氮掺杂碳量子点的制备及在细胞温度传感中的应用

陈雨昕，胡月芳

（1.贺州学院 广西碳酸钙资源综合利用重点实验室 材料与化学工程学院，广西 贺州 542899；2.广西中医药大学 赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530000）

荧光碳点（CDs）主要包含碳量子点（CQDs）、石墨烯量子点（GQDs）以及聚合物点（PDs）等类型［1-2］。CQDs 具有良好的化学稳定性、优异的生物相容性、良好的水溶性及优异的光电性能［3-5］，已发展成为一类深受欢迎的新型碳纳米材料，是纳米技术领域中最为活跃的研究课题之一。近年来，CQDs已在环境监测［6］、光催化［7］、荧光检测［8］及生物成像等领域得到了广泛应用。随着低碳环保理念的推广，绿色化学也成为碳纳米材料研究的一个趋势，研究者们越来越热衷于利用常见的生物质资源，基于一些简便、绿色、高效的方法合成生物质碳量子点（BCQDs）。与其他碳源相比，绿色生态友好的生物质碳源不仅具有价格低廉、获取方便及来源广泛等优点，还因含有多种元素，使得制备时不需添加外部杂原子即可得到各种性能优异的氮自掺杂碳量子点（N-CQDs）［9］。此外，采用生物质制备碳量子点还可使低价值的生物质废弃物转化为有价值的材料，实现变废为宝，符合资源再利用的绿色低碳环保主旨。近年来，各种生物质包括枇杷叶［10］、桂花籽皮［11］、绿萝叶［12］、黄豆［13］、韭菜［14］等已被用作碳源来制备系列生物质CQDs。

温度是生命体最基本的参数之一，对活细胞内的酶活性、物质运输、细胞分裂和能量代谢等生化反应具有很大的影响［15］。在一些基于热效应治疗肿瘤的方法中，探究细胞内的温度分布及胞内区域温度变化，是评估肿瘤治疗效果的重要生理参数指标［16］。因此，对肿瘤细胞内温度的高分辨率、高灵敏度测量，是一项非常有意义的研究工作。传统的温度测量方法通常是通过物体某些随温度变化的特征进行间接测量，比较常见的检测工具有水银温度计、耳温仪及热电偶等［17］。但这些检测方法响应速度慢，不能灵敏反映温度的变化，且不能实现细胞体内的温度测量，故在生物领域的应用受到限制。据报道，碳量子点表面状态（缺陷和陷阱）的非辐射通道会受到温度的影响，温度升高会激活更多的非辐射通道，使更多的激发态电子通过非辐射过程返回到基态，导致碳量子点的荧光强度减弱，故碳量子点具有作为温度传感器的极大潜能［18］。

本研究以西红柿为碳源和氮源，采用微波合成法在最佳合成条件下制备得到N-CQDs，对其形貌、结构、光电性能和温敏性能进行分析，考察了所合成N-CQDs 的毒性和生物相容性，并将其作为荧光纳米探针应用于细胞温度传感的研究，探讨了基于其开发细胞无损测量纳米温度计的可行性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Tecnai G2 F20 S-TWIN 型场发射透射电子显微镜（TEM，荷兰Philips公司）；Tecnai G2 F20 S-TWIN型X 射线光电子能谱仪（XPS，荷兰Philips 公司）；Perkin Elmer Spectrum Two 型傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR，珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司）；LS45 型荧光分光光度计（美国Agilent Technologies 公司）；X-5 型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；CHI660e 型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司，铂丝电极为对电极，饱和银-氯化银电极为参比电极，玻碳电极（GCE）为工作电极）；RA8恒温循环器（德国LAUDA公司）；Zeiss LSM710激光扫描共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）。

小鼠乳腺癌细胞（4T1）（上海林克生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）、DMEM 高糖培养基、胰酶、青霉素-链霉素和MTT（美国Sigma 公司）；氯化钠（NaCl）和壳聚糖（C6H11NO4）n（天津市福晨化学试剂厂）；氧化铝（Al2O3）、葡萄糖（C6H12O6·H2O）（天津市科密欧化学试剂有限公司）；十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、十二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）和二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）（西陇化工股份有限公司）。对照实验所使用的CQDs为课题组自制。

