基于木质素-有机黏土复合水凝胶的固相萃取-SERS联用技术用于变压器油中微量1，2，3-苯并三氮唑的现场分析

刘 叶，余 东，廖思杰，沈爱国，何治柯*，韩方源

（1.武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉 430072；2.武汉纺织大学 生物工程与健康学院，湖北 武汉 430200；3.广西电网有限责任公司电力科学研究院，广西电力装备智能控制与运维重点实验室，广西 南宁 530023）

硫化铜沉积加速绝缘油老化是引起变压器频繁故障的重要原因之一。在变压器油中添加金属钝化剂1，2，3-苯并三氮唑（1，2，3-Benzotriazole，BTA）是目前广泛应用的解决方法［1］。BTA 与铜离子发生反应，生成的配合物将形成一层保护膜附着在铜绕组表面，能有效抑制硫化铜沉积，延缓变压器故障［2］。国际电工委员会（IEC）要求BTA 的检测浓度低限不超过5 mg/kg，以保证金属钝化剂检测的灵敏性及对新变压器油性能评价的正确性［3］。然而由于化学反应和热降解，BTA 在长期抑制腐蚀的过程中会发生消耗，实际运用中需要及时补充BTA 以保持其抗腐蚀效果。因此，对变压器油中BTA 含量进行快速准确的现场检测十分重要。

目前BTA的检测方法主要有气相色谱、高效液相色谱和荧光光谱法［4-6］。然而色谱法繁琐耗时，荧光法容易受到检测环境的影响，不适用于现场分析。与这些传统方法相比，表面增强拉曼散射（SERS）作为一种高灵敏、高分辨的光谱技术，辅之便携小型拉曼光谱仪，已广泛应用于食品、药品、环境等领域的现场分析［7-9］。然而，变压器油的直接SERS 检测还存在诸多问题。比如变压器油的长链烷烃丰度较高，导致BTA 难以接触到SERS基底的近表面，且变压器油中有机杂质的荧光会对SERS检测带来干扰［10］。因此必须建立一种快速的变压器油预处理方法，分离并富集变压器油中的BTA。

固相萃取是一种简单高效的样品前处理技术，能有效用于样品的分离和富集［11］。木质素作为高等植物细胞壁中自然合成的一种三维、部分无序的无定形酚醛聚合物网络，含有大量的芳香基、羧基和羟基［12］，并凭借优异的吸附性能广泛应用于金属离子、染料、芳香化合物的吸附，是一种理想的固相萃取填料［13-15］。沈垚等［16］通过对木质素改性得到的木质素胶体颗粒能与BTA 形成氢键，基于此可通过液液萃取将BTA 从油基质中提取出来。有机黏土具有大的比表面积、多孔性和吸水性［17］，硅藻土相对于其他类型的粘土，具有质轻多孔的优点，可提高材料的吸附性能［18］。

本文使用木质素和有机黏土制备了脱碱木质素/硅藻土（DAL/DE）水凝胶，并以其为填料制备了固相萃取柱。通过高效液相色谱法对水凝胶配方进行优化，再结合SERS 检测技术，实现了变压器油中BTA的现场微量检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Zeiss SIGMA 场发射扫描电子显微镜（德国Carl·Zeiss公司）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Electron Corporation 公司）；TGA2/DSC3 热重分析仪（瑞士Mettler Toledo 公司）；D8 Advance X射线衍射仪（德国Bruker 公司）；Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；MS-100 恒温混匀仪（杭州奥盛仪器有限公司）；自制的微区多孔板表面增强拉曼检测系统（FI785E10W-Pro-WD01）。

氯金酸（HAuCl4·3H2O）、柠檬酸三钠、硼氢化钠、3-氨丙基三甲氧基硅烷（3-APTMS）、对巯基苯甲酸、蒙脱土（MMT）、高岭土（KL）、硅藻土（DE）、N’N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）等购自上海阿拉丁试剂公司；脱碱木质素（DAL）、碱木质素（AL）、木质素磺酸钠（LS）等购自上海麦克林生化科技有限公司；碘化钾（KI）、盐酸羟胺（NH2OH·HCl）、过硫酸铵（APS）、无水乙醇、正己烷、乙腈、甲醇、乙酸等购自北京国药集团化学试剂有限公司。实验用水均为去离子水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 实验方法

