属于中等和弱基质效应。为避免基质干扰，通过基质匹配校准法降低基质对目标农药的影响。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系、检出限与定量下限根据前述的样品前处理方法，以空白藏茶样品制备一系列不同质量浓度的基质匹配标准溶液，绘制基质匹配标准曲线。以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）分别确定检出限（LOD）和定量下限（LOQ）。结果表明，所有目标农药在相应质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）为0.9990～0.9999；LOD 和LOQ 分别为0.15～3 µg/kg 和0.5～10 µg/kg，除特丁硫磷外，其余农药的LOQ均小于10 µg/kg（表2）。

表2 藏茶中农药的线性范围、相关系数、检出限、定量下限、回收率及相对标准偏差Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，LODs，LOQs，recoveries and relative standard deviations of pesticides in Tibetan tea

2.5.2 回收率与相对标准偏差选用空白藏茶样品，分别添加1、2、10倍LOQ浓度水平的88种目标农药，进行空白加标实验。结果表明，藏茶样品中88 种农药在上述加标水平下的回收率分别为73.2%～108%、73.2%～109%、72.5%～110%，相对标准偏差（RSD）均不大于12%（表2），该方法的准确度和精密度满足农药多残留检测要求。

(续表2)

2.6 实际样品检测

采用本方法对12 份市售藏茶样品进行检测，共检出28 种农药，检出频次最多的农药主要有啶虫脒、联苯菊酯、噻嗪酮、多菌灵、毒死蜱、噻虫胺、吡虫啉等（见表3）。其中检出频次最多农药多菌灵及超标农药吡虫啉的MRM 图和二级质谱图如图6 和图7 所示。有6 种检出农药在GB 2763-2021 和GB 2763.1-2022中未规定MRL，分别为氯虫苯甲酰胺、敌敌畏、丙环唑、戊唑醇、三唑醇、甲硫威及其代谢物，表明在藏茶种植过程中存在超范围使用农药的情况；有4 批次样品中吡虫啉超过限量值，其余检出农药的残留量均低于MRL。

图6 多菌灵的MRM色谱图（A）与二级质谱图（B）Fig.6 MRM chromatograms（A） and secondary mass spectrum（B） of carbendazim

图7 吡虫啉的MRM色谱图（A）和二级质谱图（B）Fig.7 MRM chromatograms（A） and secondary mass spectrum（B） of imidacloprid

表3 藏茶实际样品中农药检出结果Table 3 Detection results of 88 pesticides in actual samples of Tibetan tea

3 结 论

本文采用改进的QuEChERS 结合UPLC-MS/MS 分析技术，建立了藏茶中88 种农药的快速检测方法，使用成本更低的PVPP 代替PSA，与C18、GCB 组合对样品进行净化，降低了样品前处理成本，并在最优条件下对藏茶样品进行检测。该方法具有较好的灵敏度、高效性以及适用性，满足农药多残留检测技术要求，可弥补藏茶中农药残留检测方法的空白，为藏茶农药残留监测和质量安全提供了重要的技术和数据支持。