1.2 N-CQDs的制备

通过对合成时间（3、6、8、10、12 min）、合成温度（高火、中高火、中火）进行优化，得到最佳合成时间为8 min、最佳合成温度为中高火。具体步骤如下：将新鲜的西红柿用去离子水洗净榨汁，取5 g 西红柿汁（30 mL）置于微波炉中高火加热8 min，直到红色液体变为棕黑色物质，将该物质进行研磨，加适量去离子水溶解后离心30 min（4 000 r/min），收集上层棕色混合液。再将收集到的棕色混合物置于透析膜（截留分子量1 000）中在去离子水中透析72 h（每间隔3～4 h 换一次水），可得深黄色N-CQDs 透析液，于4 ℃冰箱中储存备用。

1.3 N-CQDs的表征

N-CQDs的形态和功能基团及其分子结构由TEM、XPS、FT-IR 进行表征；光学性质用荧光分光光度计、紫外分光光度计和紫外灯进行研究。

1.4 荧光量子产率的测定

以含0.1 mol·L-1H2SO4溶液的硫酸奎宁作为标准参考物［19］，采用公式（1）计算N-CQDs 溶液的荧光量子产率（Q）。

式中，Q、QR分别为N-CQDs和标准参考物的荧光量子产率；A和AR为两者在365 nm激发波长下的紫外吸光度；I和IR为该激发波长下N-CQDs和标准参考物的荧光峰面积；η和ηR为对应的折光系数。

1.5 N-CQDs稳定性研究

实验考察了NaCl 浓度对N-CQDs 荧光强度的影响［20］。配制浓度为30、60、90、120、150、180、210 mmol/L 的NaCl 溶液，分别取1 mL NaCl 溶液与1 mL 质量浓度为10 µg/mL 的N-CQDs 等体积混合，将混合液置于5 mL比色皿中，在376 nm激发波长和440 nm发射波长下测量荧光强度。

同时考察了不同pH 值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的磷酸盐缓冲溶液（PBS）对N-CQDs荧光强度的影响［21］。分别取1 mL 质量浓度为10 µg/mL 的N-CQDs 与2 mL PBS 缓冲溶液混合，将混合液置于5 mL比色皿中，于376 nm激发波长下测定其荧光强度。

1.6 N-CQDs电化学性能的研究

用砂纸打磨GCE，去除其表面的氧化膜，先后使用0.3 µm 和0.05 µm 的氧化铝粉末反复打磨抛光，并使用乙醇和去离子水超声清洗，烘干备用。将3 mg CQDs或N-CQDs倒入1 mL壳聚糖溶液（5 mg/L）中制备混合液，取一滴该混合液滴至GCE表面，低温烘干，制备得到CQDs或N-CQDs修饰的GCE。

将修饰好的CQDs/GCE 和N-CQDs/GCE 置于1 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6（摩尔比1∶1）和0.1 mol/L PBS（pH 7.5）的混合溶液中，进行循环伏安（CV）扫描；置于5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6（摩尔比1∶1）和0.5 mol/L KNO3的混合溶液中，进行电化学阻抗（EIS）扫描。

1.7 N-CQDs温敏性能分析

使用恒温水循环器连接荧光分光光度计进行样品温度控制，通过外接恒温系统对N-CQDs 纳米颗粒水溶液进行加热，分别测定其在不同温度下的荧光光谱。

1.8 细胞毒性及细胞传感性能研究

用MTT 法进行N-CQDs 生物毒性研究。在7 个培养皿中分别添加0、100、150、200、250、300、350 µg/mL 的N-CQDs溶液，随后加入20 µL 20% MTT 溶液孵育16 h。向各培养皿中加入100 µL二甲亚砜，反应15 min。将培养皿置于570 nm 的酶联免疫吸附测定仪中进行光学测量，考察N-CQDs 的生物毒性。

用胰酶消化4T1 细胞，然后将细胞悬浮液接种至4 个35 mm 的细胞培养皿中，并置于CO2含量为5%、温度37 ℃的培养箱中培养24 h。随后将4 个培养皿中的4T1 细胞与10 µg/mL N-CQDs 及高糖细胞培养基在37 ℃下孵育2 h。使用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，并通过外接恒温系统缓慢加热（注意控制细胞的原位温度），使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞形貌。检测之前，将设置温度点（20、30、40、50、60 ℃）平衡5 min。