实验流程示意图如图1所示。首先使用自由基聚合法合成DAL/DE水凝胶，再将水凝胶作为填料填充至固相萃取小柱中，对BTA 变压器油样进行固相萃取。经过活化、上样、洗脱后收集BTA 洗脱液。随后将BTA洗脱液滴在SERS基底微腔内，待液滴干燥后进行SERS检测。

图1 基于木质素-有机黏土复合水凝胶固相萃取-SERS联用技术现场检测变压器油中BTA的示意图Fig.1 Scheme of field detection of BTA in transformer oil based on lignin-organclay composite hydrogel solid phase extraction and SERS combined technology

1.2.1 木质素-有机黏土复合水凝胶的制备将4%（w/v）的脱碱木质素与6%（w/v）的硅藻土混合，溶解于10 mL 去离子水中，室温搅拌30 min。溶解后，加入1% ～3%（w/v）的丙烯酸（AA），磁力搅拌30 min。称取0.5% ～3%（w/v）的引发剂过硫酸铵和0.125% ～1%（w/v） 的交联剂N’N-亚甲基双丙烯酰胺，搅拌均匀后倒入模具中，水浴50 ℃即可得到木质素-有机黏土复合凝胶。将水凝胶在去离子水中浸泡24 h，去除多余试剂，随后置于室温下保存。

1.2.2 SERS 基底的制备及表征SERS 基底的制备：将0.5 mL的1.0% HAuCl4·3H2O 加入500 mL 去离子水中，再加入1.5 mL 11.4 mg/mL的柠檬酸钠溶液和0.5 mL 0.8 mg/mL的硼氢化钠溶液，合成尺寸为5 nm 的金种溶液。取3.5 mL金种溶液浸泡处理过的带有微腔阵列的硅片3 h，取出，加入2 mL去离子水，300 µL 0.2% HAuCl4·3H2O 和150 µL 盐酸羟胺，使用混匀仪以1500 r/min振动15 min 后取出，用去离子水洗净后，加入2 mL 去离子水、75 µL 的0.2% HAuCl4·3H2O 和37.5 µL 的盐酸羟胺生长第二次，将得到的SERS基底于室温下避光保存。

SERS基底的表面清洁和表征：配制10-2mol/L的KI溶液，将基底在2 mL KI溶液中浸泡20 min后取出，完成KI的清洁。使用对巯基苯甲酸为拉曼探针，将基底浸泡在5×10-6mol/L的对巯基苯甲酸溶液中30 min后取出，对SERS基底的不同微腔进行多次SERS检测，考察其重复性。

1.2.3 变压器油样处理及固相萃取样品的配制：将BTA 溶于变压器油中配成1、10、50、100、250、500 mg/kg 的BTA 变压器油样。将不同含量的BTA 变压器油样用正己烷稀释后得到BTA 变压器油稀释液。

固相萃取：准备3 mL 的固相萃取小柱和两个筛板，将0.4～1.2 g 的DAL/DE 水凝胶填充至固相萃取柱中。将小柱固定在样品台上，加入一柱管体积的活化剂使水凝胶充分润湿。将不同含量的BTA 变压器油稀释液上样，流速不超过5 mL/min。待样品完全流过后用少量正己烷淋洗。最后，使用1 mL洗脱剂将BTA从水凝胶中洗脱，留样待测。

1.2.4 变压器油中BTA 萃取液的高效液相色谱分析使用高效液相色谱优化水凝胶的制备条件。色谱柱为Shimadzu Shim-pack GIST C18（4.6 mm×250 mm），粒径5 µm；流动相A 为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。使用30% A 和70% B 等度洗脱，流速为1 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为20 µL，检测波长：273 nm。

1.2.5 变压器油中BTA 萃取液的SERS 检测吸取0.4 µL 萃取液，滴在SERS 基底的微孔阵列中，待液滴干燥后使用便携拉曼光谱仪测试，其功率为518 mW，激光器波长为785 nm，测试范围为200～2 000 cm-1，激光强度10%，积分时间1 s，积分次数1次。

