POF1B在自然流产孕妇绒毛膜中的表达及其相关作用机制研究*

盛 丛,张 鑫,黄 慧,陈曼诗,何春容,范 涛△

[1.中山大学附属第八医院(深圳福田)妇产科,广东深圳 518033;2.深圳市福田妇幼保健院妇科,广东深圳 518045]

自然流产是指在妊娠28周内出现胚胎停育、生化妊娠及空孕囊等妊娠结局失败的情况,是人类妊娠最常见的并发症,发病率较高(10%～15%)[1-2]。近年来,随着我国晚婚晚育人群的增多,高龄孕产妇的比例明显增加,自然流产的发病率逐年升高,既往统计发现,自然流产患者出现反复性流产的概率较高,严重影响生育计划及生活质量,还可导致出现抑郁、焦虑等负性情绪,给心理带来负面影响[3-4]。因此分析其发病机制,对于自然流产高危孕妇给予早期预防及干预对改善妊娠结局具有重要意义。目前研究认为,自然流产病因复杂,其中遗传因素、免疫因素及内分泌失调等均参与其发生[5-6]。POF1B是一种胞质蛋白,作为卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)的候选基因,其主要在极化上皮组织中表达,可通过干扰连接处F-肌动蛋白表达和诱导组织有丝分裂定向错误等参与纤毛发生、囊肿缺陷等病理学改变;还可通过人肠道Caco-2细胞中内源蛋白的shRNA表达调节肌动蛋白细胞骨架紧密连接情况。既往动物实验发现,POF1B在成年小鼠卵巢中表达极低,可在产前小鼠卵巢中微量表达[7],POF1B是否参与自然流产的发生及发展,以及具体作用机制目前尚不完全明确。本研究旨在分析POF1B在自然流产孕妇绒毛膜中的表达及其相关作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2021年1月至2023年1月中山大学附属第八医院(深圳福田)收治的60例自然流产孕妇(自然流产组)的临床资料。纳入标准:(1)妊娠时间<12周,均为单胎妊娠,B超诊断出现自然流产;(2)妇产科门诊就诊;(3)孕妇及家属知情,依从性良好,可配合检查及治疗,均签署知情同意书。排除标准:(1)合并神经系统或精神方面疾病;(2)孕妇染色体异常诊断阳性;(3)子宫发育异常;(4)因弓形虫等感染导致胚胎停育。同期收集行人工流产的孕妇60例为自然对照组,具有完整病例,均为单胎妊娠。自然流产组年龄(33.23±4.01)岁,BMI(23.27±2.06)kg/m2,孕龄(49.07±4.98)d。正常对照组年龄(32.80±3.78)岁,BMI(23.26±1.74)kg/m2,孕龄(49.25±5.82)d。两组年龄、BMI及孕龄等临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准(2021d082)。

1.2 方法

1.2.1ELISA检测血清β-人绒毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin,β-HCG)、孕酮、雌激素水平

采集两组孕妇清晨空腹静脉血,3 000 r/min离心10 min,于-80 ℃保存,避免反复冻融。ELISA检测血清β-HCG、孕酮、雌激素水平。

1.2.2Western blot检测相关蛋白表达

取孕妇血清、细胞及子宫绒毛膜样本,加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)裂解液进行裂解,4 ℃ 3 000 r/min离心15 min,取沉淀物进行风干,加入四乙基溴化铵(tetraethyl ammonium bromide,TEAB)后4 ℃ 3 000 r/min离心15 min。采用二喹啉甲酸(diquinoline carboxylic acid,BCA)法检测蛋白质浓度,制备SDS聚丙烯酰胺凝胶后混合沸水浴5 min,电泳后将蛋白转印到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,室温下封闭液封闭1 h,与不同抗体按比例孵育,4 ℃摇床过夜,三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液及聚山梨酯-20(TBS with Tween-20,TBST)缓冲液清洗3次,每次10 min,暗室中增强型化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)超敏发光液孵育,室温反应1～2 min,检测各样本中POF1B蛋白表达。

1.2.3细胞实验

选择人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo于高糖型细胞培养基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)中进行培养、传代。将HTR-8/Svneo细胞分为对照组及POF1B过表达组,POF1B过表达组采用过表达POF1B质粒构建pHS-AVC-1021慢病毒载体,对照组不予处理。(1)采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况:两组细胞转染48 h后去除培养基,磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer salt solution,PBS)清洗2次,制作细胞悬液,取100 μL细胞悬液转移至5 mL培养管中,与5 μL膜联蛋白-V-PE(Annexin-V-PE)/7-氨基放线菌素(7-aminoactinomycin,7-AAD)混合均匀后于暗室孵育15 min,加入400 μL混合缓冲液,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。(2)采用细胞增殖检测试剂盒(cell counting Kit-8,CCK-8)检测细胞增殖情况:分别于细胞转染0、12、24、48 h时加入适量CCK-8试剂,37 ℃环境下孵育2 h,采用酶标仪检测HTR-8/Svneo细胞450 nm波长的吸光度值,计算两组细胞的相对数量。(3)采用1.2.2方法检测两组细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartate protease 3,Caspase3)、Jun二聚化蛋白2(Jun dimerization protein 2,JDP2)、分泌性磷蛋白 1(secretory phosphoprotein 1,SPP1)的蛋白表达。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组孕妇血清激素水平比较

自然流产组孕妇血清β-HCG、孕酮、雌激素水平明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组孕妇血清激素水平比较