2 结果与讨论

2.1 N-CQDs结构及组成

利用TEM、FT-IR 等手段对N-CQDs 的粒径分布、表面成分组成等进行研究。从图1A 可以看出，合成的碳点为较均一的颗粒球形小圆点，分散性良好，平均粒径约3.4 nm。由FT-IR 可知，1 638 cm-1处为C=C 键的伸缩振动，1 886 cm-1处为C=O 的弯曲振动，3 306 cm-1处为O—H 键的弯曲振动（图1B）。该结果表明N-CQDs表面存在大量的羧基和羟基等亲水基团，具有良好的水溶性［22］。

采用XPS 考察N-CQDs 的表面元素构成，结果显示，N-CQDs 全谱图（图2A）中531.9、399.9、284.9 eV 处的峰分别对应O1s、N1s和C1s 3 个特征峰［23］，说明该西红柿碳量子点的主要组成元素为C、N 和O。元素含量分析结果表明，该N 自掺杂CQDs 中C、N、O 的相对元素百分含量分别为65.24%、1.48%和30.28%。图2B为C1s的XPS高分辨图谱，其在286.4 eV和284.8 eV处出现的两个发射峰分别归属为C—O 和C=C/C—C 键［24］；图2C 为N1s 的XPS 高分辨图谱，其在399.5 eV 和403.0 eV 处的两个发射峰分别归属为C—N—C 和C—N 键；O1s 的XPS 高分辨图谱（图2D）在531.8 eV 和532.9 eV 处的两个拟合峰分别归属为O=C 和C—O 键［25］。XPS 测定结果表明该碳量子点为氮掺杂碳量子点，产率为44.9%，经式（1）计算可得到N—CQDs的量子产率为18.9%。

图2 N-CQDs的XPS全谱图（A），C1s分谱（B），N1s分谱（C），O1s分谱（D）Fig.2 XPS full spectrum（A），C1s spectrum（B），N1s spectrum（C），O1s spectrum（D） of N-CQDs

图3 为N-CQDs 的XRD 图，其在22.3°处的宽衍射峰为无定形碳结构的（002）晶面［26］，说明所合成的量子点为无定形结构。

图3 N-CQDs的XRD图Fig.3 XRD pattern of N-CQDs

2.2 N-CQDs光学性能分析

N-CQDs 内部的π-π*电子跃迁［27］使得其在波长284 nm 处出现UV-Vis 吸收峰（图4A）；由图4B 可知，N-CQDs的最大激发和发射峰分别位于380 nm和453 nm。N-CQDs（10 µg/mL）在不同激发波长下的发射光谱如图4C所示，结果表明，随着激发波长由360 nm增加至460 nm，N-CQDs的荧光发射峰发生红移，表现出明显的激发波长依赖性。N-CQDs 的激发波长依赖现象，可能因其发射位置和颗粒大小差异所致［28］。图4D 为N-CQDs 溶液在自然光和紫外灯光下的照射效果比对图，在紫外灯下N-CQDs 溶液发射出明亮的蓝光。

图4 N-CQDs的UV-Vis图（A），N-CQDs的最大激发和最大发射波长图谱（B），N-CQDs在不同激发波长下的荧光发射光谱图（C），N-CQDs在自然光（左）和紫外灯（右）下的发光图（D）Fig.4 UV-Vis spectrum（A） and spectra of maximum excitation and maximum emission wavelength（B） of N-CQDs，emission fluorescence spectra of N-CQDs at different excitation wavelengths（C），diagrams of N-CQDs under natural light（left） and ultraviolet lamp（right） exposure（D）

2.3 N-CQDs荧光稳定性分析

考察了10 µg/mL 的N-CQDs 在不同NaCl 浓度和pH 值下的荧光强度稳定性。结果发现，NCQDs 溶液的荧光强度在不同浓度NaCl 溶液和不同pH值的酸碱性溶液中均保持较稳定的状态，表明N-CQDs具有优异的耐盐性和荧光稳定性。

2.4 N-CQDs电化学性能分析

碳量子点的电化学性能也会对其细胞温度荧光传感性能产生较大的影响，如当量子点的电荷状态发生变化时，其荧光强度、荧光寿命及荧光波长均将发生变化，从而影响细胞温度荧光传感的准确性与精密性。因此，在制备细胞温度荧光传感器时，也需要对碳量子点的电化学性能进行优化。

采用循环伏安法和电化学阻抗法分析N-CQDs的电化学性能，并以CQDs作为对照。如图5A所示，CQDs和N-CQDs修饰的GCE的CV曲线均出现闭合的氧化还原峰。CQDs修饰的GCE的氧化峰和还原峰对称性稍差，是准可逆过程；而N-CQDs修饰的GCE的CV曲线中的还原峰和氧化峰比较对称，表明在电极表面发生了反应速率较快的可逆过程。原因可能是，相比CQDs，N-CQDs 表面所含的基团较丰富，使得电极表面的电活性面积增大，电流的运输能力提高。CV图谱结果表明，N-CQDs具有比CQDs更为优异的光电性能。