2 结果与讨论

2.1 木质素-有机黏土复合水凝胶的制备与表征

2.1.1 固形物种类和含量对水凝胶形貌的影响有机黏土具有粗糙起伏的表面，所制备的水凝胶具有较高的比表面积［19］。不同种类的木质素和有机黏土制备的水凝胶的SEM 图像如图2A～E所示。除AL/MMT 复合水凝胶为致密的多层结构外，其余复合水凝胶均具有多孔网状结构。与其他的水凝胶相比，DAL/DE复合水凝胶有更多的孔隙和空穴，有利于增加待测样在水凝胶中的渗透和吸附。

图2 不同木质素-有机黏土水凝胶的扫描电镜图像（A-E）及总固形物含量对成凝胶时间的影响（F）Fig.2 SEM images of different lignin-organoclays hydrogels（A-E） and effects of different solids content on gel formation time（F）

DAL 和DE 的添加量影响DAL/DE 复合水凝胶的状态。调整DAL 和DE 总固形物含量分别为5%、10%、15%、20%、30%，制得的DAL/DE 复合水凝胶的成凝胶时间如图2F 所示。随着固形物含量的增加，成凝胶的时间延长，部分DAL和DE不再交联。综合考虑成凝胶时间和凝胶状态，选择DAL/DE复合水凝胶的固形物含量为10%，该条件下15 min内即可成凝胶。

2.1.2 木质素-有机黏土复合水凝胶制备条件优化以商品化的木质素为固定相时的最优前处理条件为：3 mL正己烷活化小柱，将BTA 变压器油样稀释2倍，1 mL无水乙醇洗脱［20］。为考察木质素与有机粘土复合水凝胶的萃取效果，以不同条件下制备的水凝胶为填料，含BTA 的变压器油为样品在以上条件下进行固相萃取，使用高效液相色谱对萃取效率进行评价。

DAL 可吸附BTA 而不改变其结构。如图3A 所示，随着DAL 用量的增加，水凝胶对BTA 的吸附量增大，这是由于DAL 用量增加，其—OH 基团含量提高，使得水凝胶对BTA 的吸附量增加；继续增大DAL的用量，则会对水凝胶的交联度产生影响。因此，DAL用量为4%时制备的水凝胶对BTA的萃取效果最好。在水凝胶制备过程中，AA 提供单体聚合，APS 为引发剂，并在加热时与AA 单体的自由基反应，发生链的生长。随后交联剂MBA 和聚合物链发生反应，生成水凝胶的三维网络结构［21-23］。AA、APS、MBA 对DAL/DE 水凝胶萃取量的影响如图3B～D 所示，当DAL 用量为4%，添加2.5%的AA，0.75%的APS和0.25%的MBA时，所制备的DAL/DE复合水凝胶对变压器油中BTA的吸附效果最佳。

图3 DAL（A）、AA（B）、APS（C）、MBA（D）的添加量对DAL/DE复合水凝胶萃取BTA的影响Fig.3 Effects of DAL（A） ，AA（B），APS（C） ，MBA（D） on the extraction of BTA by DAL/DE composite hydrogel inset：optical photographs of DAL/DE composite hydrogels with different amounts of DAL

2.1.3 木质素-有机粘土复合水凝胶的表征DAL/DE水凝胶的傅里叶变换红外光谱（FTIR）如图4A所示，纯DE 的特征波段1085 cm-1处表现为有机黏土SiO4四面体Si—O—Si 键的伸缩振动，798 cm-1处为Si—O 的弯曲振动峰［24］。DAL的红外光谱曲线中2935 cm-1和1037 cm-1处对应木质素单元CH2的C—H 伸缩振动和芳香核的C—H 面外弯曲振动，1600 cm-1处表示芳香环的振动吸收峰和C=O 的伸缩振动，1176 cm-1处为C—O振动［25］。DAL/DE水凝胶的光谱曲线具有以下特征：（1）3356～3650 cm-1范围出现较宽的羟基（O—H）伸缩振动。（2）798 cm-1处出现DE 的特征峰，表明黏土层在水凝胶中分散良好。（3）1085 cm-1处DE 的特征峰消失，表现为木质素单元的波段；1600 cm-1处木质素的C=O 伸缩振动峰偏移至1709 cm-1处，表现为共轭酯键的吸收和非共轭的C=O伸缩振动。因此，红外光谱分析证明DAL/DE水凝胶成功制备。

