基于UPLC-Q-TOF MS 鉴定复方香薷水化学成分

林结玲，周 熙，赵 昕，遆慧慧*

（1.广东药科大学 药学院，广东 广州 510006；2.广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070）

复方香薷水是一种中药复方制剂，源于宋朝《太平惠民和剂局方》经典验方香薷饮，由9 种单味药材组成，分别为生姜、木香、歪叶蓝、皱叶香薷、广藿香、紫苏叶、厚朴、豆蔻、甘草，其中皱叶香薷为君药，广藿香、紫苏叶为臣药，甘草、生姜为使药［1］。复方香薷水临床疗效确切，可有效治疗暑湿感冒、胃肠型感冒、急性胃肠炎、风寒感冒等疾病［2］。复方香薷水现有研究多集中于临床疗效评价，其化学成分研究匮乏，同时活性成分及其作用机制不明确，质量标准控制单一，如谢婷［3］开发的一种测定复方香薷水中木香烃内酯、麝香草酚、去氢木香内酯、香荆芥酚和迷迭香酸含量的方法。然而中药复方具有多成分多靶点的特征，单一成分含量表征难以全面反映复方香薷水的整体质量，因此，复方香薷水的物质基础研究对阐明其药理药效和质量控制具有重要意义。

超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS）是常用于中药复方定性、定量分析的仪器，具有分离效果好、灵敏度高、准确度高与特异性强等优点，可用于中药复方的物质基础、成分含量、血清药物化学、药代动力学以及代谢组学等多方面研究［4-5］。本研究基于UPLC-Q-TOF MS 技术对复方香薷水进行定性分析，并对鉴定成分进行药材归属，为其质量控制指标筛选、安全性评价以及药效物质基础研究提供了理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

UPLC-Q-TOF MS仪，配备电喷雾离子源，紫外检测器，以及数据处理工作站Mass Hunter 10.0（美国Agilent 公司）；KQ2200 型机械超声波清洗器（东莞市超声波设备有限公司）；电子天平（美国Sartorious公司）。

对照品：鸟苷、水苏碱、咖啡酸购自中国食品药品检定研究院；迷迭香酸、原儿茶素、木犀草素-7-葡萄糖醛酸、维采宁-2、7-羟基香豆素、新甘草苷、芹菜素-7-葡萄糖醛酸、新异甘草苷购自成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草素-7-二葡萄糖苷酸购自上海源叶生物科技有限公司；木犀草苷、芹菜素、甘草酸、紫丁香苷、丹参素、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、柠檬酸、L-焦谷氨酸、甘草苷、异绿原酸C 购自上海诗丹德生物技术有限公司；苹果酸购自坛墨质检科技有限公司。所有对照品的纯度均大于98%。

甲醇、乙醇、乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二次蒸馏水（中国香港屈臣氏公司）。

复方香薷水及其单味药材生姜、木香、歪叶蓝、皱叶香薷、广藿香、紫苏叶、厚朴、豆蔻、甘草购自广州一品红制药有限公司。

1.2 样品制备

复方香薷水单味药材粉碎过筛，各取0.5 g 至20 mL 50%甲醇水溶液，超声30 min，离心（时间：10 min，转速：10 000 r/min，温度：20 ℃），取上清液过滤装瓶。复方香薷水用50%甲醇稀释10倍。

取上述对照品各称取10 mg左右加入到10 mL容量瓶中，再加入50%甲醇溶解并定容至刻度线，作为对照品储备液。其中同分异构体绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸和甘草苷、异甘草苷、新甘草苷、新异甘草苷分别稀释成1 mg/L的单标，其他的标样制成1 mg/L的混标。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱为Agilent Phe Hex（150 mm×2.1 mm，1.9 µm）；0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相；梯度洗脱：0～5 min，5%～10% B；5～20 min，10%～30% B；20～35 min，30%～40% B；35～55 min，40%～60% B；55～60 min，60%～75% B；60～65 min，75% B，体积流量为0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量1 µL。

质谱条件：UPLC-Q-TOF MS/MS系统，配置ESI 离子源。毛细管电压为1000V，雾化气压0.24 MPa，干燥气流速8 L/min，干燥气温度300 ℃。在正、负离子模式下采集数据，碰撞能量为10、20、40 eV，一级质谱扫描范围：m/z100～1000，二级质谱扫描范围：m/z40～1000。