2.2 两组孕妇血清及绒毛膜POF1B蛋白表达比较

自然流产组孕妇血清及绒毛膜POF1B蛋白表达明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组孕妇血清及绒毛膜POF1B蛋白表达比较

2.3 相关性分析

Pearson相关性分析显示,血清及绒毛膜POF1B与β-HCG、孕酮、雌激素均呈明显负相关(P<0.05),见表3。

表3 血清及绒毛膜POF1B与激素的相关性分析

2.4 POF1B过表达对人绒毛膜滋养层细胞凋亡及Caspase3蛋白表达的影响

POF1B过表达组凋亡细胞比例、Caspase3蛋白表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表4、图1。

图1 Western blot检测Caspase3蛋白表达情况

表4 两组细胞凋亡及Caspase3蛋白表达情况

2.5 POF1B过表达对人绒毛膜滋养层细胞增殖的影响

0 h时,两组细胞的相对数量比较差异无统计学意义(P>0.05)。12、24、48 h时,POF1B过表达组细胞的相对数量明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表5。

表5 两组细胞相对数量比较

2.6 POF1B过表达影响人绒毛膜滋养层细胞生物学行为的相关机制分析

POF1B过表达组细胞JDP2、SPP1蛋白表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表6、图2。

图2 Western blot检测JDP2、SPP1蛋白表达情况

表6 两组细胞JDP2、SPP1蛋白表达比较

3 讨 论

自然流产是妊娠结局失败较为常见的类型,是妇产科尚未解决的问题[8-9]。目前自然流产发生机制尚不明确,但多数研究认为自然流产的发生与内分泌、遗传、免疫、凝血、感染等多因素密切相关,相关调控基因可参与自然流产的发生[10-11]。刘彩等[12]研究认为,子宫蜕膜组织中免疫调控蛋白FOXO3的高表达可提高脾脏CD4+CD25+T细胞比例,调节小鼠的免疫平衡,从而能降低胚胎吸收率,减少自然流产发生风险。此外,非特异性基因、非编码RNA的表达也可能参与自然流产的发生。

POF1B是位于性染色体的基因之一,POF1B主要在极化上皮组织中表达,POF1B的异常表达与皮肤鳞状细胞癌、肺腺癌等恶性肿瘤的发生、发展过程密切相关,可能成为潜在的治疗靶点或生物标志物。原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)是由卵巢中的卵泡耗尽决定的,这会导致40岁之前的不孕症,具有很强的家族性和异质性遗传背景。既往研究发现,POF1B基因与综合征性POI有关,可能参与卵巢发育和卵母细胞减数分裂/DNA修复途径等[13]。YUAN等[14]研究认为,POF1B与POF存在一定联系。本研究显示,自然流产组孕妇血清及绒毛膜POF1B蛋白表达明显高于正常对照组,说明POF1B的异常表达与自然流产存在一定联系。激素是内分泌细胞合成并分泌进入血液循环的化学信息物质,妊娠相关激素水平变化与维持妊娠过程及自然流产的发生、发展密切相关[15-16]。Pearson相关性分析显示,血清、绒毛膜POF1B与β-HCG、孕酮、雌激素均呈明显负相关。说明POF1B与妊娠相关激素水平变化密切相关,可能协同或相互介导参与自然流产的发生。

早期研究认为,细胞增殖、迁移及凋亡均在胚胎发育阶段发挥重要作用,其中胎盘滋养细胞增殖、凋亡的动态平衡决定着胎盘发育及胎儿生长情况,若动态平衡被打破可出现流产情况[17-18]。POF1B是目前发现仅存在脊椎动物表达的新型基因,可介导POI及POF的发生。本研究进行细胞实验发现,POF1B过表达组凋亡细胞比例明显高于对照组。12、24、48 h时,POF1B过表达组细胞的相对数量明显低于对照组。说明POF1B可介导胎盘滋养细胞增殖、凋亡的平衡紊乱导致自然流产的发生。SPP1是一种子宫内膜蛋白,可通过介导局限性粘连的组装决定子宫内膜的容受性[19-20],早期研究发现,SPP1可通过调控巨噬细胞功能参与不明原因反复流产的发生[21-22]。乌吉斯古楞等[23]研究认为,SPP1可通过介导周期素D1、P-糖蛋白、细胞色素c依赖性半胱氨酸蛋白酶3等参与胰腺癌细胞增殖、细胞周期及凋亡等生物学行为改变。JDP2是一种广泛分布于小脑、睾丸、肺等器官的蛋白,可调控细胞增殖、凋亡等行为[24-25],既往研究发现,过表达JDP2可进一步促进创伤性脑损伤诱导的炎症、细胞凋亡和Caspase3激活,JDP2 敲除通过阻断Caspase3激活,在体内和体外有效减轻创伤性脑损伤[26]。本研究发现,POF1B过表达组细胞JDP2、SPP1、Caspase3蛋白表达均明显高于对照组。说明POF1B可通过介导JDP2/SPP1调控凋亡蛋白的表达参与滋养层细胞的凋亡及增殖过程,POF1B可能是参与自然流产的新型基因。

综上所述,POF1B在自然流产孕妇血清及绒毛膜中高表达,与孕妇相关激素呈负相关,可参与人绒毛膜滋养层细胞增殖、凋亡等生物学行为,其机制可能与POF1B调控JDP2、SPP1蛋白表达有关。但由于本研究时间较短,尚未分析POF1B是否存在参与自然流产的多途径调控方式,未来将扩大实验对象、增加实验时间以此方向进行深入探究,为早期预测自然流产的发生并指导预防治疗提供一种新思路。