图4 DAL/DE水凝胶的红外光谱图（A）、热重分析（B）、 X射线衍射图（C）和溶胀率（D）Fig.4 FTIR（A），TGA（B），X-ray diffraction spectra（C） and swelling rate（D） of DAL/DE hydrogel

热重分析（TGA）可反映水凝胶的结构稳定性。DAL/DE 水凝胶样品的热重曲线（图4B）分为3 个阶段。室温到157 ℃发生第一次降解，主要为水对木质素和硅藻土物理吸附的脱除，失重后残余92.17% ～95.64%；第二次小失重出现在250～300 ℃之间，可能是由于木质素和硅藻土的交联断裂，失重后残余65.63%；第三次热解发生在380～470 ℃，水凝胶产物中的木质素逐渐分解，同时MMT 和DAL 交联的羟基被去除，此时失重残余为25.98%。TGA 分析表明，DAL/DE 水凝胶在150 ℃下非常稳定，仍具有90%以上的质量。

干燥后DAL/DE 水凝胶粉末的XRD 谱图如图4C所示。木质素是一种无定形材料，无衍射峰［26］。2θ为22.03°处的特征衍射峰为硅藻土的二氧化硅［27］。说明硅藻土很好地结合于DAL/DE 水凝胶中。 DAL/DE水凝胶的溶胀曲线如图4D所示，其溶胀率在0～12 h呈线性增加，之后缓慢增加，并在30 h后趋于稳定，达到溶胀平衡状态。此时水凝胶的溶胀率为626%，说明水凝胶的吸水溶胀性能良好。

2.2 SERS基底的制备及表征

以原位生长法制备的微腔阵列SERS 基底提供了“热点”，但是使用的表面活性剂和还原剂可能会残留在基底表面，造成背景干扰。使用KI对SERS基底进行清洁，由图5A可以看出，10-2mol/L的KI即可消除基底背景信号。以5×10-6mol/L 的对巯基苯甲酸作为信号分子，对SERS 基底的不同微腔进行SERS检测，考察清洁后SERS基底的重复性。由图5B、C可以看出，对巯基苯甲酸在1080 cm-1处的特征峰强度在小范围内浮动，相对标准偏差（RSD）为7.6%，表明SERS基底的重复性良好。

图5 KI清洁前后的SERS信号变化（A），不同SERS基底微腔内的对巯基苯甲酸的拉曼光谱（B）及其在1 080 cm-1处的SERS强度直方图（C）Fig.5 SERS signal changes before and after KI cleaning（A）；Raman spectra of 4-mercaptobenzoic acid in different SERS substrate microcavities（B）；histogram of SERS intensity at 1 080 cm-1 in B（C）

2.3 固相萃取条件的优化

2.3.1 活化剂的影响在水凝胶填料1.0 g，BTA油样3 mL（使用6 mL正己烷稀释后上样），洗脱剂为1 mL 无水乙醇条件下，考察了不同活化剂（正己烷、水、甲醇）对固相萃取效果的影响。如图6A 所示，以水作为活化溶剂时的萃取效果最佳，这是因为水能使水凝胶内部结构舒展开并保持柱体湿润。因此选择水为固相萃取活化剂。

图6 活化剂种类（A）、稀释倍数（B）、填料用量（C）、洗脱剂种类（D）的影响Fig.6 Effcets of type of activator（A），dilution multiple（B），amount of filler（C），type of eluent（D）