图5 CQDs、N-CQDs修饰玻碳电极的CV图谱（A）及裸电极、CQDs、N-CQDs修饰电极的EIS图谱（B）Fig.5 CV diagrams of CQDs and N-CQDs modified GCE（A） and EIS diagrams of bare GCE，CQDs and N-CQDs modified GCE（B）

电化学阻抗法也被用于考察N-CQDs修饰的GCE的电化学性能，如图5B所示，裸GCE的电化学阻抗非常小，修饰CQDs后电化学阻抗得到明显增强；而N-CQDs修饰的GCE的电化学阻抗增强更大，即N-CQDs修饰的GCE电极的电化学性能更为优异。

2.5 N-CQDs温敏性能分析

考察了温度（25～65 ℃）对N-CQDs 荧光强度的影响。如图6A 所示，随着温度的升高，N-CQDs 的荧光强度明显降低，65 ℃时N-CQDs 的相对荧光强度猝灭了51%；当温度从65 ℃降回25 ℃时，NCQDs 的荧光强度逐渐得到恢复。在25～65 ℃范围内，N-CQDs 的荧光强度（IF）与温度（t）呈良好的线性关系（图6B），线性方程为IF=1296.54-14.95t，相关系数（r2）为0.998 7。结果表明，在25～65 ℃范围内，N-CQDs的荧光强度显示出良好的可逆性，在该范围内的温度变化不会对N-CQDs表面的荧光结构造成永久性破坏。N-CQDs的荧光强度随着温度升高而减弱的现象可能是由于温度升高使N-CQDs发生聚集引起了明显的荧光猝灭［28］。N-CQDs 的荧光强度随温度的升高呈线性下降，表明N-CQDs 具有优异的温敏性能，有望开发成温度传感器。

图6 温度对N-CQDs荧光强度的影响（A）及N-CQDs荧光强度与温度的线性关系（B）Fig.6 Effect of temperature on fluorescence intensity of N-CQDs（A） and linear relationship between fluorescence intensity of N-CQDs and temperature（B）

2.6 N-CQDs细胞毒性分析

采用MTT 法测定了不同质量浓度的N-CQDs 对4T1 细胞的毒性。从图7 可知，将不同质量浓度的NCQDs 与4T1 细胞共孵育后，后者仍呈现出良好的细胞活性，当N-CQDs为350 µg/mL时，细胞活性为原来的94.2%。结果表明该N-CQDs的细胞毒性几乎可以忽略不计，具有良好的生物相容性，在活细胞成像领域具有很大的应用潜力。

图7 不同质量浓度N-CQDs下细胞毒性测试Fig.7 Cytotoxicity test in the presence of N-CQDs at different mass concentrations

2.7 N-CQDs的细胞温度传感性能分析

从图8A 可以看出，N-CQDs 孵育的4T1 细胞在紫外光激发下发出明亮的蓝光，证明N-CQDs 具有良好的细胞膜穿透性，可用于细胞成像。图8A～E 显示，当从25 ℃缓慢加热至65 ℃时，N-CQDs 的荧光强度逐渐减弱。从细胞明场图片（图8F）可以看出，细胞和N-CQDs 孵育后发育良好，未出现明显损伤，说明该N-CQDs 对细胞的毒理性低，通过对比细胞的荧光强度，即可得到细胞的温度变化信息，所制备的N-CQDs有望用于活细胞温度的探测及成像。

图8 N-CQDs孵育的4T1细胞在不同温度下的共聚焦显微镜图Fig.8 Confocal microscopy imagings of 4T1 cells incubated with N-CQDs at different temperatures

3 结 论

本研究以生物质西红柿为原材料，通过微波法制备得到荧光强度强、水溶性稳定的氮自掺杂碳量子点N-CQDs。TEM、UV-Vis、FT-IR、XPS、荧光、电化学分析结果显示，N-CQDs 表面富含羟基、羧基等亲水基团，有较强的稳定性，光学性能优良，电化学性能优异，具有良好的温度传感性能及生物相容性，可应用于活细胞的温度探测及成像，在温度响应的荧光传感生物医学领域具有潜在的应用价值。