1.4 数据分析

对于有对照品的化学成分，通过比对对照品的保留时间、精确质量数和二级质谱图等信息进行确认。对于无对照品的化合物，采用Mass Hunter 10.0 软件提取其一级精确质量数、二级碎片，结合Pubchem 与安捷伦中药化合物质谱数据库以及查阅文献进行定性分析。对存在于总离子流图（TIC 图），但在数据库上找不到匹配的化合物，可通过分子式以及二级离子碎裂规律推测其可能结构，结合Pubchem数据库进一步鉴定确认。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

本研究利用现代分析技术，结合数据库和文献，对复方香薷水的化学成分进行定性分析。实验前期对前处理和色谱条件进行了系统优化，前处理优化包含优化溶剂种类，超声时间以及离心时间；色谱条件则通过优化色谱柱、流动相、流动相pH、流速、柱温及洗脱梯度，筛选出最佳实验方案。其中溶剂考察了50%甲醇-水、75%甲醇-水及甲醇对分离分析的影响，结果发现，采用50%甲醇稀释的色谱图峰信息多、峰响应值高，故选择50%甲醇作为溶剂。其他优化实验条件见“1.2”和“1.3”。

2.2 成分分析与鉴定

采用UPLC-Q-TOF MS 技术，在优化后的仪器条件下对复方香薷水稀释液进行分析，Mass Hunter 10.0软件处理采集数据，得到其正、负离子模式下的TIC图（见图1）。最终鉴定出112个化合物，包含25个对照品的确认。其中黄酮类22个，苯丙素类20个、有机酸18个、萜类14个、生物碱11个、氨基酸5个以及其他类型化合物22个（见表1）。

表1 UPLC-Q-TOF MS 技术鉴定复方香薷水中的化学成分Table 1 Identification of chemical constituents from Fu Fang Xiang Zuo Shui by UPLC-Q-TOF MS 12

图1 复方香薷水的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of Fu Fang Xiang Zuo Shui

2.2.1 黄酮类化合物黄酮类是皱叶香薷、广藿香和紫苏叶的重要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗抑郁、抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）和α-葡萄糖苷酶活性等药理作用［6-8］。黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为基本母核的一类化合物，包含黄酮苷元与黄酮苷。本研究从复方香薷水中共鉴定出22个黄酮类化合物，根据结合的糖数量可以分为苷元、单糖苷、双糖苷。这些化合物主要以芹菜素木犀草素和甘草素为苷元，与葡萄糖、葡萄糖醛酸或芹糖结合成糖苷。

2.2.1.1 黄酮苷元 黄酮苷元质谱特征碎片产生主要是由于C 环发生断裂（逆-狄尔斯-阿德尔反应），继续丢失中性片段CO（28 u）、CO2（44 u）、H2O（18 u）形成。例如峰85 的准分子离子峰为m/z287.0555［M+H］+，分子式为C15H10O6，失去一个水分子得到碎片离子m/z269.0483［M+H-H2O］+，失去一个CO 后得到m/z241.0559［M+H-H2O-CO］+。C 环发生断裂，生成特征碎片m/z135.0437［M+HC7H4O4］+和m/z153.0179［M+H-C8H5O2］+，再失去CO、H2O 小分子生成离子碎片m/z125.0240［M+HC8H5O2-CO］+和m/z117.0344［M+H-C7H4O4-H2O］+。根据对照品保留时间、分子离子峰、二级特征碎片对比确认，确定该峰为木犀草素，其裂解规律如图2所示。

图2 木犀草素的质谱裂解规律Fig.2 Fragmentation process of luteoli

2.2.1.2 黄酮单糖苷 复方香薷水的黄酮单糖苷是O-苷类化合物，在正离子模式下糖基易断裂生成丰度较高的苷元。如峰65、67、84 的准分子离子峰都为m/z463.088 5，分子式为C21H18O12，失去葡萄糖醛酸基（176 u），产生特征碎片m/z287.053 9［M+H-C6H8O6］+，通过文献［9-10］和数据库对比初步鉴定为木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷或其同分异构体，经过对照品比对最终确定峰65、67、84为野黄芩苷、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷和木犀草素-3'-葡萄糖醛酸苷。