2.3.2 稀释倍数的影响变压器油粘度高，在萃取时会影响BTA进入DAL/DE水凝胶内部的速率。在活化剂为水，水凝胶填料质量为1.0 g，洗脱剂为1 mL 无水乙醇条件下，考察了BTA 油样稀释倍数对萃取效果的影响。固定BTA 油样为3 mL，将其分别溶解于0、3、6、9 mL（稀释倍数分别为0、1、2、3）的正己烷中。如图6B所示，未经稀释的BTA油样的粘度较大，吸附质难以到达吸附剂内部，导致内扩散时间不足，萃取量少［28］。使用正己烷稀释1 倍时，BTA 油样达到合适的粘度，BTA 更容易在水凝胶内部扩散并快速占据吸附位点，萃取量增加；继续稀释时，相同流速下样品需要更多的时间通过固相萃取小柱，导致吸附质和吸附剂传质缓慢，萃取量减小。因此选择以正己烷稀释1倍。

2.3.3 填料量的影响固定活化溶剂为水，BTA 油样3 mL，使用3 mL 正己烷稀释后上样，洗脱剂为1 mL乙醇，考察水凝胶填料的用量对萃取效果的影响。由图6C可知，随着DAL/DE 用量的增加，水凝胶对BTA 的吸附量先增加后减小，DAL/DE 用量为0.6 g 时的萃取效果最佳。这是因为适量增大DAL/DE 用量可以为BTA 提供更多的结合位点。然而继续增加DAL/DE 用量，水凝胶占据的固相萃取小柱柱管体积更大，单位质量吸附的BTA 的量减小，洗脱效率降低。因此选择0.6 g的DAL/DE 填充至固相萃取小柱中。

2.3.4 洗脱剂的影响洗脱剂种类和用量直接影响目标组分的洗脱效果。一般来说，极性越强，洗脱效果越好。选择水凝胶填料的质量为0.6 g，活化溶剂为水，BTA 油样3 mL，使用3 mL 正己烷稀释后上样，考察了甲醇、乙醇、乙腈、乙酸4 种极性较强的溶剂的洗脱效果（图6D）。由图可见，乙酸洗脱的效果最好，这表明乙酸能更好地取代和切断水凝胶腔中吸附的BTA 之间的相互作用，脱附效果最强［29］。因此，选择乙酸作为洗脱溶剂。

2.3.5 BTA 油样体积的影响固定DAL/DE 用量为0.6 g，活化溶剂为水，洗脱剂为1 mL 乙酸。考察了最佳萃取条件下，DAL/DE 对500 mg/kg BTA 的萃取情况。由图7A、B 可知，随着油样体积的增加，DAL/DE 的吸附结合位点逐渐饱和，对BTA 的萃取量趋于平缓。为缩短固相萃取时间，在定量分析时选择8 mL的BTA变压器油样上样。

图7 DAL/DE水凝胶对不同体积BTA油样萃取的SERS图（A）及其在776 cm-1处的拉曼强度（B），不同含量BTA的SERS光谱（C）及校正曲线（D）Fig.7 SERS spectra of DAL/DE hydrogel extraction of BTA oil samples of different volumes（A） and Raman intensity at 776 cm-1（B），SERS spectra of different contents of BTA（C） and the correction curve（D）

2.4 变压器油中BTA的SERS检测

使用水凝胶对不同含量的变压器油样中的BTA 进行SERS 检测，如图7C、D 所示，随着BTA 含量（x）的增加，其776 cm-1处特征峰的SERS 强度（y）逐渐增强，两者在1～500 mg/kg 范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=23.86x+2199.45，相关系数为r2=0.9678。根据3 倍置信因子计算得到其检出限为0.28 mg/kg。说明使用固相萃取结合SERS检测的方法具有良好的可行性。

3 结 论

本文以脱碱木质素和硅藻土合成的DAL/DE 水凝胶作为固相萃取填料，利用固相萃取技术结合SERS 检测建立了一种变压器油中BTA 的快速检测方法，有效解决了变压器油中BTA 难以直接检测的问题。结果表明，所建方法具有较好的准确性和灵敏度，检出限低至0.28 mg/kg。将其应用于变压器油中BTA 的检测，弥补了传统HPLC 方法柱效低、时间长、操作复杂的不足。为实现变压器油中BTA的现场检测提供了新方法。