峰60、63、79、83在负离子模式下准分子离子峰为m/z417.118 8，推测其分子式为C21H22O9。4个化合物的裂解情况相同，先丢失一个葡萄糖苷基C6H10O5（162 u），生成高丰度碎片离子m/z255.066 1［M-H-C6H10HO5］-，再发生RDA 裂解，生成黄酮类特征碎片m/z119.050 2 和m/z135.009 0［M-HC6H10HO5-C8H9O］-，结合文献和数据库推测其为甘草苷或其同分异构体［11］，通过与对照品对比最终确定峰60、63、79、83分别为新甘草苷、甘草苷、异甘草苷、新异甘草苷，裂解规律见图3。

图3 甘草苷的质谱裂解规律Fig.3 Fragmentation process of liquiritin

2.2.1.3 黄酮双糖苷 本研究共鉴定出甘草苷元-7-O-D-芹糖-4'-O-D-葡萄糖苷、夏佛托苷、芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷、芹菜素-7-二葡萄糖醛酸和木犀草素7-二葡萄糖苷酸5 个黄酮双糖类物质。黄酮双糖苷的取代主要发生在6、7 和8 位，包含五碳糖和六碳糖，裂解方式主要为连续丢失糖基，形成丰度较高的苷元，如峰61在正离子模式下准分子离子峰为m/z623.124 8，连续丢失两个葡萄糖醛酸基，生成m/z447.097 6［M+H-C6H8O6］+、m/z271.060 0［M+H-C6H8O6-C6H8O6］+，根据碎裂规律推测和对照品对比确认该峰为芹菜素-7-二葡萄糖醛酸，裂解规律如图4所示。

图4 芹菜素-7-二葡萄糖醛酸的质谱裂解规律Fig.4 Fragmentation process of apigenin-7-diglucuronide

2.2.2 苯丙素类化合物苯丙素是由苯环和三个直链碳连接在一起为结构单元（C6-C3）的化合物，包含苯丙酸、香豆素和木质素类［12］，该类化合物易丢失CO、CO2、H2O 小分子。本研究共鉴定出20 个苯丙素类化合物，其中迷迭香酸、厚朴酚、7-羟基香豆素、咖啡酸、绿原酸、丹参素、隐绿原酸、新绿原酸等化合物经对照品对比得到确认。如峰26在负离子模式下的准分子离子峰为m/z353.087 5，分子式均为C16H18O9。在碰撞能作用下酰氧键易断裂，丢失C9H6O3、C7H10O5片段，生成m/z191.054 4［M-HC9H6O3］-和m/z179.033 9［M-H-C7H10O5］-二级碎片，继续丢失一分子CO2生成135.045 7［M-H-C7H10O5-CO2］-，经过与对照品的保留时间和二级碎片规律对比，鉴定出该化合物为新绿原酸，质谱裂解规律如图5所示。峰33、37与26分子式相同，且二级碎片的碎裂规律相同，推测为同分异构体，经过对照品对比确认峰33为绿原酸，峰37为隐绿原酸。

图5 迷迭香酸的质谱裂解规律Fig.5 Fragmentation process of rosmarinic acid

峰72经过与对照品的保留时间和二级碎片对比，确认该峰为迷迭香酸。迷迭香酸是紫苏叶的重要活性成分，具有抗过敏、抗氧化、抗抑郁、镇惊等作用。该化合物在负离子模式下准分子离子峰为m/z359.078 0，预测分子式为C18H16O8。在碰撞能作用下，生成m/z197.045 3［M-H-C9H6O3］-、m/z179.034 6［M-H-C9H8O4］-，前者丢失-COO 和H2O形成m/z135.045 1［M-H-C9H6O3-COO-H2O］-，后者丢失一分子H2O后生成m/z161.024 1［M-H-C9H8O4-H2O］-（如图6）。

图6 新绿原酸质谱裂解规律Fig.6 Fragmentation process of neochlorogenic acid

2.2.3 萜类化合物本研究共鉴定出14 个萜类化合物，其中半萜类3 个，三萜皂苷类11 个，半萜类化合物来自木香，三萜皂苷类化合物来自甘草，萜类化合物易丢失糖基和中性小分子。如峰103，其在正离子模式下的准分子离子峰为m/z823.412 2，分子式C42H62O16，裂解途径如图7。先丢失葡萄糖醛酸基和中性小分子H2O，生成碎片m/z647.378 8［M-C6H8O6+H］+、m/z471.343 8［M-2C6H8O6+H］+、m/z453.335 6［M-2C6H8O6-H2O+H］+，质谱信息经文献［13］及对照品对比，确定该峰为甘草酸（如图7）。

图7 甘草酸的质谱裂解规律Fig.7 Fragmentation process of glycyrrhizic acid

2.2.4 有机酸类化合物本研究从复方香薷水中共鉴定出有机酸类成分18个，包含苹果酸、柠檬酸、原儿茶酸、丁香酸、茉莉酸等。该类化合物主要丢失H2O、HCOOH 等中性分子或COO 基团［14］。如峰23 在负离子模式下准分子离子峰为m/z153.018 9，推测其分子式为C7H6O4，二级碎片为m/z109.029 4［M-H-COO］-、m/z108.022 2［M-H-COOH］-、m/z91.018 8［M-H-COO-H2O］-，与文献［15］和对照品的碎裂规律一致，确定该峰为原儿茶酸（如图8）。

图8 原儿茶酸的质谱裂解规律Fig.8 Fragmentation process of protocatechuic acid

2.2.5 生物碱类化合物本研究共鉴定出了11 种生物碱，包含甜菜碱、水苏碱、木兰花碱、牛心果碱、巴婆碱、葫芦巴碱等，该类化合物主要在正离子模式下响应。在碰撞能作用下，含氮杂环易开裂，丢失CH3、CO 等中性小分子［16］。以峰34 为例，准分子离子为m/z342.170 6，推测其分子式为C20H24NO4+。在能量碰撞下，含氮杂环发生两种开裂，一种生成m/z45.057 1 和m/z297.111 4［MC2H7N］+碎片，后者丢失-CH3或者-OCH4，生成m/z265.086 2［M-C2H7N-CH4O］+和m/z282.087 2［MC2H7N-CH3］+；另一种环开裂生成m/z72.080 9 和m/z271.095 7［M-C4H10N］+，前者再丢失CH2，生成特征碎片m/z58.064 9，经过与对照品对比后，确认该成分为木兰花碱，其质谱裂解规律见图9。

图9 木兰花碱的质谱裂解规律Fig.9 Fragmentation process of magnolflorine

复方香薷水由生姜、木香、歪叶蓝、皱叶香薷、广藿香、紫苏叶、厚朴、豆蔻和甘草9 种单味药材组成，其成分种类包含黄酮类、苯丙素类、有机酸、萜类、生物碱、氨基酸类。中药复方成分复杂，作用靶点多样，因此往往有多种药理作用［17-21］，如复方香薷水中黄酮类成分的木犀草素可通过阻断核因子kB（NF-kB）磷酸化活性或其信号通路进而抑制内皮细胞VCAM-1的表达，起到抗炎作用［22］；苯丙素类的厚朴酚可以促进胃动素和胃泌素分泌，抑制胃肠道平滑肌收缩，对胃排空和胃肠推进运动产生双向调节作用［23］；萜类的木香烃内酯可以通过调节Ki67、Bcl-2、Caspase-3、Bax 和PTEN 蛋白的表达，从而诱导结肠癌细胞凋亡，起到抗结肠癌作用［24］；黄酮类成分芹菜素、木犀草素、芹苷和木樨草苷等成分对甲型、乙型流感病毒神经氨酸酶有较好的活性抑制［25］。复方香薷水还可用于由新型冠状病毒肺炎引起的胃肠功能紊乱［26］，但是其作用机制尚未明确，因此今后还需要更深入探索其药效成分以及作用机制。

3 结 论

本研究基于UPLC-Q-TOF MS 技术分析鉴定复方香薷水的化学组成成分，最终鉴定出112 个化合物，包含黄酮类22 个，苯丙素类20 个、有机酸18 个、萜类14 个、生物碱11 个、氨基酸5 个以及其他类型化合物22个，并总结了化学成分的质谱碎裂规律，为其质量控制、安全性评价以及药效物质基础提供了科学依据。